新型醛基化海藻酸鈉-肝素復合涂層的制備及性能評價

高文卿 李 彤 于美麗 段大為 胡曉旻 周淑芬 李 鑫 劉 東(天津市第三中心醫(yī)院，天津 0070)

2 (天津醫(yī)科大學研究生院，天津 300070)

3(天津市人工細胞重點實驗室，天津 300170)

引言

醫(yī)學技術的發(fā)展推動了生物醫(yī)學材料的研究和應用，如體外循環(huán)技術、透析技術及血濾技術的發(fā)展，急需相關生物醫(yī)學材料的開發(fā)和應用，而有關生物醫(yī)學材料的應用面臨生物相容性及血液相容性兩大問題。與血液接觸的生物材料會激發(fā)宿主防御機制，特別是血液穩(wěn)定機制，從而級聯(lián)引起血栓和栓塞的發(fā)生，危及患者生命［1-3］。改善生物醫(yī)學材料的生物相容性有兩種思路:其一是研發(fā)一種惰性表面材料可以避免激發(fā)宿主防御反應;其二是研發(fā)活性生物表面材料，自然控制宿主防御反應。涂層技術通過對材料表面的預改性，從而改善了生物醫(yī)學材料表面的生物相容性和抗凝活性［4］，減輕術后的全身炎癥反應［5］。

目前生物醫(yī)學材料表面涂層原理可歸納為物理法和化學法［6］。物理法即通過機械包埋、分子鏈之間的纏繞和滲透、被有孔材料吸附等方式將涂層物固定到生物材料表面，從而達到將涂層物固定化的目的?；瘜W法即通過涂層物分子鏈上豐富的反應性官能基團，如磺酸基、氨基、羧基等與目標材料表面上相應的可反應基團進行反應，以離子鍵或以共價鍵的方式將之固定到生物材料表面［7-8］。本研究利用高碘酸氧化、重氮化處理和終點固定技術，提供了一種由多醛基海藻酸和重氮化處理后肝素組成的多糖分子片段復合涂層的制備方法。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

海藻酸鈉(A2158，Sigma)，高碘酸鈉(311448，Sigma-Alorich)，聚乙烯亞胺(PEI，181978，Alorich)，氰 基 硼 氫 化 鈉(71435，F(xiàn)luka analytical，Sigma-Alorich)，苯酚(國產(chǎn)分析純)，亞硝酸(S2252，Sigma-Alorich)聚氯乙烯管路(東莞科威醫(yī)療器械有限公司，中國)，人血清白蛋白(貝林CSL Behring GmbH，德國)，人纖維蛋白原(MW341000，CALBIOCHEM，EMD Chemicals，美國)，肝素鈉(150IU/mg，安徽金鑫生物，中國)。

紅外分光光度計(NICOLET 6700，Thermo，美國)，紫外分光光度計(UV -2800，日立，日本)，凝血自動分析儀(STA-R Evolution ?，Diagnostica Stago，法 國)，血 細 胞 分 析 儀 (ADVIA2120，SIEMENS，德國)，BCA 蛋白定量試劑盒(SK3021，上海生工，中國)，掃描電鏡(Phenom，F(xiàn)EI Company，美國)，表面接觸儀(OCA15EC，Dataphysics，德國)。

1.2 方法

1.2.1 涂層物的制備

1.2.1.1 肝素(LMNH)涂層物制備

將肝素鈉粉劑充分溶解于去離子水中，并加入亞硝酸鈉，在酸性環(huán)境下0℃反應2 h，后調(diào)定溶液pH 值至7.0 以中止反應，得到LMNH 溶液。7 000 Da 透析袋透析過夜后冷凍，利用低溫真空干燥機進行干燥，獲得LMNH 粉末。

1.2.1.2 海藻酸鈉(OSA)涂層物的制備［18］

將海藻酸鈉充分溶解于去離子水中，加入高碘酸鈉，常溫避光反應24 h，后于反應液中加入乙二醇終止反應。反應液中加入NaCl，混勻后緩慢倒入96%乙醇中，析出的沉淀物經(jīng)抽濾、干燥后，再次溶于去離子水中，3 500 Da 透析袋透析過夜后冷凍，低溫真空干燥后獲得OSA 粉末。

1.2.2 表面預處理及表面修飾

如圖1 所示，首先用H2SO4·K2MnO4溶液分別對聚氯乙烯管道進行酸化預處理，在材料表面形成羧基(—COOH)，與強陽性聚乙烯亞胺的氨基(—NH2)結合在材料表面，構建大量以氨基為主的“空間臂”，增加結合位點，然后與重氮化處理后肝素末端的醛基(—CHO)和氧化海藻酸鈉末端的醛基結合，制成共價鍵結合涂層材料。

圖1 預處理及表面修飾模式圖Fig．1 Pretreatment and surface modification

1.2.3 涂層表面形貌分析

涂層后聚氯乙烯管路充分干燥，樣品表面噴金，后掃描電鏡觀察涂層前后材料表面形貌變化。

1.2.4 涂層表面功能基團特性分析

涂層后聚氯乙烯管路充分干燥，剪開管路暴露內(nèi)表面，紅外掃描探頭直接檢測涂層管道表面功能基團。海藻酸鈉及肝素標準品紅外定性均采用溴化鉀壓片模式。檢測器DTGs KBr，分束器KBr，波長范圍650 ～4 000 nm。

1.2.5 表面涂層物密度的檢測

1.2.5.1 肝素固定密度的測定

采用甲苯胺藍定量方法，參照文獻［9］方法建立肝素濃度標準曲線。待測涂層材料分別剪成10 cm2小碎片，加入20 mL 試管中備用;試管內(nèi)依次加入2.5 mL 質量分數(shù)為0.02% 的甲苯胺藍溶液和2.5 mLPBS 溶液，震蕩混勻，室溫下反應50 min;后抽取反應液，利用紫外分光光度計測量630 nm 處Abs 值，并根據(jù)標準曲線推算涂層密度。

肝素涂層密度(μg/cm2)= 肝素測定濃度×5 mL/10 cm2

1.2.5.2 海藻酸鈉固定密度的測定

采用苯酚-硫酸法測定，參照文獻［10］方法建立海藻酸鈉濃度標準曲線。分別留取反應前后OSA 溶液，硫酸苯酚法處理后利用紫外分光光度計測量480 nm 處Abs 值，根據(jù)海藻酸鈉標準曲線，利用差值法計算等價于葡萄糖標準品的涂層密度

海藻酸鈉涂層密度(μg/cm2)= 2(反應前濃度-反應后濃度)/10 (1)

1.2.6 涂層表面親水性實驗

微量進樣器干燥后樣品表面滴加2 μL 純水，用動態(tài)接觸角測量儀記錄接觸角隨時間的變化，每個樣品每次測量5 個點，每點計量10 次取平均值。通過測定涂層前后材料表面接觸角的變化，來表征涂層的親水特性。實驗數(shù)據(jù)由SCA 202 軟件進行進一步分析。

1.2.7 涂層表面蛋白吸附實驗

涂層表面粘附蛋白的定量采用BCA 法，依據(jù)文獻［11］及BCA 試劑盒方法建立蛋白濃度標準曲線。將待測樣品剪成0.5 cm ×0.5 cm 碎片，加入24 孔培養(yǎng)板;配置0.2 mg/mL 人血清白蛋白(human plasma albumin，HAS)和人纖維蛋白原(human protein fibriogen，HPF)稀釋液;配置BCA 工作液;向放置待測樣品的培養(yǎng)孔中，分別加入1.5 mLHSA 和HPF 稀釋液，將材料完全浸沒，放入恒溫水箱中，37℃孵浴1 h;將孵育后蛋白液全部取出，加入離心管中震蕩混勻后待測;取100 μL 待測蛋白液，加入潔凈的離心小管中，同時加入BCA 工作液1 mL，再次震蕩混勻后，60℃恒溫孵浴30 min;利用紫外分光光度計測定孵浴后混合液在562 nm 波長處Abs 值，根據(jù)標準曲線，計算反應前后蛋白差值，即為材料表面蛋白粘附量。

1.2.8 涂層表面血液凝固時間

首先取健康志愿者新鮮全血20 mL，3 000 r/min 離心10 min，獲得貧血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP)，測定凝血功能APTT、TT、PT 和FT;然后分別取10 cm2不同涂層的材料，剪成約0.5 cm ×0.5 cm 碎片，置于24 孔培養(yǎng)板;每個涂層樣品孔中分別加入PPP 700 μL，37℃恒溫水箱孵育2 h;抽取孵育后血漿，加入離心管中震蕩混勻30 s，再次測定4 項凝血指標，計算每組樣品凝血時間差值。

1.2.9 涂層表面血小板粘附評價

1.2.9.1 血小板粘附量及粘附率評價

首先取健康志愿者新鮮全血20 mL，800 r/min離心10 min，獲取上層血漿即富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)，混勻后測定血小板數(shù)量(PLT1);然后分別取10 cm ×10 cm 不同涂層材料，剪成約0.5 cm ×0.5 cm 小塊，置于24 孔培養(yǎng)板中，用蒸餾水將樣品浸泡沖洗3 遍后自然干燥;每個樣品孔中分別加入750 μLPRP，37℃恒溫孵浴1 h;吸取孵育后PRP，震蕩混勻，再次測定孵育后后血小板水平(PLT2)。通過孵育前后血小板的計數(shù)變化計算樣品表面血小板粘附量及粘附率

粘附量=PLT1 -PLT2 (2)

粘附率=粘附量/PLT1 (3)

1.2.9.2 涂層表面血小板粘附的形態(tài)評價

將PRP 孵育后樣品用PBS 沖洗3 遍，加入3%戊二醛固定2 h;梯度乙醇依次(體積分數(shù)為50%，60%，70%，80%，90%，無水乙醇)浸泡15 min，對樣品進行逐級脫水;冷凍干燥機對脫水處理后樣品進行干燥，樣品表面噴金后掃描電鏡觀察材料表面的血小板粘附形態(tài)。

1.2.10 表面血栓形成

將待測10 cm ×10 cm 涂層樣品，真空干燥后稱量干重W1，然后適當修剪加入12 孔培養(yǎng)板中;抽取新鮮未抗凝全血，迅速加入至樣品孔中，浸沒材料;37℃恒溫孵浴60 min 后取出涂層樣品，PBS 沖洗3 遍，3%戊二醛固定，梯度乙醇處理后真空干燥，再次稱量干重樣品W2，計算孵育前后樣品干重差值

樣品材料表面血栓粘附率=(W2-W1)/W1(4)

1.2.11 實驗分組

根據(jù)涂層類型和涂層方式將實驗分4 組:空白對照組(C)、肝素涂層組(LMNH)、海藻酸鈉涂層組(OSA)及雙涂層組(OSA.LMNH)。

1.2.12 統(tǒng)計方法

采用SPSS17.0 軟件進行分析，所有定量資料用平均數(shù)± 標準差表示，用方差分析進行多組間比較，兩兩比較利用SNK-q 檢驗，統(tǒng)計學差異檢驗標準P ＜0.05。

2 結果

2.1 涂層表面形貌分析

涂層管路與未涂層管路相比，管路表面起伏的紋路略有變化，但管道表面均光滑。單涂層組與雙涂層組管路相比，管道表面無顯著變化。結果表明，涂層過程反應溫和，并沒有破壞PVC 管道表面的物理形貌。見圖2。

圖2 涂層表面形貌分析(×2000)。(a)C 組;(b)OSA 組;(c)LMNH 組;(d)OSA．LMNH 組Fig．2 Surface topography of coated-PVC(×2000)． (a)C;(b)OSA;(c)LMNH;(d)OSA．LMNH

2.2 涂層表面功能基團分析

如圖3 和圖4 所示，海藻酸鈉片段在IR 譜圖3 352 cm-1處出現(xiàn)了強而寬的(O-H)吸收峰，在1 026 cm-1處則為羥基的C-O 伸縮振動吸收峰;肝素片段在3 450 cm-1附近有特征吸收峰。結果證實通過氨化還原反應進行的表面修飾效果良好，多糖分子片段OSA 及LMNH 在管路表面固定確實。

圖3 涂層表面肝素紅外譜圖Fig． 3 IR spectrum of heparin coated on the PVC surface

2.3 表面涂層物密度

2.3.1 肝素定量標準曲線

甲苯胺藍定量方法所得肝素定量標準曲線y =-0.037 9x +2.090 9(R2=0.996 5)。

2.3.2 肝素涂層密度

LMNH、OSA. LMNH 組與C 組相比，肝素固定密度有顯著差異(P ＜0. 05);LMNH 組和LMNH.OSA 組相比，肝素固定量無顯著差異(P ＞0. 05)，見表1。

2.3.3 海藻酸鈉定量標準曲線苯酚-硫酸法海藻酸鈉定量標準曲y =12.955x -0.009 5(R2=0.994 2)。

圖4 涂層表面海藻酸鈉紅外譜圖Fig．4 IR spectrum of sodium alginate coated on the PVC surface

2.3.4 涂層表面海藻酸鈉密度

OAS 涂層組、OSA. LMNH 涂層組與C 組相比，海藻酸鈉固定量有顯著差異(P ＜0.05)，OSA 涂層組與OSA.LMNH 涂層組相比海藻酸鈉固定量無顯著差異(P ＞0.05)，見表1。

2.4 涂層表面生物相容性評價

2.4.1 涂層表面親水性評價

表面接觸角結果提示，OSA 涂層組及OSA.LMNH 涂層組表面接觸角明顯減小，與C 組相比均有顯著差異(P ＜0.05);OSA 涂層組、OSA. LMNH涂層組與LMNH 組相比，表面接觸角均有顯著減小(P ＜0.05)。LMNH 涂層組與C 組相比，表面接觸角無顯著差異(P ＞0.05)。見圖5 和表2。組相比，HAS 及HPF 吸附量均無顯著差異(P =0.78，0.16)。OSA 組、OSA. LMNH 組與LMNH 組相比，HAS 及HPF 吸附量均顯著減少(P = 0.00)。OSA 組與OSA. LMNH 組相比，HAS 及HPF 粘附量無顯著差異(P =0.04，0.40)。見表3。

表1 各組樣管肝素及海藻酸涂層量Tab．1 LMNH and OSA density of different groups

圖5 各組管道表面接觸角。(a)C 組;(b)OSA 組;(c)LMNH 組;(d)OSA．LMNH 組Fig．5 Surface contact angle of different groups． (a)C;(b)OSA;(c)LMNH;(d)OSA．LMNH

表2 不同涂層管道表面接觸角Tab．2 Surface contact angle of different coating groups

2.4.2 涂層表面蛋白吸附實驗

2.4.2.1 BCA 法蛋白濃度測定

標準曲線如下:y = 0.002 2x + 0.131 6 (R2=0.993 5)

2.4.2.2 HSA 及HPF 蛋白吸附定量結果

OSA 組、OSA. LMNH 組 與C 組 相 比，HAS 及HPF 吸附量均顯著減少(P = 0.00);LMNH 組與C

表3 不同涂層管道表面蛋白吸附量Tab．3 Protein adsorption of different coating groups

2.5 涂層表面抗凝活性評價

2.5.1 涂層表面凝血功能檢測

LMNH 組、OSA.LMNH 組與C 組相比，APTT 及TT 時間均明顯延長，有顯著差異(P =0.00);OSA 組與C 組相比，APTT 時間顯著延長(P =0.00)，TT 時間無顯著延長(P = 0.47);LMNH 組與OSA 組、OSA.LMNH 組相比，APTT 時間均有有顯著延長(P=0.00，0.00);OSA 組與OSA. LMNH 組相比，APTT及TT 時間均無顯著差異(P =0.03，0.04)。見表4。

2.5.2 涂層表面血小板粘附

OSA 組、LMNH 組及OSA. LMNH 組與C 組相比，血小板粘附量及粘附率均顯著減少(P ＜0.05);LMNH 組與OSA 組相比，血小板粘附量及粘附率無顯著差異(P =0.03);LMNH 組與OSA. LMNH 組相比，血小板粘附量及粘附率無顯著差異(P =0.51);OSA 組與OSA.LMNH 組相比，血小板粘附量及粘附率均無顯著差異(P =0.09)。見表5 和圖6。

表4 不同涂層管路凝血功能測定Tab．4 Coagulation function of different coating groups

表5 不同涂層管路血小板粘附(×109)Tab．5 Platelet adhesion of different coating groups (×109)

圖6 不同涂層管路表面血小板粘附。(a)C 組;(b)OSA 組;(c)LMNH 組;(d)OSA．LMNH 組Fig．6 Platelet adhesion of different groups． (a)C;(b)OSA;(c)LMNH;(d)OSA．LMNH

2.5.3 涂層表面血栓形成

3 種涂層組與C 相比，血栓粘附率均顯著減少(P ＜0.05);OSA 組與LMNH 組相比，血栓粘附量及粘附率均無顯著差別(P = 0.14，0.20);OSA 組與OSA.LMNH 組相比，血栓粘附量及粘附率均無顯著差異(P =0.31，0.85);LMNH 組與OSA. LMNH 組相比，血栓粘附量及粘附率均無顯著差異(P =0.61，0.25)。見表6。由圖7 可見，C 組血栓形成明顯，紅細胞、白細胞及血小板鑲嵌于纖維蛋白網(wǎng)格中;3 種涂層組血栓形成均明顯減少，無明顯纖維蛋白網(wǎng)分布，OSA 組及LMNH 組血細胞呈團塊狀分布，OSA.LMNH 組僅有較小的血細胞團塊形成。

圖7 不同組別材料表面血栓形成。(a)C 組;(b)OSA 組;(c)LMNH 組;(d)OSA．LMNH 組Fig．7 Surface thrombosis of different coating surface． (a)C;(b)OSA;(c)LMNH;(d)OSA．LMNH

表6 不同組別血栓形成情況Tab．6 Thrombosis of different coating groups

3 討論

體外循環(huán)技術、透析技術及血濾技術的發(fā)展，使各種生物醫(yī)學材料應用日益廣泛，生物醫(yī)學材料應用面臨生物相容性及血液相容性兩大問題［12］，與血液接觸的生物材料會激發(fā)宿主防御機制，特別是血液穩(wěn)定機制，從而級聯(lián)引起血栓和栓塞的發(fā)生，危及患者生命。涂層技術通過對材料表面的預改性，從而改善了生物醫(yī)學材料表面的生物相容性和血液相容性［6］。研究表明，只要在某種程度上能抑制或阻止凝血因子的激活、血小板黏附與聚集、紅細胞黏附和補體系統(tǒng)激活這4 種凝血途徑中的某種或幾種凝血途徑發(fā)生的材料都具有抗凝血性能。設計醫(yī)用涂層材料原則包括阻抗蛋白質吸附、減少血小板的黏附和聚集、抑制內(nèi)源性凝血因子的活化、抑制血栓形成、促進材料偽內(nèi)膜化等。肝素屬于酸性粘多糖，它可以和生物體內(nèi)的多種凝血抑制因子相互作用，通過加速或提高這些抑制因子的抗凝活性來達到抗凝血的目的。其中肝素對抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)的作用最重要［13，19］。肝素抗凝效果優(yōu)良，但臨床應用途徑多為靜脈注射，出血及血小板減少等副作用較大［14］，且不能達到持續(xù)抗凝的目的。同時有研究表明［15］，肝素涂層生物相容性較差，并不能有效減少蛋白粘附。海藻酸鈉屬于聚陰離子大分子多糖，天然無毒，具有優(yōu)良的生物相容性和一定的抗凝效果［16-17，19］。設計并制備肝素及海藻酸鈉復合涂層能有效的改善醫(yī)學材料表面的生物相容性和血液相容性。

實驗結果顯示，化學表面預修飾及終點固定法，可以使OSA 及LMNH 涂層物有效固定到體外循環(huán)PVC 材料表面。定量實驗顯示，OSA. LMNH 復合涂層與OSA 及LMNH 兩種單涂層相比，海藻酸及肝素涂層密度無顯著差異，提示復合涂層對OSA 及LMNH 的有效固定并無影響。生物相容性評價中，OSA.LMNH 組、OSA 組與LMNH 組相比，表面接觸角均顯著減小，提示海藻酸鈉涂層物可顯著改善PVC 循環(huán)管路表面的親水性，LMNH 涂層物對親水性的改善無顯著作用，多糖復合涂層對海藻酸鈉改善親水性能的作用無顯著影響。同樣的變化趨勢表現(xiàn)在蛋白吸附實驗結果中，OSA 涂層物可明顯減少PVC 管路表面蛋白吸附量，LMNH 涂層物并不能改善PVC 管路表面蛋白吸附情況，多糖復合涂層物保有減少蛋白吸附的作用。

在血液相容性評價部分，LMNH 涂層物通過阻斷內(nèi)源性凝血途徑可顯著延長凝血時間，具有顯著抗凝效果，表現(xiàn)為APTT 及TT 時間延長。OSA 涂層物可延長APTT 時間，具有一定的抗凝效果。OSA.LMNH 復合涂層物抗凝效果雖劣于LMNH 單涂層物，但同樣可顯著延長APTT 及TT 時間，具有較好的抗凝效果。多糖復合涂層通過阻斷內(nèi)源性凝血途徑保持了良好的抗凝功效。海藻酸鈉及肝素大分子片段化并沒有改變它們的抗凝特性。血小板粘附方面，OSA.LMNH 復合涂層和LMNH 涂層物一樣具有減少血小板粘附的功效，改善了空白PVC 管的血液相容性，有效預防了進一步的血栓形成。血栓形成方面，OSA.LMNH 復合涂層可顯著減少血栓形成。

4 結論

LMNH 涂層物抗凝效果優(yōu)良，但生物相容性和抗蛋白粘附效果較差。OSA 涂層物生物相容性好并具有一定的抗凝效果。OSA. LMNH 涂層物既可改善PVC 管路的生物相容性，又具備雙重抗凝效果。OSA. LMNH 復合涂層物兼具生物相容性好和血液相容性好的優(yōu)點。

［1］ RApostolakis EE，Koletsis EN，Baikoussis NG，et al. Strategies to prevent intraoperative lung injury during cardiopulmonary bypass［J］. J Cardiothorac Sury，2010，11(5):1.

［2］ Suzuki Y， Daitoku K， Minakawa M， et al． Poly-2-methoxyethylacrylate-coated bypass circuits reduce activation of coagulation system and inflammatory response in congenital cardiac surgery［J］. J Artif Organs，2008，11(3):111 -116.

［3］ Finne-Wistrand A，Albertsson AC，Kwon OH，et al. Resorbable scaffolds from three different techniques:electrospun fabrics，salt-leaching porous films， and smooth flat surfaces ［J］.Macromol Biosci，2008，8(10):951 -959.

［4］ Sperling C， Houska M， Brynda E， et al. In vitro hemocompatibility of albumin-heparin multilayer coatings on polyethersulfone prepared by the layer-by-layer technique［J］. J Biomed Mater Res，2006，76(4):681 -689.

［5］ WeberN，Wendel P，Ziemer G. Hemocompatibility of heparincoated surfaces and the role of selective plasma protein adsorption［J］. Biomaterials，2002，23(2):429 -439.

［6］ 柏淑穎，朱德明，王偉. 涂層技術在體外循環(huán)裝置中的應用及意義［J］. 中國體外循環(huán)雜志，2009，7(2):124 -128.

［7］ Larm O，Larsson R，Olsson P. A new non-thrombogenic surface prepared by selective covalent binding of heparin via a modified reducing terminal residue［J］. Biomater Med Devices Artif Organs，1983，11(2 -3):161 -234.

［8］ Andersson LO，Hoffman J，et al． Mechanisms of anticoagulant effects of some sulphated polysaccharides［J］. Thromb Res，1982，28(6):741 -748.

［9］ Smith PK，Mallia AK，Hermanson GT. Colorimetric method for the assay of heparin content in immobilized heparin preparations［J］. Analytical Biochemistry，1980，109(2):466 -473.

［10］ Dubois M，Gilles KA，Hamilton JK，et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］. Analytical Chemistry，1956，28(3):350 -356.

［11］ Ishihara K，F(xiàn)ukumoto K，Iwasaki Y，et al. Modification of polysulfone with phospholipid polymer for improvement of the blood compatibility. Part 1. Surface characterization ［J］.Biomaterials 1999，20(17):1545 –1551.

［12］ Gunaydin S. Clinical significance of coated extracorporeal circuits:a review of novel technologies［J］.Perfusion，2004，19(1):33 -41.

［13］ Petitou M，Barzu T，Herault JP et al. A unique trisaccharide sequence in heparin mediates the early step of antithrombin IIactivation［J］.Glycobiology，1997，7(3):323 -327.

［14］ Santerre JP，Woodhouse K，Laroche G，et al. Understanding the biodegradation of polyurethanes:from classical implants to tissue engineering materials［J］. Biomaterials，2005，26(35):7457 -7470.

［15］ Jeffrey FW，Wielders SJ，Willems GM，et al. Thrombogenicity of polysaccharide-coated surfaces［J］. Biomaterials，2003，24(11):1917 -1924.

［16］ Nishino T， Yokoyama G， Dobashi K， et al. Isolation，purification，and characterization of fucose-containing sulfated polysaccharides from the brown seaweed Ecklonia kurome and their blood-anticoagulant activities［J］. Carbohydr Res，1989，186(1):119 -148.

［17］ Manju S，Muraleedharan CV. Evaluation of alginate dialdehyde cross-linked gelatin hydrogel as a biodegradable sealant for polyester vascular graft［J］. J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2011 ，98(1):139 -188.

［18］ 王琴梅，張亦霞，李卓萍，等. 多醛基海藻酸鈉交聯(lián)劑的制備及性能［J］. 應用化學，2010，27(2):155 -158.

［19］ Bouhadir KH，Lee KY，Alsberg E，et al. Degradation of partially oxidized alginate and its potential application for tissue engineering［J］. Biotechnol Prog，2001 ，17(5):945 -995.