蓮籽通心粉中蓮心總堿的大孔樹脂純化工藝研究

蓮籽通心粉中蓮心總堿的大孔樹脂純化工藝研究

李露1，2，薛淑靜1，2，周明1，2，何建軍1，2，關(guān)健1，2，張凌霄3，楊德1，2，郭鵬1，2
（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，武漢，430064；2.湖北農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)分中心；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院）

選用乙醇二次回流法粗提蓮籽通心粉中的蓮心總堿，粗提物通過大孔樹脂柱層析的吸附與洗脫進一步分離純化。通過研究得出，D101大孔樹脂較適宜進行蓮心總堿的純化，其最佳的吸附條件為:上樣液濃度10.00 mg/mL、pH值9、體積30 mL（0.43 BV）、流速1 mL/min，此工藝得到最大吸附量為9.55 mg/g；其最佳的洗脫條件為:乙醇濃度70%、pH值2、體積4 BV、流速1.4 mL/min，洗脫率達89.93%，經(jīng)純化后最終得率為64.39%。

蓮籽通心粉；蓮心總堿；大孔樹脂；純化

蓮籽是睡蓮科水生草本植物蓮的種子。我國蓮籽資源豐富，除青海、西藏外，我國大部分地區(qū)均有出產(chǎn)[1]，近10 a來，蓮籽生產(chǎn)的發(fā)展速度很快，僅湖北2006年蓮籽產(chǎn)量就達到29 690 t（干品）。2011年湖北省蓮籽總種植面積達到4萬hm2。

蓮籽的加工一般要經(jīng)過干燥、分級、去殼、除皮去心等工序，蓮籽心被直接扔掉，造成了資源的極大浪費和環(huán)境污染。因此開發(fā)利用蓮籽副產(chǎn)品，對提高蓮籽的經(jīng)濟效益、充分利用資源和保護環(huán)境都有著重要的實際意義[2]。

副產(chǎn)物蓮籽通心粉的主要成分是蓮籽心。蓮籽心具有清心理氣火、固精血之功效。蓮籽心中主要 含 有 蓮 心 堿 （Liensinine）、 異 蓮 心 堿（Isoliensinine）、甲基蓮心堿（Neferine）等生物堿，這3種同屬雙芐基異喹啉類生蓮心堿系[3～5]。研究表明，蓮心堿有降壓、防治心律失常和心肌缺血的作用[6]，蓮心堿具有很高的醫(yī)療價值和較強的抗氧化性能，已成為現(xiàn)代中醫(yī)藥研究的熱點之一，臨床應(yīng)用前景廣闊[7]。從蓮籽通心粉中提取蓮籽堿具有資源廉價豐富和環(huán)保的優(yōu)點。本研究選用乙醇二次回流法粗提蓮籽通心粉中的蓮心總堿，通過考察上樣液的濃度、體積、pH值以及優(yōu)化洗脫液濃度、體積、pH值，確定了較佳的大孔樹脂柱純化蓮心堿的工藝，為從蓮籽加工副產(chǎn)物通心粉中提取蓮心堿的工業(yè)化加工奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蓮籽通心粉由湖北省洪湖晨光實業(yè)有限公司提供；原料預(yù)處理，10目篩初篩，初篩物于55℃烘干，粉碎，過40目篩，待用。

1.2 試驗方法

①蓮心總堿的含量測定a.標準曲線的制備。準確稱取甲基蓮心堿標準品粉末5 mg，于5 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶解并定容至刻度、搖勻。分別吸取0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mL于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸定容至刻度，然后分別于282 nm波長處測定吸光度。以0.1 mol/L鹽酸為空白參比，以吸光度（A）為縱坐標，甲基蓮心堿的溶度（C）為橫坐標（C），繪制標準曲線（見圖1）。

圖1 甲基蓮心堿標準曲線

b.蓮心總堿含量的測定。準確稱取粗提蓮心堿凍干品黃色粉末0.1 g于100 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶解并定容、搖勻。各取定容液1 mL于10 mL量瓶，用0.1 mol/L鹽酸溶解并定容至刻度、搖勻，備用。以0.1 mol/L鹽酸為空白參比，于282 nm波長處測定吸收度，換算得到生物總堿濃度，再根據(jù)下式計算樣品中蓮心總堿的含量：

②蓮心生物堿的提取 稱取一定量預(yù)處理的原料，置于圓底燒瓶中，分2次進行乙醇回流提取，第一次用與原料質(zhì)量比為10:1的90%乙醇，在60℃下回流提取60 min，抽濾收集提取液；再加入與第一次提取同樣體積的90%乙醇溶液進行第二次提取，時間為45 min，將2次提取液合并儲存，備用，即得蓮心生物堿提取液[8]。將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇，移入分液漏斗，靜置兩晝夜分層分離。將分離物冷凍干燥為粗提蓮心堿固體粉末，備用。

③大孔吸附樹脂的選擇 將0.1 g粗提蓮心堿定容到100 mL，調(diào)節(jié)pH值為10；分別稱取預(yù)處理過的大孔吸附樹脂D101和AB-8各1 g，并置于100 mL錐形瓶中，再加入上述溶液20 mL，在室溫下靜置24 h，取下清液測定其中總生物堿含量，計算各樹脂的靜態(tài)吸附量。通過比較2種樹脂的比吸附量，選擇合適的樹脂。

④樹脂吸附條件優(yōu)化試驗a.上樣液濃度對吸附效果的影響。稱取經(jīng)預(yù)處理的D101干樹脂22 g，濕法裝柱，將粗提蓮心堿凍干品配成濃度2.5、4.5、5.5、7.5、10.0、12.5 mg/mL的上樣液。取pH值為10的上樣液體積30 mL（0.425 BV），用恒流泵以1 mL/min流速上柱從樹脂上方流下，收集流出液；靜置2 h，使用超純水水洗除雜至紫外檢測儀數(shù)顯值在A≤0.080，并收集水洗液。用紫外可見分光光度計在282 nm處測定吸光度，根據(jù)公式（2）得到D101吸附樹脂對蓮心總堿的比吸附量。

b.上樣液的體積對吸附效果的影響。稱取經(jīng)預(yù)處理的D101干樹脂22 g，濕法裝柱。上樣液的濃度選取1.2④a中最佳濃度，按10、20、30、40、50、60、70 mL的梯度體積，逐次將10 mL上樣液加入層吸柱，以1 mL/min流速從樹脂上方流下，同時以每10 mL收集流出液，同1.2①b的方法計算得到D101吸附樹脂的上樣流出液中蓮心總堿含量，確定動態(tài)吸附上樣體積的泄漏點。

c.上樣液pH值對吸附效果的影響。稱取經(jīng)預(yù)處理的D101干樹脂22 g，濕法裝柱，將上樣液pH值調(diào)節(jié)為8、9、10、11、12，上樣液的濃度和體積值選取1.2④a和1.2④b中的最優(yōu)值，體積30 mL，以1 mL/min流速上樣，收集流出液；靜置2 h，使用超純水水洗除雜至紫外檢測儀數(shù)顯值在A≤0.080，并收集水洗液。同1.2④a的方法計算得到D101吸附樹脂的比吸附量。

⑤樹脂洗脫優(yōu)化試驗a.洗脫劑濃度對洗脫效果的影響。稱取經(jīng)預(yù)處理的D101干樹脂22 g，濕法裝柱。上樣液依據(jù)1.2④得出最佳條件進行，收集流出液和水洗液，用紫外可見分光光度計在282 nm處測定吸光度，計算得到D101吸附樹脂對蓮心總堿的吸附量。然后分別將0、10%、15%、30%、70%、90%的乙醇溶液，在pH值3、體積2.5 BV（175 mL）、流速為1.4 mL/min條件下進行洗脫，收集洗脫液，并用紫外可見分光光度計在282 nm處測定吸光度，根據(jù)公式（3）計算得到D101大孔樹脂洗脫率。洗脫劑洗脫率的計算公式為：

b.洗脫劑用量對洗脫效果的影響。前期處理同1.2⑤a。設(shè)定洗脫液體積為1、2、3、4、5、6 BV，流速為1.4 mL/min，以1.2⑤a得出的最佳乙醇濃度，pH值3對樹脂進行洗脫，收集洗脫液，同1.2⑤a方法計算得到洗脫率。

c.洗脫劑pH值對洗脫效果的影響。前期處理同1.2⑤a。調(diào)制洗脫劑pH值為1、2、3、4、5的乙醇溶液，按1.2⑤a和1.2⑤b得出的最佳乙醇濃度、體積，在流速為1.4 mL/min條件下進行洗脫，收集洗脫液，同1.2⑤a方法計算得到洗脫率。

⑥最終提取率的計算 蓮心總堿最終得率是指蓮心總堿提取液經(jīng)過樹脂吸附與洗脫后得到的含量與未吸附與洗脫之前蓮心總堿含量的比值，計算公式為：

1.3 數(shù)值分析

本試驗中數(shù)據(jù)分析采用Excel 2007。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗提蓮心總堿含量的測定

取25 g蓮籽通心粉，經(jīng)乙醇二次回流法提取后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇，凍干，得到粗提蓮心堿淡黃色粉末4.01 g。蓮心堿淡黃色粉末粗提取率為16.04%。測定其吸光度，根據(jù)公式（2）和比爾定律換算成蓮心堿的含量為401.38 mg/g。

采用粗提蓮心堿粉末作為進一步分離純化的樣品。

2.2 大孔吸附樹脂的選擇

從表1可以看出，非極性樹脂D101對蓮籽心中的生物堿吸附優(yōu)于弱極性樹脂AB-8，證明非極性樹脂易于吸附脂溶性的生物堿類。所以選擇D101大孔樹脂裝層析柱進行下面的分離純化。

表1 大孔樹脂參數(shù)和靜態(tài)吸附容量的比較

2.3 樹脂吸附試驗

①上樣液濃度對吸附效果的影響 從圖2中可以看出，在動態(tài)吸附過程中，隨著上樣液濃度的增大，樹脂對生物堿的比吸附量隨之增大。這是吸附的推動力濃差隨上樣液濃度的增大而增加導(dǎo)致的結(jié)果。當濃度到達一定程度時，生物堿在吸附樹脂和溶劑中的分配系數(shù)會達到一個定值，此時的動態(tài)平衡稱之為吸附平衡。圖2中當上樣液濃度小于10.0 mg/mL時，吸附繼續(xù)進行。當濃度到達并且超過此平衡濃度時，由于濃差的作用力使樹脂上的部分蓮心生物堿被解吸，解吸下的分子在樹脂中留下的位置在動態(tài)的短時間內(nèi)來不及補上。因此，樹脂在吸附12.5 mg/mL上樣液中的生物堿時，導(dǎo)致吸附量略小于平衡濃度時的吸附量，因此最佳的上樣濃度即為吸附平衡時的濃度10.0 mg/mL。

圖2 上樣液濃度對吸附效果的影響

②上樣液的體積對吸附效果的影響 從圖3可以看到，當上樣液體積超過30 mL開始，上樣液流出液中的蓮心總堿含量開始明顯上升，即在上樣液為30 mL時，D101大孔樹脂柱出現(xiàn)了吸附泄漏點。說明濃度10 mg/mL的上樣液體積為30 mg/mL時，D101大孔樹脂脂吸附量達到飽和點即吸附平衡，此時吸附量最大，繼續(xù)增大上樣液量，上樣流出液中蓮心堿的含量繼續(xù)增大，而吸附量不再變化，導(dǎo)致物料的浪費。由此選擇上樣體積30 mL作為最佳條件進行上樣液pH值的考察條件。

③上樣液pH值對吸附效果的影響 由圖4可以看出，當pH值在8、9時，樹脂吸附量較大，pH值為9時吸附達量到最大值。pH值繼續(xù)增大，比吸附量隨之下降，不利于吸附。pH值為12時比吸附量降到最小。因此，選擇上樣液pH值9作為最佳條件，進行后續(xù)的洗脫試驗。

2.5 樹脂洗脫試驗

①洗脫劑濃度對洗脫效果的影響 由圖5可以看出，蓮心總堿主要集中在乙醇濃度為30%～70%部分。乙醇濃度越大，洗脫效果越明顯。乙醇濃度為15%～70%時，洗脫率明顯上升，乙醇濃度為70%時，洗脫率達到88.29%，繼續(xù)增加乙醇濃度，洗脫效果沒有明顯變化，說明洗脫接近平衡。因此選擇70%乙醇作為洗脫劑最佳的洗脫濃度。

蒸餾水和10%乙醇部分幾乎沒有生物堿成分被洗脫，且洗脫液中均有一定量的固形物存在，說明蒸餾水和10%乙醇洗脫部分可以除去水溶性雜質(zhì)。

②洗脫劑用量對洗脫效果的影響 從圖6中可以看出，當乙醇用量過小時，洗脫效率很低，洗脫率隨洗脫劑用量的增加而上升。而當洗脫劑用量達到4 BV時，洗脫率達83.80%，大部分蓮心總堿得以洗脫。當乙醇體積超過4 BV時，雖然洗脫率會因為洗脫劑用量而增長，但在洗脫的過程中，對較難從樹脂孔中解吸出的生物堿分子，洗脫率上升不明顯，洗脫效果不再增加，且增多了洗脫劑用量和時間的消耗。因此，選擇洗脫劑用量為4 BV作為最佳的洗脫劑體積。

③洗脫劑pH值對洗脫效果的影響 蓮心生物堿在酸性條件下，易從吸附樹脂上被乙醇洗脫，故選擇了酸性洗脫路線。如圖7所示，洗脫率隨著洗脫劑的pH值上升而下降。H+濃度不但中和了吸附環(huán)境中所需的堿，也使生物堿之中的親水氨基與其反應(yīng)而掙脫吸附力，使生物堿分子更易于溶入乙醇溶液中。在pH值為1時，洗脫率為93.49%，達到最高洗脫率；pH值為2時洗脫率也能達到89.93%，差異不明顯。但是在試驗中調(diào)制pH值為1的洗脫劑需要耗費大量的鹽酸，而且不利于樹脂柱的再次吸附和再生，因此，選擇pH值2作為洗脫條件。

圖3 上樣液的體積對吸附效果的影響

圖4 上樣液pH值對吸附效果的影響

圖5 乙醇濃度對洗脫效果的影響

3 結(jié)論

通過大孔樹脂對乙醇二次回流法提取的蓮心總堿進行了純化工藝優(yōu)化研究得出，D101大孔樹脂較適宜進行蓮心總堿的純化，其最佳的吸附條件為：上樣液濃度10.00 mg/mL、pH值9、體積30 mL（0.43 BV）、流速1 mL/min，此工藝得到最大吸附量為9.55 mg/g；其最佳的洗脫條件為：乙醇濃度70%、pH值2、體積4 BV、流速1.4 mL/min，洗脫率達89.93%，經(jīng)純化后根據(jù)公式（4）計算得出最終得率為64.39%。

圖6 洗脫劑體積對洗脫效果的影響

圖7 洗脫劑pH值對洗脫效果的影響

[1]謝綱，曾建國.蓮籽心的主要成分和藥理作用研究進展[C] //中華中醫(yī)藥學(xué)會第八屆中藥鑒定學(xué)術(shù)研討會，2007.

[2]徐虹，朱雨薇，曹楊，等.蓮籽紅皮多糖提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（2）：266-268.

[3]李娟，夏延斌.蓮心生物堿保健功能研究進展[J].糧食與油脂，2010（1）：40-43.

[4]陳怡，羅順德，宋金春，等.蓮籽心中酚性生物堿3種主要成分定量分析及其特征圖譜研究[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24（4）：205-208.

[5]張京梅，李鵬躍，王嵐，等.蓮籽心總生物堿的提取分離及藥效學(xué)初步研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2009，15（6）：26-28.

[6]羅順德，王輝.蓮心堿的研究概況和進展[J].中國藥房，2001，12（10）：624-625.

[7]張京梅，李鵬躍，王嵐，等.蓮籽心總生物堿的提取分離及藥效學(xué)初步研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2009，15（6）：26-28.

Extraction and Purification of Alkaloids from Lotus Plumule Powder with Macroporous Resin

LI Lu1,2,XUE Shujing1,2,ZHOU Ming1,2,HE Jianjun1,2,GUAN Jian1,2, ZHANG Lingxiao3,YANG De1,2,GUO Peng1,2

In the paper,we extracted the alkaloids from lotus plumule powder by using the ethanol refluxing method,and used column chromatography to separate and purify alkaloids extracts further.The results showed that,D101 macroporous resin was more appropriate for purifying the alkaloids,and the maximum adsorbing capacity 9.55 mg/g was achieved with the following conditions:sample concentration 10.0 mg/mL,pH value 9,volume 30 mL(0.43 BV)and flow rate 1 mL/min. The best elution conditions were as follows:the ethanol concentration was 70%,with the pH value of 2,volume of 4 BV and flow rate of 1.4 mL/min,and the desorption ratio was up to 89.93%,while the final yield of the purified alkaloids was 64.39%.

Lotus plumule powder;Alkaloids;Macroporous resin;Purification

TS235.9

：A

：1001-3547（2013）18-0194-05

10.3865/j.issn.1001-3547.2013.18.073

國家科技支撐課題:水生蔬菜保鮮與加工技術(shù)研究（2012BAD27B03），湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項目（2013-620-007-001），“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃——粗糧固態(tài)產(chǎn)品的輻照殺菌技術(shù)研究（2012BAD34B08-15）

李露（1962-），女，本科，高級工程師，研究方向為功能食品薛淑靜（1980-），女，通信作者，碩士，助理研究員，研究方向為食品科學(xué)，E-mail:xsj2000@163.com

2013-09-06