丹參酮Ⅱ-a磺酸鈉結(jié)合髓芯減壓打壓植骨治療犬股骨頭壞死的研究

李曉明，郭東輝，石國(guó)君，李瑞亮，張洪相，蘇長(zhǎng)生，沈潤(rùn)斌，王紅玉，李運(yùn)美，袁福祿，韓廣普

丹參酮Ⅱ-a磺酸鈉結(jié)合髓芯減壓打壓植骨治療犬股骨頭壞死的研究

李曉明1，郭東輝1，石國(guó)君1，李瑞亮1，張洪相1，蘇長(zhǎng)生2，沈潤(rùn)斌1，王紅玉1，李運(yùn)美1，袁福祿1，韓廣普1

目的：研究丹參酮Ⅱ-a磺酸鈉結(jié)合打壓植骨治療犬股骨頭壞死的療效。方法：以液氮冷凍法制作犬單側(cè)股骨頭缺血性壞死模型，隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組采用將浸泡過(guò)丹參酮Ⅱ-a磺酸鈉的松質(zhì)骨植入到股骨頭內(nèi)，對(duì)照組將松質(zhì)骨植入股骨頭內(nèi)，術(shù)后進(jìn)行X線攝片、標(biāo)本組織學(xué)及掃描電鏡檢查。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組股骨頭骨密度較術(shù)前增高，透光區(qū)較小，組織學(xué)顯示實(shí)驗(yàn)組骨空陷窩數(shù)和脂肪細(xì)胞直徑較對(duì)照組明顯改善（P＜0.05）。術(shù)后12周，掃描電鏡可見(jiàn)再生軟骨表面與正常透明軟骨極為相似，成骨細(xì)胞增殖活躍，骨細(xì)胞成圓形，核膜清晰，趨于成熟。結(jié)論：丹參酮Ⅱ-a磺酸鈉能改善股骨頭血供，促進(jìn)壞死骨的吸收、修復(fù)與重建。

股骨頭壞死；丹參酮；髓芯減壓；植骨；犬

丹參酮Ⅱ-a磺酸鈉(tanshinoneⅡ-a，TSN)是丹參酮Ⅱ-a經(jīng)磺化后的水溶性成分，為丹參的主要藥效成分。我們利用健康成年犬造模，采用浸泡有丹參酮Ⅱ-a磺酸鈉的自體松質(zhì)骨和同種異體骨的混合骨進(jìn)行打壓植骨，觀察治療股骨頭壞死的療效。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 12只健康成年犬，體質(zhì)量（12± 1.8）kg。以液氮冷凍法制作單側(cè)股骨頭缺血性壞死模型，側(cè)別隨機(jī)，相同飼養(yǎng)條件，飼養(yǎng)1個(gè)月。隨機(jī)將動(dòng)物分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組6只。

1.2 動(dòng)物模型制作 3%戊巴比妥鈉1 mL/kg靜脈注射麻醉，固定于特制手術(shù)臺(tái)。前肢淺靜脈建立輸液通道，給予5%葡萄糖注射液和0.9%氯化鈉注射液各500 mL，加入氨芐青霉素2.0 g。8%硫化鈉液脫毛，無(wú)菌操作下作髖關(guān)節(jié)外側(cè)切口，顯露出股骨頭和股骨頸。剪斷圓韌帶，剝離干凈股骨頸基底部軟組織和血管，脫出股骨頭頸。紗布保護(hù)周圍軟組織，浸透液氮的棉球濕敷股骨頭3 min，生理鹽水復(fù)溫。復(fù)位，逐層縫合。術(shù)后每只犬肌肉注射青霉素160萬(wàn)U持續(xù)1周。定期換藥，盡量讓狗站起活動(dòng)[1]。

1.3 手術(shù)方法 動(dòng)物造模4周后行X線檢查，觀察患側(cè)股骨頭部位變化，確證造模成功。實(shí)驗(yàn)組于股骨頭壞死側(cè)實(shí)行手術(shù)治療，原切口進(jìn)入，切開(kāi)關(guān)節(jié)囊，顯露股骨頸，于頸后部股骨頭軟骨緣下開(kāi)窗約5 mm×5 mm，并鑿一骨槽，深達(dá)頸中心部。自骨窗內(nèi)深入，徹底刮除壞死骨，達(dá)到軟骨內(nèi)面為度。另作一同側(cè)髂嵴部切口，長(zhǎng)約2 cm，鑿取一塊髂骨備用。根據(jù)股骨頭內(nèi)骨質(zhì)缺損情況而定，關(guān)閉此切口。將髂骨剪成約5 mm×5 mm×5 mm，浸泡于丹參酮Ⅱ-a磺酸鈉的液體中，浸泡10 min。對(duì)股骨頭進(jìn)行打壓植骨，再用一塊骨皮質(zhì)對(duì)開(kāi)窗部位進(jìn)行覆蓋封堵沖洗術(shù)野，關(guān)閉切口。

對(duì)照組同樣手術(shù)方法，鑿取髂骨后不浸泡丹參酮Ⅱ-a磺酸鈉液體，植入股骨頭內(nèi)。

1.4 觀察指標(biāo) X線：分別于實(shí)驗(yàn)前、造模4周后、植骨后6周及12周，攝髖關(guān)節(jié)前后位片，觀察股骨頭密度改變，了解股骨頭影像學(xué)改變。組織學(xué)觀察：于手術(shù)后8周、12周處死動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組每次3只。股骨頭取出后，沿縱軸切開(kāi)兩半，一半用電鏡觀察。另一半用10%福爾馬林固定標(biāo)本，乙酸脫鈣，常規(guī)制作石蠟切片，切片厚度6～8 μm。HE染色，光鏡觀察病理改變。掃描電鏡：另一半骨組織放入2.5%戊二醛固定4 h，磷酸緩沖液（pH7.2)沖洗3次，1%四氧化鋨固定1 h，磷酸緩沖液沖洗3次。梯度乙醇順序脫水，用乙酸異戊脂逐級(jí)替換樣品中的乙醇，臨界點(diǎn)干燥，噴金鍍膜。用電鏡觀察股骨頭超微結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)前X線片 各組股骨頭大小及形態(tài)正常，骨密度均勻一致。造模4周后股骨頭X線片，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組股骨頭形態(tài)基本正常，但股骨頭內(nèi)骨密度局限性減低，有大小不等的透亮區(qū)。植骨后6、12周見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組右側(cè)股骨頭內(nèi)的骨密度增高，透亮區(qū)有所縮小。對(duì)照組股骨頭內(nèi)骨密度及透亮區(qū)范圍較術(shù)前無(wú)明顯變化。

2.2 組織學(xué)檢查 實(shí)驗(yàn)組骨小梁部分碎裂，排列相對(duì)較整齊，骨小梁內(nèi)空缺的骨陷窩較對(duì)照組少，（P＜0.05），骨小梁表面可見(jiàn)成骨細(xì)胞單排排列，周圍有新生骨形成等修復(fù)的表現(xiàn)。髓腔內(nèi)血細(xì)胞增多，脂肪細(xì)胞較對(duì)照組少（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有明顯的毛細(xì)血管及間質(zhì)細(xì)胞增生。對(duì)照組股骨頭內(nèi)骨組織呈明顯的壞死征象，表現(xiàn)為骨小梁變細(xì)，斷裂，間距增大，骨細(xì)胞數(shù)減少，骨細(xì)胞核深染、固縮，空缺的骨陷窩數(shù)較多。髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞增大，血管數(shù)量較少。部分區(qū)域纖維化、結(jié)構(gòu)紊亂不整。見(jiàn)表1。

表1 股骨頭光鏡的結(jié)構(gòu)改變()

表1 股骨頭光鏡的結(jié)構(gòu)改變()

組別實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組脂肪細(xì)胞直徑7.2±0.45 15.2±0.95空陷窩數(shù)11±3.8 20±2.3

2.3 掃描電鏡檢查 手術(shù)后8周，表層組織內(nèi)有大量骨細(xì)胞，呈典型未成熟的骨細(xì)胞特征，細(xì)胞表面有豐富的微絨毛，胞核呈圓形，胞漿核清晰可見(jiàn)，核膜界限清楚，膠原纖維呈縱橫斜向排列，形成片狀，針狀的松質(zhì)骨。術(shù)后12周，可見(jiàn)再生軟骨表面與正常透明軟骨極為相似，呈縱橫交錯(cuò)，相互融合的蜂窩樣結(jié)構(gòu)，嵴間見(jiàn)微孔，表層纖維組織消失。成骨細(xì)胞增殖活躍，可見(jiàn)成熟的板層狀骨生成，新生血管結(jié)構(gòu)完好，骨細(xì)胞成圓形，核膜清晰，趨于成熟，骨細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生擴(kuò)張，線粒體發(fā)達(dá)，嵴結(jié)構(gòu)及嵴上顆粒清晰，成熟的骨細(xì)胞位于骨陷窩內(nèi)，有代謝活性高、細(xì)胞器發(fā)達(dá)的成骨細(xì)胞及成纖維細(xì)胞。

3 討論

股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head，ANFH)是由多種病因共同作用引起的股骨頭血液供應(yīng)破壞或骨細(xì)胞變性，進(jìn)而導(dǎo)致骨的有活力成分（骨細(xì)胞、骨髓造血細(xì)胞和脂肪細(xì)胞）死亡引起的復(fù)雜病理過(guò)程。青壯年多見(jiàn)，平均年齡在35歲左右。股骨頭一旦塌陷，大部分患者將不可避免的進(jìn)行關(guān)節(jié)置換術(shù)。股骨頭缺血性壞死的治療方法繁多，其治療關(guān)鍵是盡早發(fā)現(xiàn)，干預(yù)性治療，重建血供，防治股骨頭塌陷、變形。目前主要的治療方法包括股骨頭單純髓芯減壓術(shù)、髓芯減壓聯(lián)合骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)材料植入、骨移植術(shù)、截骨術(shù)、骨髓干細(xì)胞治療、多孔鉭棒和記憶合金網(wǎng)球置入術(shù)等，髓芯減壓打壓植骨治療股骨頭缺血性壞死是公認(rèn)行之有效的治療方法[2]，丹參治療股骨頭缺血性壞死國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)多有報(bào)道，我們采用浸泡有丹參酮Ⅱ-a磺酸鈉的自體松質(zhì)骨和同種異體骨的混合骨進(jìn)行打壓植骨，觀察治療股骨頭壞死的療效。今國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有應(yīng)用浸泡丹參酮Ⅱ-a磺酸鈉治療股骨頭壞死的相關(guān)研究。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，股骨頭缺血壞死的病因病機(jī)為腎精虧虛、氣血不足、筋骨失養(yǎng)或寒濕凝結(jié)阻礙氣血運(yùn)行，不通則痛，或是外傷、慢性損傷均可導(dǎo)致本病的發(fā)生，其中以腎虛、血瘀最為關(guān)鍵。股骨頭缺血性壞死的的早期以血瘀氣滯為重，血瘀不通則痛，表現(xiàn)為髖部疼痛為主要癥狀，故治療上應(yīng)以活血祛瘀為主，并輔以補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之品。

丹參性苦、微寒，歸心、肝經(jīng)，具有祛瘀止痛，活血通經(jīng)的功效。近代研究表明，丹參能改善微循環(huán)，增加局部血流量來(lái)改善局部缺血、缺氧，改善血瘀患者的學(xué)流變學(xué)特征，促進(jìn)組織的修復(fù)與再生。丹參酮ⅡA磺酸鈉，為丹參中分離的二萜醌類化合物丹參酮ⅡA，經(jīng)磺化而得到的水溶性物質(zhì)。為磚紅色結(jié)晶性粉末；無(wú)臭，味微苦；有引濕性；遇高熱、見(jiàn)光色漸變深。經(jīng)磺化成水溶性鈉鹽后更利用機(jī)體吸收。丹參酮Ⅱ-a磺酸鈉主要通過(guò)抑制各種生長(zhǎng)因子的表達(dá)，誘導(dǎo)血管內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞分化成熟和凋亡，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移、增殖，最終改善血管平滑肌的功能和狀態(tài)。丹參酮還有抗血栓，抑制凝血過(guò)程，促進(jìn)纖維蛋白溶解，改善微循環(huán)，使外周血流加速，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立的作用[3]。

鉆孔減壓通過(guò)使股骨頭、頸部與皮質(zhì)外形成交通，打通導(dǎo)致修復(fù)中斷的骨硬化帶，持續(xù)降低骨內(nèi)高壓狀態(tài)，改善壞死區(qū)骨內(nèi)循環(huán)，提高其自身修復(fù)能力。使壞死區(qū)迅速血管化、新生骨爬行替代，負(fù)重區(qū)的軟骨下骨和骨小梁拱橋結(jié)構(gòu)重建，股骨頭承載能力加強(qiáng)。可有效防止股骨頭塌陷，逆轉(zhuǎn)自然病程及病情發(fā)展。鉆孔后打斷部分閉塞的血管，促進(jìn)血管新生，使血液循環(huán)進(jìn)入，有利于骨的營(yíng)養(yǎng)和新生，同時(shí)使代謝產(chǎn)物及時(shí)排出[4]。丹參酮ⅡA硫磺鈉是丹參酮的一種合成制劑，改善缺血區(qū)組織的側(cè)支循環(huán)及局部供血，糾正缺血組織的代謝紊亂，提高組織耐缺氧能力，抑制血小板聚集及抗血栓形成，縮小缺血組織的壞死面積，促進(jìn)血液回流，有利于骨再生[5]。

本實(shí)驗(yàn)將丹參酮植入到標(biāo)準(zhǔn)股骨頭壞死動(dòng)物模型股骨頭內(nèi)，通過(guò)X線片、ECT掃描、光鏡及掃描電鏡等檢查，X線片可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組側(cè)股骨頭內(nèi)的骨密度增高，透亮區(qū)有所縮小，骨小梁部分碎裂，排列相對(duì)較整齊，骨小梁內(nèi)空缺的骨陷窩較對(duì)照組少，和對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。髓腔內(nèi)血細(xì)胞增多，脂肪細(xì)胞較對(duì)照組少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。掃描電鏡顯示再生軟骨表面與正常透明軟骨極為相似，呈縱橫交錯(cuò)，相互融合的蜂窩樣結(jié)構(gòu)，嵴間見(jiàn)微孔，表層纖維組織消失。說(shuō)明丹參酮能改善股骨頭血管，促進(jìn)壞死骨吸收，促進(jìn)骨修復(fù)與重建，可以達(dá)到活血化瘀促進(jìn)骨修復(fù)之目的，為治療股骨頭壞死提供了新的方法與思路[6]。

[1]顧曉峰，黎逢峰，范衛(wèi)民，等.液氮冷凍并血管破壞建立犬股骨頭缺血壞死塌陷模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006，26(12)：1224-1226.

[2]方志，陳曦，劉樹(shù)平.髓芯減壓結(jié)合自體皮質(zhì)支撐骨及松質(zhì)顆粒骨植骨治療成人股骨頭缺血性壞死[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2010，24(3)：266-269.

[3]謝詩(shī)涓，李健，熊鶯，等.丹參酮ⅡA對(duì)人股骨頭成骨細(xì)胞金屬蛋白酶表達(dá)的影響[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2012，18(08)：685-689.

[4]潘初，王敏，王仁法.股骨頭缺血性壞死介入治療研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].放射學(xué)實(shí)踐，2001，16(3)：156.

[5]王洪君，呂福慶.丹參酮ⅡA磺酸鈉治療肢體骨折及軟組織損傷所致腫脹的臨床研究[J].吉林醫(yī)學(xué)，2009，30(24):51.

[6]李曉明，郭東輝，石國(guó)君，等.髓芯減壓結(jié)合丹參酮Ⅱ-a治療早期股骨頭壞死療效分析[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘,2013，13(1)：74-75.

（收稿：2013-07-08 修回：2013-09-20）

（責(zé)任編輯 樸 哲）

Treatment of Canine Osteonecrosis of Femoral Head with Bone Impaction Grafting Soaked in Tanshi?noneⅡ-a

LI Xiao-ming，GUO Dong-hui，SHI Guo-jun et al. Hebei Cangzhou Hospital of Integrated Tradi?tional Chinese and Western Medicine,Cangzhou(061000),China

Objective: To analyze the efficiency of bone impaction grafting with TanshinoneⅡ-a in the treatment of Canine osteonecrosis of the femoral head.MethodsTwelve canine models were made with femo?ral head avascular necrosis induced by liquid nitrogen frozen,and were randomly divided into two groups.In theexperimental group cancellous bone soaked in Tanshi?noneⅡ-a was implanted into the femoral head,and in the control group cancellous bone was implanted only.X-ray,specimen histology and scanning elec?tron microscopy were done postoperativelyResultsIn the experimental group,the(bone mass density BMD)of the femoral head was higher.Light transmission area was smaller than the control group;bone histology showed in the experimental group,the number of empty lacunae and fat cell diameter was significantly improved as com?pared with the control group(P＜0.05).After twelve weeks,scanning electron microscopy showed that cartilage surface was very similar to normal hyaline cartilage and active proli-feration of osteoblasts,mature osteocytes were shown into a round,clear membrane.ConclusionTanshinoneⅡ-a can improve the blood supply of the femoral head and promote the absorption of necrotic bone repair and reconstruction.

Osteonecrosis;tanshinone;core decompression;graft;dog

Q95-33;R681.8

A

1007-6948(2013)06-0664-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2013.06.017

1.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨六科（滄州 061001）

2.河北省泊頭市人民醫(yī)院（泊頭 062150）

李曉明,E-mail：lixiaomingdoctor@163.com