紫甘薯汁抗腫瘤活性及誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡機(jī)制研究

陳永強(qiáng)，劉金娟，曹成亮，卞光凱，蔣繼宏*

(徐州師范大學(xué) 江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221116)

紫甘薯汁抗腫瘤活性及誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡機(jī)制研究

陳永強(qiáng)，劉金娟，曹成亮，卞光凱，蔣繼宏*

(徐州師范大學(xué) 江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221116)

目的：研究紫甘薯汁的抗腫瘤活性及其誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡機(jī)制。方法：采用Alamar Blue、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、掃描電鏡、瓊脂糖凝膠電泳、RT-PCR和Western blotting法檢測不同體積分?jǐn)?shù)的紫甘薯汁對SGC-7901、HO-8910和HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用及誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡機(jī)制研究。結(jié)果：與對照組相比，體積分?jǐn)?shù)5%和10%的紫甘薯汁對SGC-7901、HO-8910和HepG2細(xì)胞具有抑制作用，呈體積分?jǐn)?shù)依賴性；作用HepG2細(xì)胞48h后，能觀察到細(xì)胞皺縮和凋亡小體以及凋亡細(xì)胞典型的梯狀DNA條帶。RT-PCR和Western blotting法檢測結(jié)果顯示，紫甘薯汁可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中Fas、FADD、Caspase-3、Caspase-8和p53 mRNA表達(dá)水平上調(diào)和蛋白表達(dá)量增加，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性裂解片段明顯增高且Caspase-3酶活性顯著提高。結(jié)論：紫甘薯汁體外對腫瘤細(xì)胞的增殖具有一定抑制作用且通過細(xì)胞表面死亡受體途徑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，同時(shí)p53在此凋亡過程中也起著重要的作用。

紫甘薯；人肝癌細(xì)胞HepG2；抗腫瘤活性；細(xì)胞凋亡

甘薯是世界十大主要糧食作物之一，中國是最大的薯類生產(chǎn)國，約占世界薯類生產(chǎn)總量的65%[1]。而紫甘薯是甘薯的一個(gè)新品種，近年來對紫甘薯的研究主要集中于紫甘薯中的植物化學(xué)物質(zhì)如花色苷類[2]、酚類物質(zhì)(咖啡酸、綠原酸異構(gòu)體、咖啡酸甲酯和咖啡酸乙酯)[3-5]及多糖[6]等的研究分離純化及藥理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)它們具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂血糖、保肝的功效[7-10]。但長期以來人們并沒有把紫甘薯中這些植物化學(xué)物質(zhì)作為預(yù)防腫瘤的物質(zhì)來應(yīng)用，如果紫甘薯及其制品中的植物化學(xué)物質(zhì)在腫瘤的預(yù)防及抗腫瘤效果上存在一定的交互作用，則可以放棄高成本的提取植物化學(xué)物單體，而選擇一種加工簡單、經(jīng)濟(jì)方便、符合人們生活方式及飲食習(xí)慣的消費(fèi)產(chǎn)品，來滿足人們通過正確的膳食達(dá)到預(yù)防及治療腫瘤的需求。同時(shí)腫瘤是一種多基因疾病，與單體化合物治療效果相比，復(fù)合物可以針對多個(gè)基因或基因簇來抑制多個(gè)基因的表達(dá)，從而能更有效地抑制腫瘤生長。本實(shí)驗(yàn)選擇紫甘薯汁進(jìn)行抗腫瘤活性及其誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡機(jī)制研究，旨在為合理開發(fā)利用紫甘薯在腫瘤的預(yù)防及治療方面的作用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

肝癌細(xì)胞HepG2、人胃癌細(xì)胞SGC-7901和人宮頸癌細(xì)胞HO-8910 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；紫甘薯購自徐州易初蓮花超市，由徐州師范大學(xué)江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定。

Alamar Blue 美國Sigma公司；Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3、p53、Fas、FADD和GAPDH抗體美國Santa Cruz Biotechnology公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒、Western及IP細(xì)胞裂解液 碧云天生物技術(shù)研究所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 日本TaKaRa Shuzo公司；Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3、p53、Fas、FADD和GAPDH引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

IBE2000顯微鏡 韓國COIC公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 日本三洋公司；SpectroMax M2熒光檢測儀 美國Molecular Devices公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 美國Gibco公司；掃描電鏡 日本日立公司；熒光顯微鏡 德國萊卡公司；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀 美國伯樂公司。

1.2 紫甘薯汁的制備

紫甘薯汁的制備參照文獻(xiàn)[11]，將紫甘薯切成約1cmh1cmh1cm塊狀，然后采用家用榨汁機(jī)將其榨成汁液，用低溫離心機(jī)4℃、5000r/min離心10min，取上清液保藏于—20℃冰箱，備用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

采用Alamar Blue法檢測體外抗腫瘤細(xì)胞活性，具體實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[12]。

1.4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化

取形態(tài)均勻狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，用胰酶消化后以細(xì)胞數(shù)5h104個(gè)/mL 接種于6孔培養(yǎng)板中，24 h細(xì)胞貼壁后，加入不同體積分?jǐn)?shù)的紫甘薯汁培養(yǎng)48h后，用倒置相差顯微鏡觀察形態(tài)并拍照。

1.5 Hoechst 33258染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化

HepG2細(xì)胞經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)的紫甘薯汁處理48h后，將配制好的Hoechst 33258染液加入收集好的細(xì)胞懸液中，染液終質(zhì)量濃度為5μg/mL，染色10min，取10μL滴于蓋玻片上，熒光顯微鏡下觀察。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 掃描電鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化

經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)的紫甘薯汁處理48h后的HepG2細(xì)胞，用胰酶液消化并收集細(xì)胞，用3%的戊二醛固定液固定過夜，經(jīng)乙醇梯度脫水后進(jìn)行掃描電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并拍照。

1.7 DNA 瓊脂糖凝膠電泳

參照Herrmann等[13]的方法，略有改動。將紫甘薯汁處理組和對照組細(xì)胞分別收集于1.5mL離心管中，用PBS清洗2次，5000r/min離心5min；棄上清，向沉淀中加入50μL細(xì)胞裂解液28℃裂解30min，重復(fù)1次；裂解液每次用2000r/min 離心5min，將獲得的裂解上清液中加入RNaseA(0.5mg/mL)和1%的SDS，37℃處理2h；接著加入蛋白酶K(2mg/mL)，56℃處理2h；加入0.5倍體積的5mol/L乙酸銨，2.5倍體積的無水乙醇，—20℃過夜沉淀；然后再4℃、13000r/min離心20min棄上清液；最后用無水乙醇清洗1次，干燥，溶于TE緩沖液中，1.8%瓊脂糖凝膠電泳，40V、1.5h EB染色，紫外燈下觀察拍照。

1.8 RT-PCR檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)量變化

不同體積分?jǐn)?shù)紫甘薯汁處理HepG2細(xì)胞24h后，用TRIzol試劑提取總RNA，按TaKaRa RNA PCR試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。Caspase-3上下游引物分別是5’-ATGGAAGCGAATCAATGGAC-3’和5’-ATCACGCATCAATTCCACAA-3’，PCR產(chǎn)物為2 4 2 b p；C a s p a s e-8上下游引物分別是5’-A T G C A G G G G C T T T G A C C A C G A C-3’和5’-TCCCCCTGACAAGCCTGAATAAAA-3’，P C R產(chǎn)物為2 9 2 b p；C a s p a s e-9上下游引物分別是5’-G C G A A C T A A C A G G C A A G C A-3’和5’-CCAAATCCTCCAGAACCAAT-3’，PCR產(chǎn)物為144bp；FADD上下游引物分別是5’-AGATCGACAGCATCGAGGAC-3’和5’-CCACTCCTGTTCTGGAGGTC-3’，PCR產(chǎn)物為199bp；Fas上下游引物分別是5’-CTCCAAGGGATTGGAATTGA-3’和5’-GACAAAGCCACCCCAAGTTA-3’， PCR產(chǎn)物為443bp；p53上下游引物分別是5’-GAGCACTGCCCAACAACAC-3’和5’-ATGGCGGGAGGTAGACTGA-3’，PCR產(chǎn)物為2 5 1 b p；G A P D H上下游引物分別是5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3’和5’-CTGGAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，PCR產(chǎn)物為223bp。PCR反應(yīng)程序：94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照。

1.9 Western blotting 檢測蛋白質(zhì)表達(dá)

不同體積分?jǐn)?shù)的紫甘薯汁處理HepG2細(xì)胞48h后，用Western及IP細(xì)胞裂解液100μL充分裂解提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)G250 法測樣品蛋白濃度后以12% SDS-PAGE分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉2h，一抗(1:500)4℃封閉過夜，二抗(1:2000)37℃孵育2h。然后利用碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒，按照操作手冊進(jìn)行顯色。然后用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照記錄。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 Caspase-3酶活力的檢測

Caspase-3酶活力利用碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的酶活性檢測試劑盒進(jìn)行檢測。收集經(jīng)紫甘薯汁處理48h后的HepG2細(xì)胞并用細(xì)胞裂解液裂解收集總蛋白，總蛋白定量后與Caspase-3底物Ac-DEVD-pNA于37℃反應(yīng)2h后，用酶標(biāo)儀在405nm波長處讀取吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫甘薯汁對人3株腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

HepG2、SGC-7901和HO-8910細(xì)胞經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)(2.5%、5%和10%)的紫甘薯汁處理48h后，經(jīng)Alamar Blue法檢測結(jié)果如圖1所示，隨著紫甘薯汁體積分?jǐn)?shù)的增加，對3株腫瘤細(xì)胞的抑制率逐漸增大，具有一定的劑量依賴性。其中人肝癌細(xì)胞株HepG2對紫甘薯汁最為敏感，當(dāng)紫甘薯汁體積分?jǐn)?shù)為5%和10%時(shí)抑制率分別為(45.09f1.76)%和(81.58f3.04)%。因此，選擇HepG2為后續(xù)研究對象，進(jìn)一步研究紫甘薯汁誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

圖 1 紫甘薯汁對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of purple sweet potato juice on the proliferation of HepG2 cells

2.2 紫甘薯汁誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的檢測

人肝癌細(xì)胞株HepG2經(jīng)5%和10%的紫甘薯汁處理48h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，結(jié)果如圖2A顯示，對照組細(xì)胞生長情況較好，貼壁較牢固，細(xì)胞間緊密相連；隨著紫甘薯汁體積分?jǐn)?shù)增加，細(xì)胞逐漸變圓，脫落，懸浮細(xì)胞逐漸增多，且懸浮細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，周圍出現(xiàn)凋亡小體狀，呈現(xiàn)出明顯的凋亡特征。Hoechst 33258熒光染料染色結(jié)果如圖2B所示，對照組細(xì)胞在顯微鏡下呈均勻較弱熒光，而隨著紫甘薯汁體積分?jǐn)?shù)的增加，越來越多的細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)亮藍(lán)色熒光，從而證明越來越多的細(xì)胞表現(xiàn)出核質(zhì)濃縮、核仁破碎等凋亡特征。利用電鏡檢測細(xì)胞形態(tài)如圖2C所示，對照組細(xì)胞表面相對光滑，而經(jīng)紫甘薯汁處理48h后，細(xì)胞固縮，表面呈現(xiàn)出大量的小球結(jié)構(gòu)即凋亡小體。DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示，經(jīng)5%和10%的紫甘薯汁處理48h后HepG2細(xì)胞基因組DNA呈現(xiàn)典型的梯狀凋亡細(xì)胞條帶，而對照組細(xì)胞DNA完整(圖3)。

圖 2 紫甘薯汁誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察Fig.2 Cell morphology analysis of HepG2 cells after treatment with different concentrations of purple sweet potato juice

圖 3 紫甘薯汁處理HepG2細(xì)胞DNA電泳圖譜Fig.3 DNA electrophoresis of HepG2 cells after treatment with different concentrations of purple sweet potato juice

2.3 紫甘薯汁對HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響

目前藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡研究中的最為主要凋亡相關(guān)基因有Caspase家族、Bcl-2家族、Fas/FasL、FADD、p53等。本實(shí)驗(yàn)以5%和10%的紫甘薯汁分別處理HepG2細(xì)胞24h和48h后，采用RT-PCR和Western blotting檢測凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況(圖4)。如圖4A所示，HepG2細(xì)胞經(jīng)紫甘薯汁處理24h后，Caspase-3、Caspase-8、Fas、FADD和p53的mRNA水平與對照組相比表達(dá)量上調(diào)，而內(nèi)參GAPDH表達(dá)量不變化。Western blotting檢測結(jié)果顯示，紫甘薯汁處理HepG2細(xì)胞48h后Fas、FADD和p53蛋白水平表達(dá)上調(diào)。另外隨著劑量的增加Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9酶原降解增多，而活性形式的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9條帶逐漸增亮，呈明顯的劑量依賴效應(yīng)(圖4B)。

圖 4 紫甘薯汁對HepG2細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子基因水平(A)和蛋白水平(B)表達(dá)的影響Fig.4 Effect of purple sweet potato juice on the mRNA (A) and protein (B) expression of apoptosis-related factors in HepG2 cells

2.4 紫甘薯汁對HepG2細(xì)胞中Caspase-3酶活性的影響誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵核心步驟是Caspase-3酶原的剪切及酶活力的大小。本實(shí)驗(yàn)采用分光光度計(jì)法檢測紫甘薯汁對Caspase-3酶活力的影響。結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，紫甘薯汁可顯著提高Caspase-3酶活力并呈現(xiàn)出劑量依賴性(P＜0.05，P＜0.01)。

圖 5 紫甘薯汁對HepG2細(xì)胞中Caspase-3酶活力的影響.Fig.5 Effect of purple sweet potato juice on caspase-3 activity in HepG2 cells

3 討 論

近年來多種研究表明，花青素是紫甘薯中有效的抗腫瘤成分。一些研究者研究顯示，用200μg/mL的花青素處理細(xì)胞48h后對肺癌NCI-H460細(xì)胞、卵巢癌SKOV3細(xì)胞和前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖抑制率分別為41.7%、73.78%和72.1%[14-16]；曹東旭等[8]研究顯示紫甘薯花色苷在低質(zhì)量濃度時(shí)對HepG2細(xì)胞的增殖具有一定的促進(jìn)作用，而在800μg/mL處理48h后抑制率為61%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示紫甘薯汁體積分?jǐn)?shù)為10%(100μL/mL)時(shí)對HepG2細(xì)胞的抑制率為81.58%遠(yuǎn)高于以上研究結(jié)果，這說明紫甘薯汁中除花色苷外，還存在其他物質(zhì)在抗腫瘤效果上存在一定的交互作用。

細(xì)胞凋亡近年來成為治療腫瘤研究的熱點(diǎn)，而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)逐漸被人們所了解。在細(xì)胞凋亡過程中Caspase家族成員起著核心的作用，而它們的活化受到細(xì)胞表面死亡受體途徑(胞外途徑)和線粒體途徑(胞內(nèi)途徑)的調(diào)控[17]。池余剛等[15]認(rèn)為原花青素可能通過降低Survivin的表達(dá), 在體外抑制SKOV3細(xì)胞增殖, 并促進(jìn)其凋亡；鮑永華等[18]研究發(fā)現(xiàn)原花青素可以誘導(dǎo)SMMC-7721 細(xì)胞發(fā)生凋亡，并降低細(xì)胞端粒酶活性；秦睿[19]研究發(fā)現(xiàn)原花青素可以調(diào)節(jié)線粒體膜電位及活化Caspase-9、Caspase-3通過線粒體途徑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的。在本研究中倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、掃描電鏡和DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示紫甘薯汁能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。另外Western blotting結(jié)果顯示紫甘薯汁能夠活化Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9并能顯著提高Caspase-3酶活性。同時(shí)紫甘薯汁能夠提高細(xì)胞表面死亡受體途徑上游因子Fas和FADD的表達(dá)。因此推測紫甘薯汁誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡由細(xì)胞表面死亡受體途徑所介導(dǎo)。

p53是細(xì)胞的gatekeeper[20]。它的重要功能就是應(yīng)對細(xì)胞應(yīng)急和通過調(diào)節(jié)線粒體膜通透性和細(xì)胞表面受體蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。近年來，許多研究者發(fā)現(xiàn)p53可以增強(qiáng)細(xì)胞表面死亡受體的表達(dá)[22]?；罨膒53可以直接或間接的調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員的表達(dá)從而調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性[23]。本實(shí)驗(yàn)中，RT-PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示紫甘薯汁處理HepG2細(xì)胞后能夠從mRNA和蛋白水平提高p53的表達(dá)。因此推測p53在紫甘薯汁誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡中可能通過上調(diào)Fas起作用。

綜上所述，p53、Caspase、Fas和FADD參與了紫甘薯汁誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的凋亡，推測紫甘薯汁是通過細(xì)胞表面死亡受體途徑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的，從而提示紫甘薯汁在肝癌的治療中起著潛在的價(jià)值，也為人們通過合理膳食有效地預(yù)防腫瘤及糧食的深加工開發(fā)和合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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Anti-Tumor Activity of Purple Sweet Potato Juice and Its Apoptosis-Inducing Mechanism in HepG2 Cells

CHEN Yong-qiang，LIU Jin-juan，CAO Cheng-liang，BIAN Guang-kai，JIANG Ji-hong*
(Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plants of Jiangsu Province, Xuzhou Normal University, Xuzhou 221116, China)

This study was undertaken to explore the anti-tumor activity of purple sweet potato juice and its apoptosisinducing mechanism in HepG2 cells. The inhibitory effect of purple sweet potato juice at various concentrations on cell proliferation was examined by Alamar Blue assay. Cell apoptosis was determined by Hoechst 33258 fl uorescence staining, scanning electron microscopy (SEM) and agarose gel electrophoresis. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RTPCR) and Western blotting analysis were used to detect the expression of apoptosis-related factors in HepG2 cells treated with purple sweet potato juice at different concentrations for 24 h and 48 h, respectively. The results showed that the cell proliferation was inhibited by purple sweet potato juice in a dose-dependent manner. Cell shrinkage and apoptotic bodies after treatment for 48 h in HepG2 cells were observed. Typical DNA ladders in apoptotic cells were also observed. In addition, purple sweet potato juice up-regulated Fas, FADD, Caspase-3, -8 and p53 mRNA and protein expression levels. Moreover, active fragments of Caspase-3, -8 and -9 showed a signif i cant increase, especially Caspase-3. Therefore, purple sweet potato juice can inhibit the proliferation of cancer cells and induce the apoptosis of HepG2 cells through extrinsic apoptotic pathway and p53 may also play an important role in this pathway.

purple sweet potato；HepG2；anti-tumor activity；apoptosis

R285.5； R151.4

A

1002-6630(2013)01-0263-05

2011-10-30

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30872028；31000005)；江蘇省高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目(11KJB310011)；

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目；江蘇高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目

陳永強(qiáng)(1986ü)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：chenyongqiang_163@163.com

*通信作者：蔣繼宏(1962ü)，男，教授，博士，研究方向?yàn)橘Y源微生物及生物技術(shù)。E-mail：jhjiang@xznu.edu.cn