中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化熱帶假絲酵母菌冷凍干燥保護(hù)劑

王 華，賀金梅,2

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化熱帶假絲酵母菌冷凍干燥保護(hù)劑

王 華1，賀金梅1,2

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)，對(duì)熱帶假絲酵母菌真空冷凍干燥保護(hù)劑配方進(jìn)行篩選和優(yōu)化。通過Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到保護(hù)劑最佳配方為：蔗糖14.15g/100mL、L-谷氨酸鈉7.07g/100mL、聚乙二醇1.10g/100mL，菌體存活率預(yù)測(cè)值為81.46%，實(shí)際值為82.73%。

熱帶假絲酵母菌；保護(hù)劑；中心組合設(shè)計(jì)；響應(yīng)面法

與液態(tài)微生物菌劑相比，固態(tài)微生物活菌劑，具有保藏期長(zhǎng)、不易污染，而且在運(yùn)輸和貯藏、質(zhì)量控制等方面有著其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[1-2]，還可直接作為發(fā)酵劑、添加劑研制開發(fā)其他雙歧保健食品和醫(yī)藥制劑等優(yōu)點(diǎn)，因而受到越來越多的矚目[3]。

目前，國(guó)內(nèi)主要利用真空冷凍干燥技術(shù)生產(chǎn)固態(tài)活菌劑，但真空冷凍干燥過程中，冷凍和干燥兩個(gè)過程會(huì)造成部分微生物細(xì)胞的死亡、損傷及某些酶蛋白分子的鈍化[4]，具體表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：冷凍過程中水結(jié)冰時(shí)體積增大以及冰晶的機(jī)械作用，易破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)活性部位一些較弱的化學(xué)鍵；水結(jié)冰后溶質(zhì)濃度增加、pH值變化、離子強(qiáng)度增加、相分離；干燥過程中除去了與蛋白質(zhì)、磷脂等生物大分子結(jié)合的大部分水分子，易導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子變性失活，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能改變。因此，為了減少冷凍和干燥過程中對(duì)細(xì)胞活性的影響，通常加入不同類型的保護(hù)劑。保護(hù)劑可以改變微生物干燥時(shí)的物理、化學(xué)環(huán)境，減輕或防止干燥或復(fù)水對(duì)細(xì)胞的損害，盡可能保持微生物原有的各種生理生化特性和生物活性[5-7]，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)的目的，表1列出了常用的保護(hù)劑類型以及保護(hù)機(jī)理[8-11]。本實(shí)驗(yàn)以熱帶假絲酵母菌為發(fā)酵菌種，采用中心組合設(shè)計(jì)并結(jié)合響應(yīng)面法，對(duì)熱帶假絲酵母菌冷凍干燥保護(hù)劑進(jìn)行優(yōu)化。

表 1 保護(hù)劑類型及其保護(hù)機(jī)理Table 1 Cryoprotectants and mechanisms of action

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

熱帶假絲酵母(Candida tropical)購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心。

菌種活化培養(yǎng)基：5e Bé麥芽汁液體培養(yǎng)基；菌液擴(kuò)大培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基)：馬鈴薯300g、葡萄糖20g、蒸餾水1000mL；菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯300g、葡萄糖20g、瓊脂20g、氯霉素0.1g、蒸餾水1000mL。

1.2 試劑與儀器

蔗糖(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乳糖(分析純) 成都市科氏化工試劑廠；聚乙二醇(分析純)天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司；L-谷氨酸鈉(生化試劑)、甘油、β-環(huán)狀糊精、硫酸錳、甘氨酸(均為分析純) 成都市科氏化工試劑廠。

ZHWY-200B恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；H1850R高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；VFD-2000 冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 菌種培養(yǎng)和收集

菌種經(jīng)過活化，然后在30℃、180r/min條件下振蕩培養(yǎng)30h至穩(wěn)定期前期，4℃、6000r/min離心20min，收集菌泥。

1.3.3 活菌計(jì)數(shù)

稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法[12]，28～30℃培養(yǎng)48h。

1.3.4 凍干后樣品的處理及菌體存活率計(jì)算

向凍干后樣品中加入10mL無菌的生理鹽水，于37℃培養(yǎng)箱中放置15min[13-14]；然后采用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定樣品中的活菌數(shù)。

1.3.5 真空冷凍干燥工藝

在無菌條件下，用無菌水將離心收集到的菌泥稀釋成活菌數(shù)為1h109CFU/mL的菌懸液；于無菌的培養(yǎng)皿中加入2mL菌懸液，然后按保護(hù)劑與菌泥體積比2:1的比例加入保護(hù)劑，保護(hù)劑與菌懸液平衡時(shí)間30min[15-16]；冷凍干燥各參數(shù)為：預(yù)凍溫度—40℃、預(yù)凍時(shí)間2h、升華溫度—30℃、解析溫度25℃、干燥時(shí)間24h、真空度3～10Pa[17-18]。

1.3.6 保護(hù)劑篩選

采用蔗糖、乳糖、聚乙二醇、L-谷氨酸鈉、甘油、β-環(huán)狀糊精、硫酸錳、甘氨酸8種保護(hù)劑，將上述幾種保護(hù)劑用蒸餾水配成不同質(zhì)量濃度的溶液，121℃滅菌20min后于4℃冰箱中備用。以蒸餾水作對(duì)照，測(cè)定凍干前后活菌數(shù)，計(jì)算菌體存活率。

1.3.7 中心組合設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，用Design-Expert軟件中的中心組合設(shè)計(jì)，對(duì)熱帶假絲酵母冷凍干燥保護(hù)效果較好的3種保護(hù)劑蔗糖、L-谷氨酸鈉、聚乙二醇進(jìn)行優(yōu)化，以凍干存活率為響應(yīng)值，以確定熱帶假絲酵母冷凍干燥保護(hù)劑最佳組合。試驗(yàn)因素水平編碼見表2。

表 2 保護(hù)劑優(yōu)化試驗(yàn)中心組合設(shè)計(jì)因素水平編碼表Table 2 Factors and their coded levels for central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 各種保護(hù)劑對(duì)熱帶假絲酵母菌凍干存活率的影響

圖 1 各種保護(hù)劑對(duì)熱帶假絲酵母菌凍干存活率的影響Fig.1 Effect of cryoprotectant type and concentration on the survival rate of Candida tropical after freeze-drying

從圖1可以看出，沒有添加任何保護(hù)劑的菌體凍干存活率只有8.21%，菌體存活率隨著各種保護(hù)劑添加量的增加而增加；當(dāng)乳糖、蔗糖、β-環(huán)狀糊精、L-谷氨酸鈉、甘氨酸、聚乙二醇、甘油、硫酸錳的質(zhì)量濃度分別為10、15、15、7、7、1、4、0.5g/100mL時(shí)，菌體存活率最大，分別為29.19%、37.78%、19.89%、27.92%、18.96%、28.47%、13.7%、11.99%；由于高質(zhì)量濃度的保護(hù)劑會(huì)加速細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)聚合，形成較強(qiáng)玻璃化結(jié)構(gòu)，反而不利于細(xì)胞的保存，且復(fù)水效果不好[19]，所以，當(dāng)保護(hù)劑的質(zhì)量濃度超過它們的最佳質(zhì)量濃度后，菌體存活率隨著各種保護(hù)劑添加量的增加反而下降。

其中蔗糖、乳糖、L-谷氨酸鈉、聚乙二醇對(duì)熱帶假絲酵母菌凍干保護(hù)的效果較好，蔗糖、乳糖、L-谷氨酸鈉屬于滲透型保護(hù)劑，聚乙二醇屬于非滲透型保護(hù)劑[20]。蔗糖、乳糖、L-谷氨酸鈉能透過細(xì)胞壁，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度升高，細(xì)胞內(nèi)壓力接近于細(xì)胞外壓力，降低細(xì)胞外干燥或凍結(jié)引起的細(xì)胞脫水皺縮的程度和速度，從而減少了對(duì)細(xì)胞的損傷。聚乙二醇主要是保護(hù)細(xì)胞的表面免受傷害，在凍干時(shí)使溶液呈過冷狀態(tài)，降低了溶液結(jié)冰的速度，避免細(xì)胞在冷凍或加熱時(shí)由于鹽類濃縮，使細(xì)胞脫水而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的塌陷、滲透壓性休克、蛋白質(zhì)變性等不良后果[21]。另外，乳糖、蔗糖、聚乙二醇又是親水性保護(hù)劑，它們的羥基基團(tuán)可與蛋白質(zhì)形成氫鍵，從而代替蛋白質(zhì)極性基團(tuán)周圍的水分子，使蛋白質(zhì)表面形成一層水化膜保護(hù)氫鍵，進(jìn)而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，防止蛋白質(zhì)因干燥而變性[8]。

由單因素試驗(yàn)研究表明，其他幾種保護(hù)劑對(duì)熱帶假絲酵母菌的保護(hù)效果都比較差，然而，即便是最佳質(zhì)量濃度的蔗糖，菌體最大凍干存活率也只有37.78%，因此，難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)凍干菌粉的目的。通常情況下，幾種保護(hù)劑復(fù)合使用，保護(hù)效果要比單一保護(hù)劑的效果好。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，雖然乳糖的保護(hù)效果達(dá)到29.19%，但它屬于還原糖，會(huì)與氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)，影響保護(hù)效果。因此，選用蔗糖、L-谷氨酸鈉、聚乙二醇3種保護(hù)劑進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)，以凍干存活率為響應(yīng)值，以確定熱帶假絲酵母冷凍干燥保護(hù)劑最佳組合。

2.2 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果與分析

表 3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 CCD arrangement and results

通過對(duì)蔗糖、L-谷氨酸鈉、聚乙二醇3種保護(hù)劑進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)(表2)，利用Design-Expert軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二次回歸方程：

表 4 二次多項(xiàng)模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the fi tted regression quadratic model

二次多項(xiàng)式回歸分析結(jié)果顯示(表4)，回歸方程顯著性檢驗(yàn)F= 14.86＞F0.01(9,10)=4.95，F(xiàn)失擬=3.06＜F0.05(5,5)= 5.05，說明所建立的回歸方程與實(shí)際情況擬合得好。通過Design-Expert軟件對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析表明，X1、X3、X12、X22、X32對(duì)凍干存活率影響顯著，其他各項(xiàng)影響不顯著。

圖2～4是根據(jù)多元回歸分析所作的響應(yīng)曲面圖，由此可以對(duì)任何兩因素交互影響熱帶假絲酵母菌菌體存活率進(jìn)行分析，以確定最佳因素水平；隨著蔗糖、L-谷氨酸鈉、聚乙二醇質(zhì)量濃度的增加，熱帶假絲酵母菌菌體存活率也隨之提高，但各保護(hù)劑質(zhì)量濃度增加到一定值后，菌體存活率反而開始下降。

圖 2 蔗糖和L-谷氨酸鈉對(duì)熱帶假絲酵母菌菌體存活率交互影響的三維曲面圖Fig.2 Response surface plot for the effect of sucrose and L-sodium glutamate on survival rate of cells

通過Design-Expert軟件的數(shù)據(jù)優(yōu)化程序求得當(dāng)蔗糖、L-谷氨酸鈉、聚乙二醇的質(zhì)量濃度分別為14.15、7.07、1.10g/100mL時(shí)，熱帶假絲酵母菌菌體存活率能達(dá)到81.46%。按照保護(hù)劑的最佳配方，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，熱帶假絲酵母菌菌體存活率平均值為82.73%，與預(yù)測(cè)值接近，說明所建立回歸模型合理。

圖 3 蔗糖和聚乙二醇對(duì)熱帶假絲酵母菌菌體存活率交互影響的三維曲面圖Fig.3 Response surface plot for the effect of cross-interaction between sucrose and polyethylene glycol on the survival rate of Candida tropicalafter freeze-drying

圖 4L-谷氨酸鈉和聚乙二醇對(duì)熱帶假絲酵母菌菌體存活率交互影響的三維曲面圖Fig.4 Response surface plot for the effect of L-sodium glutamate and polyethylene glycol on the survival rate of Candida tropical after freeze-drying

3 結(jié) 論

研究采用單因素試驗(yàn)和中心組合設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面法，對(duì)熱帶假絲酵母菌真空冷凍干燥保護(hù)劑配方進(jìn)行了篩選和優(yōu)化。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，蔗糖、乳糖、L-谷氨酸鈉、聚乙二醇的保護(hù)效果較好；通過響應(yīng)面優(yōu)化得到熱帶假絲酵母菌真空冷凍干燥保護(hù)劑的二次回歸方程：Y=—149.69640＋12.27837X1＋27.85516X2＋82.98039X3—0.013625X1X2—0.62050X1X3—1.04875X2X3—0.40639X12—1.87391X22—30.23713X32，保護(hù)劑最佳配方為蔗糖14.15g/100mL、L-谷氨酸鈉7.07g/100mL、聚乙二醇1.10g/100mL，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)熱帶假絲酵母菌菌體存活率平均值為82.73%。

[1] NAN F U, CHEN X D. Towards a maximal cell survival in convective thermal drying process[J]. Food Research International, 2011, 44: 1127-1149.

[2] 南君勇. 真空冷凍干燥技術(shù)制備酵母菌菌粉的研究[D]. 天津: 天津大學(xué), 2007.

[3] BAYROCK D, INGLEDEW W M. Mechanism of viability loss during fl uidized bed drying of baker’s yeast[J]. Food Research International, 1997, 30(6): 417-425.

[4] 田洪濤, 賈英民, 馬雯, 等. 嗜熱鏈球菌真空冷凍干燥前后發(fā)酵活力變化[J]. 中國(guó)乳品工業(yè), 2001(6): 17-19.

[5] 黃科. 真空冷凍干燥乳酸菌的研究進(jìn)展[J]. 西安文理學(xué)院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2009, 12(3): 49-52.

[6] 趙志華, 岳田利, 王燕妮, 等. 釀酒活性干酵母(AADY)的研究[J]. 中國(guó)釀造, 2006(11): 1-4.

[7] 靳志強(qiáng), 李平蘭. 培養(yǎng)基、保護(hù)劑和饑餓處里對(duì)凍干乳酸菌存活性的影響[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(7): 296-298.

[8] 朱永寧, 泉本騰利. 血紅蛋白(Hb)的低溫保護(hù)劑[J]. 吉林大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào), 1999(3): 88-92.

[9] 朱敖蘭, 楊潔. 生物制品凍干保護(hù)劑及其保護(hù)機(jī)理的研究進(jìn)展[J].喀什師范學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 28(6): 46-50.

[10] TIMASHEFF S N. Control of protein stability and reactions by weakly interacting cosolvents: the simplicity of the complicated[J]. Advance in Protein Chemistry, 1998, 51: 355-432.

[11] MAZZOBRE M A F, del PILAR BUERA M, CHIRIFE J. Protective role of trehalose on thermal stability of lactase in relation to its glass and crystal forming properties and effect of delaying crystallization[J]. LWT-Food Science and Technology, 1997, 30(3): 324-329.

[12] 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn). GB 4789.15ü2010 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010.

[13] 肖冬光, 鄒海晏, 程志娟, 等. 酒精活性干酵母的活化與活細(xì)胞率的測(cè)定[J]. 釀酒科技, 1991(2): 25-27.

[14] 陳敏, 梁新樂, 勵(lì)建榮. 葡萄酒活性干酵母復(fù)水活化條件的研究[J].江蘇食品與發(fā)酵, 2001, 105(2): 6-9.

[15] 林云. 雙歧桿菌凍干保護(hù)劑條件的研究[J]. 飼料研究, 2001(6): 4-7.

[16] 陸愛華, 王志耕, 許飛, 等. 德式保加利亞乳桿菌凍干工藝中菌懸浮液制備條件的研究[J]. 包裝與食品機(jī)械, 2006, 24(4): 22-25.

[17] 陳濤. 真空冷凍干燥制備高效濃縮型兩歧雙歧桿菌酸奶發(fā)酵劑[D].呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

[18] 李心剛, 胡桂秋, 黃晶. 凍干工藝中預(yù)凍溫度的確定[J]. 承德石油高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào), 2005, 7(4): 19-20.

[19] 熊濤, 黃錦卿, 宋蘇華, 等. 植物乳桿菌真空冷凍干燥保護(hù)劑配方優(yōu)化[J]. 南昌大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 34(6): 561-565.

[20] ZDENEK H. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms[J]. Cryobiology, 2003, 46(3): 205-229.

[21] 盧行安, 陳明生, 袁杰利, 等. 乳酸菌冷凍干燥工藝的研究進(jìn)展[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2001, 13(1): 58-61.

Optimization of Cryoprotectant Formulation for Candida tropical by Central Composite Design

WANG Hua1，HE Jin-mei1,2
(1. Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712, China；2. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

A cryoprotectant formulation consisting of sucrose, L-sodium glutamate and polyethylene glycol for Candida tropical was optimized using a response surface central composite design. By regression analysis of the experimental data obtained, the optimum cryoprotectant formulation was found to consist of 14.15 g/100 mL sucrose, 7.07 g/100 mL L-sodium glutamate and 1.01 g/100 mL polyethylene glycol. The predicted survival rate of Candida tropical with the addition of the optimized cryoprotectant formulation after freeze-drying was 81.46%, which was close to the actual value of 82.73%.

Candida tropical；cryoprotectant；central composite design (CCD)；response surface methodology (RSM)

Q93.336

A

1002-6630(2013)01-0244-04

2012-09-06

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(柑橘)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-27-05B)

王華(1963ü)，男，研究員，學(xué)士，研究方向?yàn)楦涕偕罴庸ぜ百A藏。E-mail：wanghua40@126.com