巴西松子中蛋白酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

肖 麗，應(yīng)鐵進(jìn)*，蔡路昀，韓曉旭

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310029)

巴西松子中蛋白酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

肖 麗，應(yīng)鐵進(jìn)*，蔡路昀，韓曉旭

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310029)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)研究pH值、提取時(shí)間和料液比3個(gè)因素對(duì)巴西松子中蛋白酶活力的影響，得出巴西松子中蛋白酶的最佳提取緩沖液為pH9.0的硼酸-硼砂緩沖液、提取時(shí)間為60min、料液比為1:8(m/V)；采用(NH4)2SO4沉淀、DEAE-Sepharose FF陰離子交換層析分離純化巴西松子中的一種蛋白酶，結(jié)果表明：純化后蛋白酶比活力提高到了8.61倍，回收率為21.65%。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析表明：該蛋白酶分子質(zhì)量為33kD。酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果表明：該蛋白酶最適pH值為9.0，屬堿性蛋白酶；反應(yīng)的最適溫度為50℃；金屬離子Mn2+對(duì)該蛋白酶活性有強(qiáng)烈的激活作用，而Ca2+、Mg2+和Cu2+對(duì)酶活性有抑制作用。

巴西松子；蛋白酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

巴西松子(Araucaria angustifolia (Bert) O. Ktze)，是一種重要的國(guó)際性貿(mào)易商品，主要分布在喜馬拉雅山區(qū)[1]，如阿富汗東部、巴基斯坦北部、印度查謨克什米爾地區(qū)以及我國(guó)的西藏。松子含有人體必需的多種營(yíng)養(yǎng)，如VA、VE、磷脂、多糖、黃酮等，并且富含不飽和脂肪酸[2-3]，在全世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用于甜食、糕點(diǎn)或者色拉的配料中，備受歷代醫(yī)家和營(yíng)養(yǎng)學(xué)家的推崇。

巴西松子一季采收，周年供應(yīng)，因此，需要進(jìn)行商業(yè)性的長(zhǎng)期貯藏。貯藏過(guò)程中的品質(zhì)劣變是制約貯藏壽命的重要因素。除了油脂氧化，產(chǎn)生蛤喇味外，由寡肽、氨基酸含量變化導(dǎo)致的鮮度下降也是品質(zhì)劣變的一個(gè)重要方面。蛋白酶參與松子貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)的代謝過(guò)程，因而直接影響到松子的營(yíng)養(yǎng)與品質(zhì)變化。國(guó)內(nèi)外對(duì)松子油[3-6]、松仁過(guò)敏性[7-9]和松仁蛋白[10-11]已經(jīng)有所研究，但未見(jiàn)對(duì)松子中蛋白酶的研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)研究松子中蛋白酶的分離純化，對(duì)于了解松子的品質(zhì)劣變機(jī)制、改進(jìn)松子貯藏條件具有重要的意義，并可為該酶進(jìn)一步應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等方面提供有價(jià)值的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴西松子產(chǎn)自巴基斯坦，保存于―3℃；DEAESepharose FF 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；福林酚(分析純) 上海源聚生物科技有限公司；低、高分子質(zhì)量SDS-PAGE蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Bio-Rad公司；牛血清白蛋白(BSA，生化純) 北京普博斯生物科技有限公司。

722E型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；AKTAprime plus低壓層析系統(tǒng) 通用電氣(中國(guó))醫(yī)療集團(tuán)；CHRIST冷凍干燥機(jī) 上海匯分電子科技有限公司；EPS-300垂直電泳儀 上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 巴西松子蛋白酶提取

取5g經(jīng)過(guò)石油醚萃取完全脫脂的巴西松子果仁粉，加入40mL緩沖液，在4℃條件下研磨充分后，靜置60min，離心(4℃、8000r/min、30min)，取上清液，緩慢加入(NH4)2SO4至80%飽和度，于4℃冰箱中靜置2h后，再次離心取沉淀，溶解于原緩沖液，得到粗酶液。采用對(duì)比實(shí)驗(yàn)對(duì)緩沖液pH值、提取時(shí)間和料液比進(jìn)行初步篩選，將提取時(shí)間分別設(shè)置為20、40、60、80、100min，料液比(m/V)為1:4、1:6、1:8、1:10、1:12，pH值分別調(diào)整為8.0、9.0、10.0、11.0，采用正交試驗(yàn)獲得最佳提取工藝條件。

1.2.2 蛋白酶純化

采用(NH4)2SO4沉淀法粗步純化蛋白酶，將鹽析后得到的粗酶液經(jīng)過(guò)DEAE-Sepharose FF層析柱[12-13](1.6cmh40cm)進(jìn)一步分離純化，用含0～1mol/L NaCl的硼酸-硼砂緩沖液(pH9.0)線性梯度洗脫[14]，流速2mL/min，5mL/管分別收集，280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，計(jì)算在活性峰范圍內(nèi)每管蛋白酶活性、總蛋白含量。挑選出純化倍數(shù)高的樣品，真空凍干得到樣品粉末，在―70℃保存，用于電泳分析及蛋白酶性質(zhì)研究。

1.2.3 SDS-PAGE電泳

純化后的蛋白酶按文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳。其中分離膠和濃縮膠的體積分?jǐn)?shù)分別采用10%和5%[16]。電泳完畢后，小心取出膠片，置于固定液中固定30min，再用考馬斯亮藍(lán)R250染色至少2h，最后用脫色液脫色至凝膠背景透明后保存在保存液中，測(cè)定其純度及分子質(zhì)量[17]。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白酶的蛋白質(zhì)含量，以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)依次測(cè)定每管收集液在280nm波長(zhǎng)處[18]的吸光度，得到蛋白質(zhì)含量。

1.2.5 蛋白酶活力的測(cè)定

以2%酪蛋白為底物，按照福林酚測(cè)定法[14,19]并加以改進(jìn)。取3支試管編號(hào)，分別加入1.0mL酶液，于40℃水浴鍋中預(yù)熱2～3min，加入1.0mL 40℃預(yù)熱的2%酪蛋白，于40℃反應(yīng)10min，再加入2.0mL 0.4mol/L三氯醋酸反應(yīng)15min過(guò)濾，取濾液1.0mL放入盛有5mL Na2CO3溶液的試管中，加入1.0mL 福林-酚試劑于40℃水浴發(fā)色20min。同時(shí)做空白對(duì)照，即加入酶液后直接用2.0mL 0.4mol/L三氯醋酸沉淀酶并使酶失活，然后再加入2%的酪蛋白。酶活力單位定義為1mL酶液在40℃和pH9.0的條件下，1min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸為1個(gè)酶活力單位，以U表示。

1.2.6 蛋白酶的酶學(xué)特性

1.2.6.1 酶的熱穩(wěn)定性

將1mL酶液分別置于20～90℃水浴鍋中分別保溫20、30、40、50、60min，再測(cè)定酶活性。

1.2.6.2 最適反應(yīng)溫度

將反應(yīng)溫度分別設(shè)為20～90℃，根據(jù)1.2.6.1節(jié)的結(jié)果，測(cè)定酶活性。

1.2.6.3 最適pH值

將酶反應(yīng)液的pH值分別調(diào)整為3.0～11.0(pH3.0～5.0用0.05mol/L乳酸鹽緩沖液，pH7.0～8.0用0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，pH9.0～11.0用0.05mol/L硼酸鹽緩沖液)，根據(jù)1.2.6.2節(jié)的結(jié)果，在最適反應(yīng)溫度條件下測(cè)定酶活性。

1.2.6.4 金屬離子對(duì)酶活性的影響

在硼酸-硼砂緩沖液中分別加入濃度為10mmol/L的Na+、Mg2+、K+、Ca2+、Mn2+和Cu2+，根據(jù)1.2.6.2節(jié)的結(jié)果，在最適反應(yīng)溫度條件下測(cè)定酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴西松子果仁中蛋白酶的分離提取

2.1.1 不同pH值緩沖液對(duì)蛋白酶活力的影響

重蒸水、乳酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液和Tris-HCl緩沖液，這5種浸提溶劑常用于提取蛋白酶[20-22]，為探討不同的提取方法對(duì)酶活力的影響程度，實(shí)驗(yàn)取5g脫脂松子果仁粉分別加入30mL的上述5種浸提溶劑，混合勻漿，粗濾后于4℃、8000r/min離心30min，取上清液得粗蛋白酶液，測(cè)定蛋白酶活力。

表 1 不同提取溶劑提取液的酶活力Table 1 Effect of different solvents on the extraction eff i ciency of protease activity

圖 1 pH值對(duì)巴西松子蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of solvent pH on the extraction eff i ciency of protease activity

由表1可知，對(duì)巴西松子來(lái)源的蛋白酶提取效果為硼酸-硼砂緩沖液＞Tris-HCl緩沖液＞磷酸鹽緩沖液＞蒸餾水＞乳酸鹽緩沖液，因此選用硼酸鹽緩沖液效果最好。為了進(jìn)一步研究硼酸鹽緩沖液pH值對(duì)酶活力的影響，用NaOH溶液將硼酸-硼砂緩沖液的pH值分別調(diào)整為8.0、9.0、10.0、11.0，在料液比為1:6、提取時(shí)間為30min條件下，測(cè)定蛋白酶活力。

由圖1可知，隨著pH 值升高，巴西松子蛋白酶活力先增大后減小。在pH8.0～9.0范圍內(nèi)，蛋白酶活力急速升高，在pH9.0時(shí)達(dá)到最大值，之后開(kāi)始下降。故選取pH9.0的硼酸-硼砂緩沖液提取蛋白酶比較適宜，這與蔣麗萍等[10]研究表明堿提松子蛋白質(zhì)的最佳pH值為10.0相接近。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的影響

圖 2 提取時(shí)間對(duì)巴西松子蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction eff i ciency of protease activity

從植物中提取蛋白酶，提取效果與提取溶劑和提取時(shí)間有關(guān)。時(shí)間太短導(dǎo)致酶不能充分溶解到提取溶劑中，時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)降低酶活力測(cè)定效率。在料液比為1:6、pH9.0條件下，測(cè)定不同提取時(shí)間的蛋白酶活力。由圖2可知，在20～60min，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白酶活力也隨之增加，當(dāng)60min時(shí)達(dá)到最大值，此后隨著時(shí)間延長(zhǎng)酶活力略微上升，提取時(shí)間為80min和100min差別不大，說(shuō)明60min時(shí)，蛋白酶已經(jīng)基本提取飽和。因此選取提取時(shí)間為60min。

2.1.3 料液比對(duì)蛋白酶活力的影響

圖 3 料液比對(duì)巴西松子蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of solid-to-solvent ratio on the extraction eff i ciency of protease activity

料液比如果太低，酶不能充分溶解，會(huì)影響蛋白酶提取效果，進(jìn)而導(dǎo)致酶活力下降；料液比如果太高，又會(huì)增加后處理負(fù)擔(dān)。為了尋找較佳提取松子蛋白酶的料液比，分別選取料液比1:4、1:6、1:8、1:10、1:12，緩沖液pH9.0，在4℃提取60min條件下，測(cè)定蛋白酶活力。由圖3可知，當(dāng)料液比從1:4降低到1:6時(shí)蛋白酶活力不斷升高，此后隨著料液比進(jìn)一步降低，酶活力略微波動(dòng)，總體趨于穩(wěn)定，因此選取料液比1:6進(jìn)行提取比較適宜。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化巴西松子蛋白酶提取工藝結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)可以進(jìn)一步確定最佳工藝參數(shù)[10]，以提取時(shí)間、緩沖液pH值和料液比為試驗(yàn)因素，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取巴西松子蛋白酶的最佳工藝參數(shù)，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，并應(yīng)用SAS軟件進(jìn)行方差分析，見(jiàn)表3。

表 2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and results

表 3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

由表2極差分析可知，影響巴西松子蛋白酶活力的因素順序?yàn)锳＞C＞B，因素A(提取時(shí)間)為顯著影響因素，綜合考慮提取效率與成本，提取的最優(yōu)水平組合為A2B2C3。即巴西松子蛋白酶在pH9.0的硼酸-硼砂緩沖液中以料液比為1:8、提取60min為最佳提取條件。在此條件下，蛋白酶活力為387.48U。提取時(shí)間對(duì)酶活力影響最顯著，與表3方差分析結(jié)果吻合。

2.3 巴西松子蛋白酶的純化

2.3.1 (NH4)2SO4沉淀

硫酸銨沉淀法可從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)，因其溶解度大、溫度系數(shù)小和不易使蛋白質(zhì)變性而廣泛應(yīng)用于酶的分離提純中[14,22-23]。當(dāng)溶液鹽濃度增加時(shí)上清液中蛋白酶的溶解度減少，鹽濃度太高時(shí)，會(huì)發(fā)生鹽析現(xiàn)象，因此合適的鹽濃度對(duì)純化蛋白酶十分必要。采用飽和度分別為20%～90%的硫酸銨分別將蛋白酶提取液鹽析，4℃靜置過(guò)夜后，8000r/min離心30min，收集上清液，再用福林酚法分別檢測(cè)上清液的蛋白酶活力，并與鹽析前提取液蛋白酶活力進(jìn)行比較，見(jiàn)圖4。

圖 4 不同硫酸銨飽和度對(duì)上清液蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of saturation degree of ammonium sulfate on the recovery of protease activity

鹽析分級(jí)沉淀結(jié)果表明，當(dāng)硫酸銨飽和度＜20%時(shí)，上清液中酶活力跟原液相差不大。當(dāng)硫酸銨飽和度為80%時(shí)，上清液中幾乎檢測(cè)不到酶活力，即80% (NH4)2SO4飽和度可有效沉淀目標(biāo)蛋白酶。因此，實(shí)驗(yàn)采用80%飽和度硫酸銨沉淀目標(biāo)蛋白酶。這與黃光榮等[14]采用80%的(NH4)2SO4鹽析提取嗜熱芽孢桿菌HS08結(jié)果相似，而曾小波等[23]研究的醬油曲蛋白酶最佳飽和度是85%。這說(shuō)明了同一種鹽濃度對(duì)不同蛋白酶表面水化膜的破壞程度不一樣，蛋白質(zhì)的溶解度也不一樣。

2.3.2 DEAE-Sepharose FF層析

圖 5 DEAE-Sepharose FF層析的洗脫曲線Fig.5 Elution prof i le of protease on DEAE-Sepharose FF column

將(NH4)2SO4沉淀后得到的粗酶液，于0.05mol/L 硼酸-硼砂緩沖液中4℃透析脫鹽12h(透析袋截留相對(duì)分子質(zhì)量為7000)[24]，除去過(guò)量鹽離子對(duì)下一步層析的影響。透析完成后，體積會(huì)擴(kuò)大50%，因此需要采用真空冷凍干燥成粉末濃縮樣品，再將粉末溶解于10mL緩沖液，經(jīng)DEAE-Sepharose FF柱層析洗脫得到2個(gè)峰，但只有1個(gè)峰有蛋白酶活性，檢測(cè)每管收集液的酶活力從而得到洗脫曲線(圖5)，將活性洗脫峰收集濃縮后，采用SDS-PAGE的方法檢測(cè)其純度。結(jié)果表明，該活性峰的純度較高，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為33kD左右(圖6)。

圖 6 DEAE-Sepharose FF純化后巴西松子蛋白酶的SDS-PAGE圖譜Fig.6 SDS-PAGE of crude and purif i ed protease

2.3.3 分離純化效率

表 4 巴西松子蛋白酶的分離純化Table 4 Isolation and purif i cation of Brazilian pine nut protease

在粗提蛋白酶的分離純化過(guò)程中，各步驟的分離純化效率見(jiàn)表4。結(jié)果表明，該蛋白酶經(jīng)分離后純化倍數(shù)達(dá)到8.61倍，回收率為21.65%。

2.4 巴西松子蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 酶的熱穩(wěn)定性

圖 7 溫度對(duì)巴西松子蛋白酶活力的影響Fig.7 Heat stability of protease from Brazilian pine nut

圖7表明，蛋白酶在20～50℃保溫20～60min后酶活力損失較小，在40℃時(shí)保溫50min，酶活力最高。但溫度高于50℃時(shí)，酶活力迅速降低，當(dāng)溫度超過(guò)80℃時(shí)，酶迅速變性，活力喪失80%以上。因此該酶屬于不耐熱范圍。

2.4.2 酶反應(yīng)的最適溫度

圖8表明，隨著溫度升高，巴西松子蛋白酶的活力逐漸升高，在50℃時(shí)達(dá)到最大值。之后隨著溫度升高，酶活力逐漸下降，70～80℃變化不明顯，當(dāng)溫度在90℃時(shí)，酶活力下降最顯著，因?yàn)槊傅幕瘜W(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，適當(dāng)?shù)臏囟扔欣诿复俜磻?yīng)，但溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶變性。

圖 8 溫度對(duì)巴西松子蛋白酶活力的影響Fig.8 Optimum reaction temperature for protease from Brazilian pine nut

2.4.3 酶反應(yīng)的最適pH值

適宜的pH值是維持酶活力的重要因素。蔣麗萍[10]、吳曉紅[25]等研究松子的等電點(diǎn)分別為4.6和4.2，推測(cè)pH值在4.0左右，酶活力偏低是因?yàn)榫彌_液的pH值與目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)一致，導(dǎo)致蛋白的溶解度減少而引起聚集。由圖9可知，巴西松子蛋白酶最適pH值為9.0，該酶在pH＜4.0的酸性條件時(shí)，酶活力偏低。pH＞10.0的堿性條件時(shí)，酶活力下降不明顯。因此，該酶屬于堿性蛋白酶。

圖 9 pH值對(duì)巴西松子蛋白酶活力的影響Fig.9 Effect of pH on the activity of protease from Brazilian pine nut

2.4.4 金屬離子對(duì)酶反應(yīng)的影響

表 5 金屬離子對(duì)巴西松子蛋白酶活力的影響Table 5 Effect of metal ions on the activity of protease from Brazilian pine nut

表5表明，Na+和K+對(duì)該蛋白酶活性有輕微激活作用，Mn2+的促進(jìn)作用最強(qiáng)，高達(dá)167.68%，而Ca2+和Mg2+對(duì)酶活性有較弱的抑制作用，幾乎可以忽略不計(jì)，Cu2+的抑制效果最強(qiáng)為25.19%。因此，該酶是Mn2+激活蛋白酶。

3 結(jié) 論

通過(guò)正交試驗(yàn)研究pH值、提取時(shí)間和料液比3個(gè)因素對(duì)巴西松子中蛋白酶提取效果的影響，得出巴西松子中蛋白酶的最佳提取緩沖液為pH9.0的硼酸-硼砂緩沖液、提取時(shí)間為60min、料液比為1:8；通過(guò)硫酸銨沉淀和離子交換層析等方法可將該蛋白酶純化到單峰，純化后蛋白酶的比活力為5.77U/mg，純化倍數(shù)為8.61倍，回收率為21.65%。SDS-PAGE電泳進(jìn)一步確定其分子質(zhì)量為33kD，推測(cè)該酶由均一的亞基組成。該蛋白酶的最適溫度為50℃，最適pH值為9.0，因此，該酶屬于不耐熱的堿性蛋白酶。10mmol/L Mn2+對(duì)該蛋白酶有強(qiáng)烈的激活作用，達(dá)到2.68倍，而Ca2+、Mg2+和Cu2+對(duì)蛋白酶活性有微弱抑制作用，因此推測(cè)該蛋白酶為一種Mn2+激活蛋白酶。

[1] SINGH N B, CHAUDHARY V K. Variability, heritability and genetic gain in cone and nut characters of Chilgoza pine (Pinus gerardiana Wall.)[J]. Silvae Genetica, 1993, 42(2/3): 61-63.

[2] VENKATACHALAM M, SATHE S K. Chemical composition of sel ected edible nut seeds[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(13): 4705-4714.

[3] DESTAILLATS F, CRUZ-HERNANDEZ C, GIUFFRIDA F, et al. Identification of the botanical origin of pine nuts found in food products by gas-liquid chromatography analysis of fatty acid prof i le[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(4): 2082-2087.

[4] SAGRERO-NIEVES L. Fatty acid composition of mexican pine nut (Pinus cembroides) oil from three seed coat phenotypes[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1992, 59(3): 413-414.

[5] LEE J W, LEE K W, LEE S W. Selective increase in pinolenic acid(all-cis-5,9,12-18:3)in Korean pine nut oil by crystallization and its effect on LDL-receptor activity[J]. Lipids, 2004, 39(4): 383-387.

[6] ZHANG Ying, WANG Zhenyu, CHEN Xiaoqiang. Ultrasoundassociated extraction of seed oil of Korean pine[J]. Journal of Forestry Research, 2005, 16(2): 140-142.

[7] MENAYA G, GONZALO-GARIJO M A, MONEO I, et al. A 17-kDa allergen detected in pine nuts[J]. Allergy, 2000, 55(3): 291-293.

[8] FINE A J. Hypersensitivity reaction to pine nuts (pinon nuts-pignolia) [J]. Ann Allergy, 1987, 59(3): 183-184.

[9] MARINAS D L, VILA L, SANZ L. Allergy to pine nuts[J]. Allergy, 1998, 53(2): 220-222.

[10] 蔣麗萍, 高吉喆. 松子仁蛋白提取工藝的研究[J]. 中國(guó)科技信息, 2005(23): 101.

[11] NERGIZ C, DONMEZ I. Chemical composition and nutritive value of Pinus pinea L. seeds[J]. Food Chemistry, 2004, 86(3): 365-368.

[12] 母智深, 白英, 趙廣華, 等. 熒光假單胞桿菌胞外蛋白酶的純化及熱穩(wěn)定性[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2008, 29(4): 762-766.

[13] 潘濱, 謝月霞, 戴君勇. 凡納濱對(duì)蝦蛋白酶的分離純化及生化特性[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2009, 28(12): 763-766.

[14] 黃光榮, 應(yīng)鐵進(jìn), 戴德慧, 等. 嗜熱芽孢桿菌蛋白酶HS08的分離純化研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(4): 179-181.

[15] AUSUBEL F M, BRENT R, KINGSTON R E, et a1. Current protocols in molecular biology[M]. Hoboken: John Wiley & Sons Inc, 1997: 1024-1068.

[16] 魏群. 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 2版. 北京: 北京高等教育出版社, 2007: 100-102.

[17] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J]. Anal Biochem, 1976, 72(1/2): 248-254.

[18] 戴志遠(yuǎn), 任明, 張燕平. 電泳和層析方法對(duì)梅魚蛋白酶解產(chǎn)物的分離分析[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2007, 7(4): 101-105.

[19] 周景祥, 王桂芹, 余濤. 蛋白酶和淀粉酶活性檢測(cè)方法探討[J]. 中國(guó)飼料, 2001(11): 23-24.

[20] 劉銘, 胡先成, 韓強(qiáng), 等. 河川沙塘鱧胚胎、仔魚發(fā)育過(guò)程中蛋白酶活性的變化[J]. 淡水漁業(yè), 2008(5): 39-41.

[21] 郝欣, 肖冬光, 郭學(xué)武, 等. 純生啤酒中酸性蛋白酶測(cè)定方法的優(yōu)化[J]. 釀酒科技, 2007(11): 98-99.

[22] 劉忠義. 草魚腸道胰蛋白酶(GT-A)的純化及其部分理化性質(zhì)初探[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2007, 35(10): 189-195.

[23] 曾小波, 伍麗瑜, 宋小焱, 等. 醬油曲蛋白酶的分離及催化性質(zhì)研究[J]. 中國(guó)調(diào)味品, 2010, 35(1): 50-52.

[24] 喇文軍. 蛋白質(zhì)、蛋白酶以及短肽類的分離提純技術(shù)及應(yīng)用[J]. 食品工程, 2008(1): 15-18.

[25] 吳曉紅, 華美玲, 石媛, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化脫脂松仁水溶性蛋白提取工藝[J]. 中國(guó)油脂, 2010, 35(8): 34-37.

Purif i cation and Properties of Protease from Brazilian Pine (Araucaria angustifolia (Bert) O. Ktze) Nuts

XIAO Li，YING Tie-jin*，CAI Lu-yun，HAN Xiao-xu
(College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)

An orthogonal array design was used to optimize conditions for the extraction of protease from Brazilian pine nuts. Boric acid-borate buffer was found to be the best solvent for the extraction of protease, and its optimum pH was 9.0. The optimum extraction time and solid-to-solvent ratio were 60 min and 1:8 (m/V), respectively. Pure protease was obtained from crude extract using salting out with ammonium sulfate followed by DEAE-Sepharose FF column chromatography. After purif i cation, the specif i c activity of protease increased 8.61-fold and the activity recovery was 21.65%. As shown by SDS-PAGE, the molecular mass of the enzyme was 33 kD. Enzymatic characterization demonstrated that it was an alkaline and its optimum reaction pH and temperature were 9.0 and 50 ℃, respectively. In addition, Mn2+had a strong activating effect on the enzyme, whereas Ca2+, Mg2+and Cu2+could inhibit its activity.

Brazilian pine nut；protease；purif i cation；protease activity

Q814.1

A

1002-6630(2013)01-0239-05

2011-11-03

肖麗(1986ü)，女，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與保鮮。E-mail：sichuanxiaoli@163.com

*通信作者：應(yīng)鐵進(jìn)(1958ü)，男，教授，博士，研究方向?yàn)楣卟珊蠓肿由飳W(xué)、果蔬貯運(yùn)技術(shù)。E-mail：tjying@zju.edu.cn