產(chǎn)β-葡萄糖苷酶甘草內(nèi)生菌的篩選及對(duì)甘草黃酮轉(zhuǎn)化的研究

張 琴，李艷賓,*，李 華

產(chǎn)β-葡萄糖苷酶甘草內(nèi)生菌的篩選及對(duì)甘草黃酮轉(zhuǎn)化的研究

張 琴1,2，李艷賓1,2,*，李 華1

甘草黃酮類成分是甘草重要的活性成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)心血管功能、增強(qiáng)免疫力等作用[1-3]，在醫(yī)藥、保健品、化妝品、食品添加劑等方面有廣泛應(yīng)用。自然界中黃酮化合物多以苷類形式存在，少部分為游離苷元[4]。目前已從甘草黃酮中鑒定出150余個(gè)化合物[5]，主要藥效成分為甘草素、異甘草素、甘草苷、異甘草苷4類[6]，其中甘草苷、異甘草苷是甘草素與異甘草素的酚羥基被葡萄糖以β-葡萄糖苷鍵聯(lián)接而成的糖苷型。

酚羥基是黃酮發(fā)揮作用的主要功能基團(tuán)，其一旦成苷，往往造成生物活性的降低甚至喪失[7-8]。且苷元的酚羥基被葡萄糖取代后，極性增大脂溶性降低，從而影響到藥效強(qiáng)度及藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程，導(dǎo)致生物利用度下降，人體吸收慢，不能很好發(fā)揮藥效[9-12]。針對(duì)黃酮糖苷和苷元的轉(zhuǎn)化，多采用醚化、酯化、?；然瘜W(xué)衍生反應(yīng)水解黃酮糖苷來(lái)生產(chǎn)苷元。但化學(xué)反應(yīng)過(guò)程易使苷類物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，水解產(chǎn)物復(fù)雜，且反應(yīng)過(guò)程易屏蔽掉酚羥基，降低黃酮抗氧化活性[13]。微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生豐富的酶系，通過(guò)微生物酶的催化作用，能使某些中藥的化學(xué)成分發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。微生物轉(zhuǎn)化法在沙棘黃酮、大豆異黃酮、苜蓿黃酮等方面已有較多研究[12,14-15]，但對(duì)甘草黃酮卻鮮有報(bào)道。

植物內(nèi)生菌是指定殖在健康植物體內(nèi)并與植物建立和諧關(guān)系的一類微生物，內(nèi)生菌不僅能夠參與植物次生成分的合成，還可對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化[16-17]。有學(xué)者對(duì)甘草內(nèi)生菌開展了相關(guān)研究，結(jié)果表明甘草中也有著數(shù)量較多的內(nèi)生菌[17-18]，但目前研究多集中在對(duì)甘草內(nèi)生菌資源的調(diào)查方面，而對(duì)其是否可作為甘草有效成分微生物轉(zhuǎn)化的菌種篩選源未見報(bào)道。為此本研究在分離與甘草生物相容性好的內(nèi)生菌的基礎(chǔ)上，從中篩選高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶微生物菌種，以期實(shí)現(xiàn)黃酮糖苷的有效轉(zhuǎn)化。同時(shí)結(jié)合本課題組前期初步探索出的微生物發(fā)酵處理從甘草渣中提取黃酮的工藝[19-20]，以期為后期建立甘草渣中黃酮的微生物同步提取與轉(zhuǎn)化提供菌種材料與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘草為新疆阿拉爾市附近野生脹果甘草(Glaycyrrhiza inf l аte Bat.)，于2009年5ü8月在不同生長(zhǎng)點(diǎn)采集。

甘草素、甘草苷、異甘草素、異甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98%)，購(gòu)自安徽蕪湖甙爾塔醫(yī)藥科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EQ-200粉碎機(jī) 武義縣屺立工具有限公司；GZX-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、PX-9272MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；AR1140精密電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SHZB金怡水浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；LDZX-50KB立式電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；DK-8D型電熱恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；721可見分光光度計(jì) 上海箐華科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 分離培養(yǎng)基

內(nèi)生細(xì)菌的分離采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；內(nèi)生真菌的分離用PDA培養(yǎng)基；內(nèi)生放線菌的培養(yǎng)基選用高氏1號(hào)。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

細(xì)菌培養(yǎng)基：CMC-Na 10g、蛋白胨10g、KH2PO42g、NaCl 2g、MgSO4g7H2O 0.04g、水1000mL，pH 7.0。

真菌及放線菌培養(yǎng)基：CMC-Na 10g、(NH4)2SO42g、KH2PO42g、NaAc 1g、CaCl20.5g、MgSO4g7H2O 0.2g、ZnCl20.02g、FeSO40.01g、CoCl20.017g、水1000mL，pH 5.6。

1.4 方法

1.4.1 甘草內(nèi)生菌的分離與純化

采集到的新鮮甘草植株洗凈，將根、莖、葉分開并裝入燒杯中，用2.5g/100mL的NaClO分別將根、莖浸泡5min、葉浸泡2min，無(wú)菌水沖洗3次后再用75%乙醇分別浸泡5min和1min，再用無(wú)菌水沖洗3～4次，最后1次清洗的水涂布至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板中檢查表面消毒效果。

經(jīng)表面消毒的甘草根莖葉分別用無(wú)菌粉碎機(jī)粉碎，取少量均勻撒在分離培養(yǎng)基上，細(xì)菌28℃、真菌與放線菌30℃條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天進(jìn)行觀察，菌體長(zhǎng)出后根據(jù)菌落及菌體形態(tài)以劃線法分別轉(zhuǎn)接至相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，最終得到純培養(yǎng)菌株。

1.4.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶內(nèi)生菌的篩選

1.4.2.1 產(chǎn)酶發(fā)酵條件

1.4.2.2 β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定

將發(fā)酵液在4500r/min離心15min，取上清酶液0.4mL，加入1.2mL 0.1mol/L的磷酸檸檬酸緩沖液(pH 5.0)、0.4mL 8mmol/L對(duì)硝基苯酚β-葡萄糖苷溶液充分混合，在45℃水浴鍋中反應(yīng)30min后加入2mL 0.5mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，在400nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[21]。以對(duì)硝基苯酚為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取2mL加入NaCO3溶液顯色后測(cè)定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，對(duì)硝基苯酚濃度(μmol/L)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y = 108.8x – 1.9629(R2= 0.9992)。

1.4.3 β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定

根據(jù)各菌株β-葡萄糖苷酶活測(cè)定結(jié)果，篩選出GF10、GF19兩株高酶活真菌。配制真菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，方法和培養(yǎng)條件同上，5次重復(fù)。從第2天起每天測(cè)定酶活力，連續(xù)測(cè)定10d，方法同前。

1.4.4 甘草黃酮微生物轉(zhuǎn)化及抗氧化測(cè)定

1.4.4.1 發(fā)酵粗酶液的制備

按GF10、GF19兩株菌的最佳產(chǎn)酶周期進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后6000r/min離心15min，并用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，既得粗酶液。每種菌重復(fù)3次，以未接菌培養(yǎng)基作空白對(duì)照。

調(diào)查歷代碑志文獻(xiàn)及歷代字書材料，我們發(fā)現(xiàn)“岡”既是“罔”的俗字，作為構(gòu)件時(shí)，又是“岡”的俗寫。以“罔”“岡”為構(gòu)件的字常出現(xiàn)同形相混現(xiàn)象，結(jié)果造成其俗訛字的對(duì)應(yīng)關(guān)系異常復(fù)雜，難以準(zhǔn)確分辨。因此，我們有必要徹底理清“罔”和“岡”演變過(guò)程，搞清楚同形字“岡”或構(gòu)件“岡”形成的原因及時(shí)間，總結(jié)其演變規(guī)律，以便為相關(guān)俗字辨析、漢字發(fā)展史研究和文獻(xiàn)整理提供切實(shí)參考。

1.4.4.2 甘草黃酮底物溶液的制備

[19]用80%乙醇從甘草渣中提取黃酮，在65℃條件下減壓蒸餾除去乙醇并定容，再經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，即得酶解底物。測(cè)得黃酮質(zhì)量濃度為0.135mg/mL。

1.4.4.3 甘草黃酮的轉(zhuǎn)化及抗氧化測(cè)定

將黃酮底物與粗酶液按體積比為3:1的比例在40℃水浴中酶解30min，結(jié)束后反應(yīng)液進(jìn)行DPPH自由基抗氧化實(shí)驗(yàn)，以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的黃酮溶液為對(duì)照。

DPPH抗氧化實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[22]，采用分光光度測(cè)定法。DPPH用70%的乙醇配制成6.5h10-5mol/L的溶液，取4mL DPPH乙醇溶液，加入0.8mL待測(cè)液，搖勻，室溫下反應(yīng)15min，在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記作Ai；取4mL 70%乙醇溶液，加入0.8mL待測(cè)液，反應(yīng)后測(cè)定吸光度，記作Aj；取4mL DPPH溶液，加入0.8mL蒸餾水，反應(yīng)后測(cè)定吸光度，記作A0。DPPH自由基清除率按下式計(jì)算。

1.4.4.4 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物組成成分分析

采用HPLC法檢測(cè)轉(zhuǎn)化前后黃酮溶液中甘草苷、甘草素、異甘草苷及異甘草素4種成分的含量。儀器設(shè)備為：Waters Alliance HPLC 2695；色譜條件為：色譜柱SinoChrom ODS-BP 5μm，柱溫25℃，柱壓3100psi，流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm。采用混合標(biāo)液進(jìn)樣，以甲醇-水為流動(dòng)相梯度洗脫，程序如表1所示。

表 1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradual elution program for HPLC separation

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：用甲醇分別配制甘草苷、甘草素、異甘草苷、異甘草素溶液，再取適量進(jìn)行混合，制備成不同濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，分別取10μL進(jìn)樣測(cè)定(其中甘草苷、異甘草苷質(zhì)量濃度分別為2、5、10、15、20μg/L，甘草素、異甘草素質(zhì)量濃度分別為1、2.5、5、7.5、10μg/L)，得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。甘草苷：Y=10100X–3880(R2=0.9987)；異甘草苷：Y=7060X–3710(R2=0.9986)；甘草素：Y=17400X–4080(R2=0.9984)；異甘草素：Y=14656X–3774.8(R2=0.9984)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草內(nèi)生菌的分離

從甘草根莖葉中共分離出47株甘草內(nèi)生菌，根據(jù)菌落形態(tài)及顯微鏡觀察結(jié)果，可分為內(nèi)生真菌22株(GF1～GF22)，內(nèi)生細(xì)菌12株(GB1～GB12)，內(nèi)生放線菌13株(GA1～GA13)，結(jié)果見表2。不同甘草組織中內(nèi)生菌的分布密度不同，其中根中的內(nèi)生真菌有12株，占真菌總數(shù)的54.55%；其次為莖，分離到8株內(nèi)生真菌，占36.36%；葉中最少，分離到2株內(nèi)生真菌。內(nèi)生放線菌也以莖和根中較多，分離到的菌株數(shù)分別占到46.15%和38.46%，葉中內(nèi)生放線菌較少。內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量則以葉中最多，分離到5株，占細(xì)菌總數(shù)的41.67%，根中相對(duì)最少。

表 2 甘草不同部位內(nèi)生菌的分離結(jié)果Table 2 Results of endophyte isolation from different parts of Glycyrrhiza inf l ate

2.2 甘草內(nèi)生菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選

對(duì)分離所得47株甘草內(nèi)生菌進(jìn)行了β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多數(shù)內(nèi)生菌都能產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，細(xì)菌、放線菌的酶活普遍較低，而甘草內(nèi)生真菌的產(chǎn)酶能力普遍較好，其中GF10和GF19兩株真菌酶活力分別高達(dá)18.63、18.04U，顯著高于其余菌株，兩株菌均分離自甘草根中。經(jīng)廣東微生物所鑒定兩株菌分別為泡盛曲霉(Aspergillus awamori)和構(gòu)巢曲霉(Emericella nidulans)，選擇此兩株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)的測(cè)定

圖 1 GF10(A)和GF19(B)的β-葡萄糖苷酶產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1β-Glucosidase production kinetics of GF10 and GF19

由圖1可知，GF10在發(fā)酵8d內(nèi)，酶活力總體呈增大趨勢(shì)，在第8天時(shí)達(dá)到最高，此后酶活力開始下降，所以初步確定GF10的最佳發(fā)酵時(shí)間為8d。GF19在第4天達(dá)到產(chǎn)酶高峰，此后酶活稍有降低并趨于平穩(wěn)，因此選擇4d為其最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.4 β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株酶轉(zhuǎn)化對(duì)甘草黃酮抗氧化活性的影響

圖 2 GF10、GF19產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化甘草黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率比較Fig.2 DPPH radical scavenging rates of fl avonoids before and after transformation

由圖2可知，經(jīng)β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化之后的黃酮溶液對(duì)DPPH自由基的清除率均有顯著增加(P＜0.01)，GF10、GF19兩株菌轉(zhuǎn)化后黃酮的DPPH自由基清除率分別為71.67%、65.94%，比未經(jīng)轉(zhuǎn)化黃酮對(duì)照的清除率(20.68%)分別提高了246.57%、218.86%?？梢?，通過(guò)β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)化，能夠有效提高甘草黃酮的抗氧化活性。

2.5 β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化前后甘草黃酮檢測(cè)的主要組成成分

表 3 轉(zhuǎn)化前后黃酮溶液中甘草苷、甘草素、異甘草苷及異甘草素的含量(x±s,n＝3)Table 3 Concentrations of liquiritin, isoliquiritin, liquiritigenin and isoliquiritigenin before and after transformation (x±s,n＝3)

由表3可知，相對(duì)于未經(jīng)轉(zhuǎn)化的對(duì)照，經(jīng)微生物酶轉(zhuǎn)化后的處理中甘草苷與異甘草苷的含量均有不同程度的降低，其中甘草苷下降的程度達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，同時(shí)甘草素和異甘草素的含量增加極顯著(P＜0.01)。其中，菌株GF19轉(zhuǎn)化處理中的甘草素所占的比例最高，為29.18%，比轉(zhuǎn)化前的(10.38%)提高了181.12%；異甘草素比例最高的是GF10處理，為8.64%，比轉(zhuǎn)化前(4.27%)提高了102.34%。

3 結(jié) 論

在天然活性物質(zhì)利用的過(guò)程中，往往通過(guò)理化或生物方法有意識(shí)地將其中的低效成分轉(zhuǎn)化為高效成分。黃酮糖苷轉(zhuǎn)化為苷元的途徑主要有化學(xué)法及生物法，其中生物轉(zhuǎn)化法備受關(guān)注，它是在溫和的條件下發(fā)生作用，能克服化學(xué)反應(yīng)的缺點(diǎn)，減少產(chǎn)物分解、異構(gòu)、消旋和重排反應(yīng)等不利因素，增加目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。生物轉(zhuǎn)化法又主要有酶解轉(zhuǎn)化與微生物轉(zhuǎn)化兩類，酶的專一性強(qiáng)，水解效率高，反應(yīng)條件溫和，得到的苷元產(chǎn)品穩(wěn)定，因此被廣泛用于黃酮苷元的水解制備[23-24]。微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中可產(chǎn)生多種酶類，且很多為分泌型胞外酶，這些種類豐富而活性顯著的酶系可將黃酮糖苷分解轉(zhuǎn)化為苷元。與酶解轉(zhuǎn)化相比，微生物轉(zhuǎn)化省去了酶分離純化的環(huán)節(jié)，可以有效節(jié)省成本，且微生物產(chǎn)生的是復(fù)合酶系，可保證水解反應(yīng)是在各種酶有機(jī)組合的條件下進(jìn)行的，這比單一酶或簡(jiǎn)單幾種酶組合的水解效率要高。相比較而言，微生物轉(zhuǎn)化法更具應(yīng)用前景，也因此成為近年來(lái)許多學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一[9,12,15]。

在黃酮苷類的微生物轉(zhuǎn)化工藝中，轉(zhuǎn)化菌種的選擇十分關(guān)鍵。植物體內(nèi)有著種類、功能均十分豐富的內(nèi)生菌，本研究從甘草根莖葉中分離得到數(shù)量較多的內(nèi)生細(xì)菌、真菌和放線菌，并從中篩選得到高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶真菌2株，對(duì)甘草黃酮的轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，黃酮糖苷得到有效水解，苷元含量顯著增加，抗氧化活性顯著增強(qiáng)，證實(shí)甘草黃酮能利用微生物轉(zhuǎn)化法進(jìn)行結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，甘草內(nèi)生菌可作為轉(zhuǎn)化菌種的有效篩選源。與自然界中其他微生物相比，由于長(zhǎng)期進(jìn)化的關(guān)系，內(nèi)生菌與寄主植物具有很好的生物相容性，不會(huì)受到寄主體內(nèi)代謝產(chǎn)物的抑制，所以選用內(nèi)生菌進(jìn)行黃酮結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化更能保證反應(yīng)高效進(jìn)行。由于目前甘草黃酮的提取源主要是甘草渣，結(jié)合甘草渣中黃酮的微生物法提取工藝[19-20]，下一步將開展分離提取菌種與轉(zhuǎn)化菌種同步發(fā)酵的工藝研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 田慶來(lái), 官月平, 張波, 等. 甘草有效成分的藥理作用研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2006, 18(2): 343-347.

[2] LI Defang, WANG Zhenhua, CHEN Hongmei, et al. Isoliquiritigenin induces monocytic differentiation of HL-60 cells[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2009, 46(6): 731-736.

[3] CHIN Y W, JUNG H A, LIU Yue, et al. Anti-oxidant constituents of the roots and stolons of licorice (Glycyrrhiza glabra)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(12): 4691-4697.

[4] 王建偉, 李岱龍, 孫君社. 銀杏葉提取物中黃酮苷酶法轉(zhuǎn)化苷元的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(4): 177-179.

[5] 邢國(guó)秀, 李楠, 王童, 等. 甘草中黃酮類化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2003, 28(7): 593-597.

[6] 張雪輝, 趙元芬, 陳建民. 甘草中總黃酮的含量測(cè)定[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2001, 26(11): 746-747; 796.

[7] MATSUDA H, MORIKAWA T, TOGUCHIDA I, et al. Structural requirements of fl avonoids and related compounds for aldose reductase inhibitory activity[J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2002, 50(6): 788-795.

[8] 陳季武, 胡斌, 趙實(shí), 等. 天然黃酮類化合物清除DPPH?的構(gòu)效關(guān)系[J]. 發(fā)光學(xué)報(bào), 2005, 26(5): 664-668.

[9] 徐萌萌, 王建芳, 徐春, 等. 微生物轉(zhuǎn)化苷類中藥的機(jī)理及應(yīng)用[J].世界科學(xué)技術(shù): 中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2006, 8(2): 24-27.

[10] KANAZE F I, BOUNARTZI M I, GEORGARAKIS M, et al. Pharmacokinetics of the citrus flavanone aglycones hesperetin and naringenin after single oral administration in human subjects[J]. European Journal of Clinical Nutrition, 2007, 61(4): 472-477.

[11] LIU Zhongqiu, JIANG Zhihong, LIU Liang, et al. Mechanisms responsible for poor oral bioavailability of paeoniflorin: role of intestinal disposition and interactions with sinomenine[J]. Pharmaceutical Research, 2006, 23(12): 2768-2780.

[12] 涂紹勇, 李鳳嬌, 楊愛華. 微生物轉(zhuǎn)化沙棘黃酮苷生成黃酮苷元的研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(19): 221-224.

[13] 劉萍, 鄭亞安, 王怡新. 沙棘葉黃酮糖苷生物轉(zhuǎn)化黃酮苷元研究[J].高校化學(xué)工程學(xué)報(bào), 2006, 20(6): 996-1000.

[14] 王佳, 石波, 王亞生, 等. 苜蓿黃酮的分離及其生物轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng), 2010(1): 68-70.

[15] 孫艷, 莊逢源. 大豆異黃酮的微生物轉(zhuǎn)化[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2005, 32(5): 147-150.

[16] STROBEL G A. Endophytes as sources of bioactive products[J]. Microbes and Infection, 2003, 5(6): 535-544.

[17] 宋素琴, 歐提庫(kù)爾g瑪合木提, 張志東, 等. 新疆脹果甘草內(nèi)生菌的分離和鑒定[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2007, 34(5): 867-870.

[18] 張敏, 沈德龍, 饒小莉, 等. 甘草內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2008, 35(4): 524-528.

[19] 李艷賓, 張琴, 賀江舟, 等. 云芝發(fā)酵處理對(duì)甘草渣中總黃酮提取的影響[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(11): 182-186.

[20] 李艷賓, 張琴, 陶呈宇, 等. 微生物發(fā)酵提高甘草渣中黃酮類物質(zhì)提取率的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2010, 31(9): 156-159.

[21] 孫艷梅. β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷的研究[D]. 沈陽(yáng): 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2003.

[22] 陳旭丹, 于曉瑩, 郝曉萌, 等. 三種黃酮類化合物抗自由基的研究[J].食品研究與開發(fā), 2007, 28(6): 20-22.

[23] 陳慶慶, 夏黎明. 固定化β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化糖苷型異黃酮的研究[J].高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào), 2007, 21(2): 304-309.

[24] 高榮海, 李長(zhǎng)彪, 孟憲文, 等. 大豆異黃酮糖苷水解工藝的研究[J].中國(guó)油脂, 2007, 32(5): 52-55.

(1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué) 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300)

對(duì)甘草內(nèi)生菌進(jìn)行分離，并從中進(jìn)行高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選，以利用微生物轉(zhuǎn)化法將甘草黃酮糖苷水解成苷元，提高其抗氧化活性。結(jié)果從分離純化出的47株甘草內(nèi)生菌中篩選得到GF10和GF19兩株高β-葡萄糖苷酶活性真菌，兩株菌對(duì)甘草黃酮的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：轉(zhuǎn)化后黃酮的抗氧化活性均有顯著增加，GF10、GF19對(duì)DPPH自由基的清除率分別達(dá)到71.67%、65.94%，比未經(jīng)轉(zhuǎn)化黃酮的清除率(20.68%)分別提高了246.57%、218.86%。對(duì)甘草黃酮主要成分的HPLC法檢測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后，甘草苷與異甘草苷的質(zhì)量濃度均有不同程度的降低，而甘草素和異甘草素的質(zhì)量濃度則顯著增加。其中GF19轉(zhuǎn)化的處理，甘草素在4種黃酮物質(zhì)中所占的比例最高，為29.18%，比轉(zhuǎn)化前(10.38%)提高了181.12%；異甘草素比例最高的處理是GF10，為8.64%，比轉(zhuǎn)化前(4.27%)高出102.34%。

甘草；內(nèi)生菌；β-葡萄糖苷酶；甘草黃酮；轉(zhuǎn)化

Isolation of β-Glucosidase-Producing Endophytes from Glycyrrhizа inf l аte and Their Effects on Flavonoid Transformation

ZHANG Qin1,2，LI Yan-bin1,2,*，LI Hua1
(1. College of Life Science, Tarim University, Alar 843300, China；2. Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin, Tarim University, Alar 843300, China)

Forty-seven endophytes were isolated from different parts (root, stem and leaf) of Glycyrrhiza inflate and potent 2 β-glucosidase-producing strains, designated as GF10 and GF19, were screened out of them. GF10 and GF19 were comparatively evaluated for their effectiveness in microbial transformation of flavonoid glucosides in Glycyrrhiza inflate into aglycones to obtain higher antioxidant activity. Both strains could increase the antioxidant activity of fl avonoids, and the DPPH radical scavenging rates after fermentation with them were 71.67% and 65.94%, respectively, which were 246.57% and 218.86% higher than before fermentation (20.68%). HPLC analysis showed that the concentrations of liquiritin and isoliquiritin decreased to different extents after microbial transformation, whereas the concentrations of liquiritigenin and isoliquiritigenin signif i cantly increased. Liquiritigenin was the most abundant among four fl avonoids with a percentage of 29.18% after GF19 transformation, which was 181.12% higher than the original level (10.38%), while GF10 transformation made isoliquiritigenin the most dominant fl avonoid and its percentage was increased from its original level (4.27%) to 8.64% by 102.34%.

licorice；endophytes；β-glucosidase；licorice fl avonoids；transformation

TS201.1；Q939.9

A

1002-6630(2013)01-0194-05

2011-10-19

新疆兵團(tuán)青年科技創(chuàng)新資金專項(xiàng)(2010JC38)；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(BR0804)

張琴(1980ü)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸镛D(zhuǎn)化。E-mail：jhtabszq@163.com

*通信作者：李艷賓(1983ü)，男，講師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。E-mail：ydhant@163.com