章魚腸道產(chǎn)蛋白酶菌的篩選、產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)

任 佩，金玉蘭，樸美子,*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東 青島 266109)

章魚腸道產(chǎn)蛋白酶菌的篩選、產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)

任 佩1，金玉蘭2，樸美子1,*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東 青島 266109)

采用檢測(cè)水解透明圈和測(cè)定蛋白酶活力的方法，從章魚腸道中分離篩選出一株高產(chǎn)蛋白酶的菌株QDV-3，并對(duì)其產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：QDV-3菌株在以果糖為碳源，蛋白胨為氮源，培養(yǎng)基初始pH8.0，培養(yǎng)溫度30℃的條件下振蕩培養(yǎng)3.5d時(shí)，所產(chǎn)蛋白酶活力最高，Mn2+和Ba2+對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶有促進(jìn)作用。所產(chǎn)蛋白酶在SDS-PAGE電泳上顯示至少有5種蛋白酶，分子質(zhì)量范圍為32.4～124.2kD，蛋白酶的最適作用溫度為50～60℃，最適作用pH值為9～11，在50℃條件下保溫1h，剩余酶活力為95%，熱穩(wěn)定性較好。

產(chǎn)蛋白酶菌；蛋白酶；酶學(xué)性質(zhì)

蛋白酶主要來源于動(dòng)物、植物和微生物，微生物產(chǎn)的蛋白酶約占世界范圍內(nèi)蛋白酶總產(chǎn)量的60%[1]，廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品加工、醫(yī)藥、絲綢及廢物利用等各個(gè)領(lǐng)域[2-3]。產(chǎn)蛋白酶的微生物有很多種，包括細(xì)菌、真菌、酵母菌和放線菌等，工業(yè)用蛋白酶主要來源于芽孢桿菌，如Alcalase等。

魚類腸道中存在大量的細(xì)菌等微生物群落，這些共生菌能夠分泌各種酶類輔助消化食物，國內(nèi)外對(duì)消化道中產(chǎn)蛋白酶微生物的研究已有報(bào)道[4-7]，王福強(qiáng)等[8]從牙鲆腸道內(nèi)篩選出25株產(chǎn)蛋白酶的菌株，其中4株產(chǎn)酶活力特別強(qiáng)，有望作為益生菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。馮新忠[9]從額爾齊斯河野生丁鰄產(chǎn)道中分離出40株蛋白酶產(chǎn)生菌，并對(duì)產(chǎn)蛋白酶活性最高的菌株進(jìn)行了產(chǎn)酶條件的研究，但目前從章魚腸道菌中獲得蛋白酶并對(duì)蛋白酶性質(zhì)進(jìn)行研究尚未見報(bào)道，章魚(Octopus vulgaris)屬軟體動(dòng)物門頭足綱動(dòng)物，學(xué)名蛸，俗稱八爪魚、八帶魚[10]，主要以貝類、蝦蟹為主食。本實(shí)驗(yàn)從章魚腸道中分離篩選出高產(chǎn)蛋白酶菌株，并對(duì)產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為該菌株及微生物蛋白酶的工業(yè)應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

章魚購于青島市城陽區(qū)水產(chǎn)品市場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)前于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)3d，暫養(yǎng)溫度＜10℃，暫養(yǎng)期間不喂食，每天換水2次。

選擇培養(yǎng)基：2216E培養(yǎng)基[11]、VNSS培養(yǎng)基[11]；酪蛋白培養(yǎng)基：酪蛋白1%、酵母膏0.1%、瓊脂1.5%、pH7.2、海水配制；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%、酵母膏0.1%、磷酸高鐵0.01%、pH7.6～7.8、海水配制；偶氮酪蛋白(azocasein)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、SDS、過硫酸銨(AP)、TEMED等電泳相關(guān)試劑及標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品 美國Sigma公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DU-800型紫外分光光度計(jì) 美國貝克曼公司；TGL-16M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；DHP-9032電熱恒溫培養(yǎng)箱 中國龍口市先科儀器有限公司；IS-RDV3立式恒溫振蕩器 美國精騏有限公司。

1.3 方法

1.3.1 初篩

將活章魚解剖，取其腸道，用無菌海水沖洗數(shù)次，去掉腸道雜物，將腸道剪碎，加入少量無菌海水研磨，得到菌液原液，將原液稀釋成10-1、10-2濃度梯度，分別涂布于2216E培養(yǎng)基和VNSS培養(yǎng)基上，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

挑取培養(yǎng)基上的單菌落，稀釋劃線培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)1d，得到純的單菌落，將單菌落點(diǎn)種于酪蛋白培養(yǎng)基上，觀察各菌株產(chǎn)透明圈情況。

1.3.2 復(fù)篩

將產(chǎn)透明圈的菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基上，于25℃搖瓶培養(yǎng)3d，4℃、10000r/min離心15min，取上清液，測(cè)定上清液的蛋白酶活力，篩選出產(chǎn)蛋白酶活力最高的菌株，作為出發(fā)菌株。

1.3.3 蛋白酶活力測(cè)定方法

采用偶氮酪蛋白法[12]，0.1%偶氮酪蛋白溶于0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液中作為底物，37℃條件下測(cè)定酶活力。

1.3.4 最適發(fā)酵條件

1.3.4.1 不同碳源和氮源對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

在液體發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加質(zhì)量濃度為0.5g/100mL的葡萄糖、果糖、乳糖、淀粉、蔗糖作為碳源，考察不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響。在確定最適碳源后，分別以質(zhì)量濃度為0.5g/100mL的蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨、硝酸鈉、酪蛋白作為氮源，考察不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響，培養(yǎng)條件均為25℃、180r/min搖瓶培養(yǎng)3d，4℃、6000r/min離心15min，除去菌體。

1.3.4.2 培養(yǎng)基起始pH值對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

調(diào)節(jié)培養(yǎng)基起始pH值分別為5、6、7、8、9、10、11，在25℃、180r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)3d，在4℃、6000r/min條件下離心15min，除去菌體，測(cè)定上清液的蛋白酶活力。

1.3.4.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶活力的影響

將菌株在25℃、180r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，每12h取樣，4℃、6000r/min離心15min，除去菌體，測(cè)定上清液的蛋白酶活力。

1.3.4.4 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶活力的影響

將菌株分別在20、25、30、35、40、45、50℃的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，在4℃、6000r/min條件下離心15min，除去菌體，測(cè)定上清液的蛋白酶活力。

1.3.4.5 金屬離子及表面活性劑對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶活力的影響

在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+及表面活性劑吐溫-80和聚乙二醇，考察金屬離子和表面活性劑對(duì)菌株及蛋白酶活力的影響，發(fā)酵結(jié)束后在4℃、6000r/min條件下離心15min，除去菌體，測(cè)定上清液的蛋白酶活力。

1.3.5 酶學(xué)性質(zhì)

1.3.5.1 粗酶液制備

將QDV-3菌株在1.3.4節(jié)得出的最適發(fā)酵條件下進(jìn)行液體發(fā)酵，發(fā)酵液在4℃、6000r/min條件下離心15min去除菌體得到上清液，記為粗酶液。

1.3.5.2 SDS-PAGE電泳

制備濃縮膠為3.75%，分離膠為12.5%，膠片厚度為1.0mm的膠對(duì)粗酶液進(jìn)行電泳。電泳完成后，將分離膠置于復(fù)性緩沖液(2.5% TritonX-100)中在4℃條件下浸泡30min以恢復(fù)蛋白酶的活性，再置于3.0g/100mL的酪蛋白中4℃條件下浸泡1h，在反應(yīng)緩沖液(0.1mol/L Tris-HCl、pH8.0)中37℃振蕩反應(yīng)3h。然后進(jìn)行染色和脫色，觀察膠片上蛋白酶的顯色程度，蛋白酶反應(yīng)部位有亮白色條帶，其余部分為深藍(lán)色。

將蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品在進(jìn)行完電泳后單獨(dú)切下進(jìn)行常規(guī)的染色和脫色，粗酶液則進(jìn)行上述活性處理，根據(jù)相對(duì)遷移率和分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)關(guān)系，做出蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性方程，計(jì)算出蛋白酶條帶的分子質(zhì)量。

1.3.5.3 溫度和pH值對(duì)蛋白酶活力的影響

將粗酶液分別在10～80℃的條件下進(jìn)行酶活力的測(cè)定。確定最適溫度后，在37℃、pH7～13的條件下分別測(cè)定酶活力，其中pH7～9緩沖液采用0.1mol/L Tris-HCl緩沖體系，pH10～13緩沖液采用0.1mol/L Gly-NaOH緩沖體系。

1.3.5.4 蛋白酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定

將粗酶液分別在10～80℃條件下保溫60min，在37℃、pH8.0的條件下測(cè)定其剩余酶活力，以未處理的蛋白酶為對(duì)照，記為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

酪蛋白培養(yǎng)基上水解透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值(D/d比值)越大說明產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。菌株的初篩結(jié)果如表1所示，共得到6株在酪蛋白培養(yǎng)基上產(chǎn)透明圈的菌株，其中VNSS培養(yǎng)基篩選出來2株，分別為命名QDV-1和QDV-3。2216E培養(yǎng)基篩選出來的菌株為4株，分別為QDE-1、QDE-2、QDE-5、QDE-7。其中QDV-3和QDE-5菌株所產(chǎn)透明圈直徑和菌落直徑比值較大。

表 1 章魚腸道產(chǎn)蛋白酶菌株初篩結(jié)果(±s,n＝3)Table 1 Results of primary screening of 6 protease-producing bacterial strains from Octopus vulgaris intestine(±s,n＝3)

表 1 章魚腸道產(chǎn)蛋白酶菌株初篩結(jié)果(±s,n＝3)Table 1 Results of primary screening of 6 protease-producing bacterial strains from Octopus vulgaris intestine(±s,n＝3)

菌落編號(hào)透明圈直徑D/mm菌落直徑d/mmD/d值QDV-115.9f0.46.7f0.42.2f0.2 QDV-322.8f0.65.4f0.44.2f0.2 QDE-18.2f0.24.6f0.41.5f0.3 QDE-210.0f0.35.2f0.41.9f0.0 QDE-528.8f0.66.3f0.44.4f0.0 QDE-719.5f1.05.9f0.43.3f0.0

圖 1 菌株產(chǎn)蛋白酶能力的比較Fig.1 Comparison of protease production by 6 bacterial strains

將初篩得到的6株菌株分別接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基上，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定各發(fā)酵液的蛋白酶活力，結(jié)果如圖1所示，其中QDV-3菌株產(chǎn)的蛋白酶活力最高，其次為QDE-5和QDE-7菌株，蛋白酶活力分別為85.7、71.5、69.0U/mL，綜合水解透明圈和酶活力2個(gè)因素，選擇QDV-3菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 不同碳源和氮源對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

不同碳源對(duì)QDV-3菌株產(chǎn)蛋白酶的影響，結(jié)果如圖2所示，以果糖為碳源時(shí)酶活力最高，其次是淀粉，說明該菌株能有效利用果糖，且能夠既產(chǎn)蛋白酶又產(chǎn)淀粉酶。消化道中的菌落常常會(huì)產(chǎn)多種酶幫助消化食物，王瑞旋等[13]從軍曹魚腸道中分離出8株既產(chǎn)蛋白酶又產(chǎn)淀粉酶的菌株。

圖 2 不同碳源對(duì)產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.2 Effect of carbon source on protease production

圖 3 不同氮源對(duì)產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on protease production

如圖3所示，蛋白胨作為氮源時(shí)菌株所產(chǎn)蛋白酶活力最高，該結(jié)果與其他研究者[14]結(jié)果相同，其次是牛肉膏。硫酸銨等無機(jī)氮源作為氮源時(shí)，蛋白酶的合成量很低，說明菌株能較好地利用營養(yǎng)物質(zhì)豐富的有機(jī)氮源而對(duì)無機(jī)氮源利用率不高，因?yàn)闊o機(jī)氮源被快速代謝利用，抑制蛋白酶的合成。

2.2.2 初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

圖 4 培養(yǎng)基起始pH值對(duì)產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.4 Effect of initial medium pH on protease production

如圖4所示，培養(yǎng)基的初始pH值為8時(shí)，粗酶液中蛋白酶活力最高，QDV-3菌株可以在較廣的pH值范圍內(nèi)產(chǎn)蛋白酶，pH值在中性和偏堿性的條件下菌株所產(chǎn)蛋白酶活力均很高。

2.2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

如圖5所示，QDV-3菌株可在25～40℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)，最適培養(yǎng)溫度為30℃，屬于中溫菌，菌株的最適溫度與章魚生長(zhǎng)的水溫及飲食均有關(guān)系。

圖 5 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on protease production

2.2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

圖 6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.6 Effect of fermentation time on protease production

如圖6所示，發(fā)酵第0～2天為QDV-3菌株生長(zhǎng)期，不合成蛋白酶，發(fā)酵第2.5天時(shí)菌株開始產(chǎn)蛋白酶，第3.5天時(shí)合成的蛋白酶量最大，酶活力最高且之后趨于穩(wěn)定，因此QDV-3菌株的最適發(fā)酵時(shí)間為3.5d。

2.2.5 金屬離子及表面活性劑對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

如表2所示，Mn2+與Ba2+對(duì)QDV-3菌株產(chǎn)蛋白酶有促進(jìn)作用，適量的Mn2+可促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)和酶的生成，表面活性劑對(duì)QDV-3菌株產(chǎn)蛋白酶無明顯影響，Zn2+和Cu2+對(duì)QDV-3菌株產(chǎn)蛋白酶有顯著抑制作用。這與馮新忠[9]從額爾齊斯河野生丁鰄腸道中分離篩選的產(chǎn)蛋白酶菌株性質(zhì)相似。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 分子質(zhì)量的測(cè)定

如圖7所示，QDV-3菌株產(chǎn)的蛋白酶在SDS-PAGE電泳上顯示有5條亮帶，條帶較寬，說明至少有5種蛋白酶，分子質(zhì)量范圍32.4～124.2kD。河流弧菌TKU005產(chǎn)的2種蛋白酶分子質(zhì)量分別為41kD和39kD[15]，Rahman等[16]從銅綠假單胞菌K產(chǎn)的蛋白酶中分離純化出一種堿性蛋白酶，分子質(zhì)量為51kD。

2.3.2 最適溫度和pH值的測(cè)定

圖 8 溫度對(duì)蛋白酶活性的影響Fig.8 Effect of temperature on protease activity

如圖8所示，粗酶液中蛋白酶的最適溫度為50～60℃，這是多種蛋白酶綜合作用的結(jié)果，屬于中溫蛋白酶，微生物產(chǎn)蛋白酶的最適作用溫度一般為30～75℃，不同屬的細(xì)菌所產(chǎn)的蛋白酶最適溫度不同，芽孢桿菌屬所產(chǎn)的蛋白酶相對(duì)耐熱，如短芽孢桿菌產(chǎn)的蛋白酶的最適溫度為55℃[17]。

圖 9 pH值對(duì)蛋白酶活性的影響Fig.9 Effect of pH on protease activity

如圖9所示，粗酶液中蛋白酶的作用pH值范圍較寬，最適作用pH值為9～11。在pH值范圍為7～13時(shí)，剩余酶活力比較高，且在pH13的強(qiáng)堿溶液中仍能保持80%的活性，表明QDV-3菌株所產(chǎn)蛋白酶為堿性蛋白酶[14]。

表 2 金屬離子及表面活性劑對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響Table 2 Effects of metal ions and surfactants on protease production

2.3.3 熱穩(wěn)定性的測(cè)定

圖 10 蛋白酶的熱穩(wěn)定性Fig.10 Thermal stability of proteases

如圖10所示，QDV-3菌株所產(chǎn)蛋白酶熱穩(wěn)定性較好，低于50℃時(shí)能酶活力保持在95%以上，60℃時(shí)能保持70%的酶活力，比摩加夫芽孢桿菌A21產(chǎn)的堿性蛋白酶熱穩(wěn)定性好[18]。細(xì)菌和真菌所產(chǎn)蛋白酶的熱穩(wěn)定不同，真菌產(chǎn)的蛋白酶熱穩(wěn)定性較低，而細(xì)菌產(chǎn)的蛋白酶較耐熱[19]。

3 結(jié) 論

從章魚腸道中分離篩選出了一株高產(chǎn)蛋白酶的菌株QDV-3，對(duì)該菌株的產(chǎn)酶條件以及所產(chǎn)蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，QDV-3菌株在以果糖為碳源、蛋白胨為氮源、培養(yǎng)基初始pH8.0、培養(yǎng)溫度30℃的條件下振蕩培養(yǎng)3.5d時(shí)，所產(chǎn)蛋白酶活力最高，Mn2+和Ba2+對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶有促進(jìn)作用，所產(chǎn)蛋白酶在SDSPAGE電泳上顯示至少有5種蛋白酶，分子質(zhì)量范圍為32.4～124.2kD，蛋白酶的最適作用溫度為50～60℃，最適作用pH值為9～11，熱穩(wěn)定性較好。本研究旨在篩選出高產(chǎn)蛋白酶的菌株，所產(chǎn)的蛋白酶可大量獲得，經(jīng)研究為堿性蛋白酶，具有活性高、耐熱、耐堿、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，具有很大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，可作為復(fù)合酶系用于蛋白質(zhì)水解獲得活性多肽或添加到飼料中用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，也可應(yīng)用于洗滌行業(yè)中。

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Screening of Protease-Producing Bacterium from Octopus vulgaris Intestine, Fermentation Conditions and Enzymatic Properties

REN Pei1，JIN Yu-lan2，PIAO Mei-zi1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China；2. College of Chemistry and Pharmacy, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

A protease-producing bacterial strain was isolated and screened from the intestine of Octopus vulgaris by detecting hydrolysis circle of protease and its activity and identif i ed as QDV-3. The optimal fermentation conditions for protease production and its enzymatic properties were also investigated. The highest protease production was achieved when strain QDV-3 was cultured at 30 ℃ for 3.5 d under shaking conditions in a medium at pH 8.0 with fructose as the carbon source and peptone as the nitrogen source. Meanwhile, protease production was improved in the presence of Mn2+and Ba2+. At least fi ve proteases were identif i ed by SDS-PAGE, with molecular weights between 32.4 kD and 124.2 kD. The optimal reaction temperature and pH for the fermentation supernatant were 50ü60 ℃ and 9ü11, respectively. The fermentation supernatant exhibited high thermal stability, and 95% of its initial activity was retained after 1 h incubation at 50 ℃.

protease-producing bacterial strain；protease；enzymatic properties

TS201.3

A

1002-6630(2013)01-0189-05

2011-11-16

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2011CM023)

任佩(1985ü)，女，碩士，研究方向?yàn)楣δ苄允称?。E-mail：renpei1011@163.com

*通信作者：樸美子(1966ü)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苄允称贰-mail：piaomeizi2009@126.com