酶解制備菜籽蛋白肽條件的優(yōu)化

易起達，王茜茜，王立峰，高瑀瓏，袁 建，鞠興榮*

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210023)

酶解制備菜籽蛋白肽條件的優(yōu)化

易起達，王茜茜，王立峰，高瑀瓏，袁 建，鞠興榮*

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210023)

選用堿性蛋白酶Alcalase對菜籽蛋白進行水解。在單因素試驗研究不同處理條件對菜籽蛋白水解度和菜籽蛋白肽得率的影響的基礎(chǔ)上，建立單因素對菜籽蛋白肽水解度影響的數(shù)學(xué)模型，通過響應(yīng)面分析對酶解條件進行優(yōu)化。確定菜籽蛋白酶解最佳工藝條件為：底物質(zhì)量分數(shù)為4.49%、pH8.45、溫度55℃、酶解時間180min、加酶量5000U/g pro，在該優(yōu)化條件下，菜籽蛋白水解度理論值可達15.00%，實際值為14.71%。

菜籽蛋白肽；堿性蛋白酶Alcalase；水解度；響應(yīng)面分析

我國油菜種植面積和總產(chǎn)量均長期居世界第一位，占世界油菜種植面積和總產(chǎn)量的30%左右[1]，油菜籽中的菜籽蛋白為完全蛋白質(zhì)，幾乎不存在限制氨基酸，從蛋白質(zhì)氨基酸組成來看，必需氨基酸組成極為均衡，約占氨基酸總量的37%～38%[2]。菜籽肽是以菜籽蛋白為原料通過其降解得到的一種低分子肽混合物，與其他植物蛋白相比具有明顯營養(yǎng)互補優(yōu)勢[3]。菜籽蛋白水解得到的多肽不僅具有良好的低黏度、酸溶性、抗凝膠形成性，而且在體內(nèi)消化吸收快，蛋白質(zhì)利用效率高[4]。菜籽蛋白肽具有低抗原性和良好的生理活性，能夠避免過敏性反應(yīng)。目前國內(nèi)外已有研究表明，菜籽蛋白經(jīng)過降解所形成的菜籽肽具有降血壓[5]、抗氧化[6-7]、抗腫瘤[8-9]、促細胞生長[10]等多種生物活性，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用開發(fā)前景。

菜籽粕經(jīng)堿溶酸沉法提取菜籽蛋白，然后制備菜籽肽，可以有效去除非蛋白雜質(zhì)成分，得到純度較高的菜籽肽。但是這種方法的主要缺陷是蛋白提取過程有蛋白損失。蛋白在酶解時濃度較高，水解產(chǎn)物在酶的作用下會進一步聚集，水解度不高，得率較低，從而造成生產(chǎn)成本上升[11]。堿性蛋白酶Alcalase作為一種內(nèi)切蛋白酶，主要用于水解各種蛋白質(zhì)，該酶的酶解效率高，且具有高度的操作安全性[12]。本研究中，采用堿性蛋白酶Alcalase對菜籽蛋白酶解， 選定酶解pH值、加酶量和底物質(zhì)量分數(shù)進行三因素三水平中心組合試驗，通過Design Expert7.0軟件進行響應(yīng)面分析，得出最佳工藝參數(shù)，為菜籽肽的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

國產(chǎn)普通雙低油菜籽 益海嘉里公司。

堿性蛋白酶(Alcalase液態(tài)，酶活力≥2.4AU/g) 美國Sigma公司；甲醇、氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、硫氰酸銨、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化亞鐵(均為分析純) 南京化學(xué)試劑廠。

LXJ-離心沉淀機 上海醫(yī)用儀器廠；722N 紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；PHS-3C型精密數(shù)顯pH計 上海精密科學(xué)儀器廠；TDL-5-A 型離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；ALpHA2-4 型真空冷凍干燥機 德國Christ公司；可調(diào)電熱板 北京科偉永興儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 樣品的制備

油菜籽經(jīng)礱谷機碾壓脫殼、粉碎，于索氏抽提裝置中使用石油醚經(jīng)24h抽提脫油，室溫晾干除去溶劑得到菜籽粕；粉碎過60目篩并將菜籽粕以1:20(m/V)加水分散于蒸餾水中，50℃條件下攪拌2h，其間用2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)使pH值維持11，離心，得到上層清液；在下層殘渣中加入10倍pH11的蒸餾水，按上法再次提取合并提取的上清液，用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.5使蛋白質(zhì)等電點沉淀，靜置1h后3000hg離心30min，得沉淀蛋白，菜籽蛋白(蛋白質(zhì)含量83.07%)，用無水乙醇脫色處理1～2遍，冷凍干燥，收集備用。

1.3 Alcalase 酶解菜籽蛋白

準確稱取一定質(zhì)量的菜籽蛋白加入到反應(yīng)容器中，調(diào)節(jié)混合物的溫度、pH值和底物質(zhì)量分數(shù)，加入Alcalase蛋白酶到容器中，開始計時，同時在水解過程中加入4mol/L的NaOH維持pH值恒定。反應(yīng)結(jié)束后將水解物100℃加熱10min鈍化蛋白酶，待其自然冷卻后以4000hg離心10min，收集上清液，置冰箱中待用。

1.4 測定方法

1.4.1 蛋白質(zhì)水解度(DH)測定

采用pH-Stat法[13]。

式中：c為NaOH的濃度/(mol/L)；V為NaOH消耗的體積/mL；a為樣品分離蛋白氨基平均解離度；m為蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；h為每克蛋白質(zhì)底物具有的肽鍵毫摩爾數(shù)(取h=718mmol/g)。

1.4.2 多肽得率的測定

三氯乙酸(TCA)作為蛋白質(zhì)沉淀劑，可以沉淀蛋白質(zhì)及肽段。蛋白質(zhì)肽鏈隨著水解反應(yīng)的進行被切成大小不等的片段，三氯乙酸溶解指數(shù)越高，表明較短肽段的含量越高[14-15]。

將蛋白沉淀用2倍體積水洗一次，同樣條件離心并合并上清液。取上清液10mL測定其蛋白質(zhì)含量；另取10mL上清液加入10mL TCA溶液，其余上清液冷凍干燥成固體備用。搖勻，靜置1h，4000hg離心20min，取上清測定蛋白質(zhì)含量并計算菜籽蛋白肽得率。

多肽得率/% =

1.4.3 蛋白酶活力的測定

采用福林-酚法[16-17]。

1.4.4 蛋白質(zhì)含量的測定

參照GB 5009.5ü2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》方法。

1.5 單因素試驗

本實驗在堿性蛋白酶Alaclase生產(chǎn)菜籽肽基礎(chǔ)上，分別考察pH值、酶解時間、底物質(zhì)量分數(shù)、加酶量和酶解溫度對蛋白水解度和多肽得率的影響，分別進行單因素試驗，確定最佳的因素水平。

1.6 響應(yīng)面法分析優(yōu)化

通過單因素試驗結(jié)果確定影響堿性蛋白酶酶解效果的主要因素，再根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，利用Design Expert7.0軟件對實驗進行設(shè)計和數(shù)據(jù)處理，得出菜籽肽最佳酶解工藝條件，并進行驗證實驗檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的有效性。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解pH值對蛋白水解度和多肽得率的影響

圖 1 pH值對蛋白水解度和多肽得率的影響Fig.1 Effect of pH on hydrolysis degree and peptide yield

取加酶量為3000U/g pro、溫度50℃、底物質(zhì)量分數(shù)5%、時間3h。分別取pH7.0、8.0、8.5、9.0、10.0進行水解，測定DH和多肽得率。由圖1可知，pH值從7.0到10.0的過程中，DH和多肽得率先增大后減小，在pH8.5時，兩指標達到峰值。

2.2 酶解時間對蛋白水解度和多肽得率的影響

取加酶量為3000U/g pro、溫度50℃、底物質(zhì)量分數(shù)5%、pH8.5。分別進行水解各1、2、3、4、5h，測定DH和多肽得率。圖2表明酶解時間在3h內(nèi)時，菜籽肽的得率是隨著時間的增加而增加的，超過3h后菜籽肽的得率開始呈現(xiàn)下降趨勢；水解度則一直呈上升趨勢。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因為，在一定的時間內(nèi)，蛋白得到充分的酶解，都以小肽的形式存在于上清液中；酶解時間在大于3h 后，酶解液體系內(nèi)的產(chǎn)物增加到一定濃度，反而對酶的活力產(chǎn)生抑制作用，使籽肽得率下降。

圖 2 酶解時間對蛋白水解度和多肽得率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree and peptide yield

2.3 底物質(zhì)量分數(shù)對蛋白水解度和多肽得率的影響

圖 3 底物質(zhì)量分數(shù)對蛋白水解度和多肽得率的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on hydrolysis degree and peptide yield

取加酶量為3000U/g pro、溫度50℃、pH8.5、酶解時間3h。以蛋白質(zhì)質(zhì)量為基礎(chǔ)，分別配制成底物質(zhì)量分數(shù)為2%、3%、4%、5%、6%、7%和8%的溶液水解。測定DH和菜籽肽得率。由圖3可知，隨著底物質(zhì)量分數(shù)的增大，DH和菜籽肽得率都呈現(xiàn)下降的趨勢，但菜籽肽得率受影響較大，水解度受影響較小。當?shù)孜镔|(zhì)量分數(shù)大于5%時，下降趨勢明顯，這可能是因為隨著底物質(zhì)量分數(shù)的增大，造成酶解液黏度增大，酶解液體系整體水分含量降低，影響蛋白酶擴散，從而降低水分活度，對水解反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。所以，底物質(zhì)量分數(shù)選定為5%較為合適。

2.4 加酶量對蛋白水解度和多肽得率的影響

圖 4 加酶量對蛋白水解度和多肽得率的影響Fig.4 Effect of enzyme concentration on hydrolysis degree and peptide yield

分別取酶量為1000、2000、3000、4000、5000U/g pro在溫度50℃、pH8.5、底物質(zhì)量分數(shù)5%、酶解時間3h條件下進行水解，測定DH和多肽得率。結(jié)果如圖4所示。水解度隨著酶用量的增加而增加，這表明酶與底物結(jié)合的幾率隨著酶用量的增加而逐步增加，進而水解度增加。但是當酶用量大于3000U/g pro后，增加的效果已不太明顯，且考慮到酶試劑自身價格較為昂貴，過量添加增加成本，故本實驗選取酶用量為3000U/g pro。

2.5 酶解溫度對蛋白水解度和多肽得率的影響

圖 5 酶解溫度對蛋白水解度和多肽得率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis degree and peptide yield

取加酶量3000U/g pro、底物質(zhì)量分數(shù)5%、pH8.5、酶解時間3h。以40、45、50、55、60℃進行酶解，測定蛋白DH和菜籽肽得率。由圖5可知，酶解溫度對DH和多肽得率的影響顯著，55℃為較理想的酶解溫度。溫度繼續(xù)上升，菜籽肽得率與水解度反而下降，這是因為溫度過高可能導(dǎo)致堿性蛋白酶Alcalase自身分子結(jié)構(gòu)部分解體，導(dǎo)致堿性蛋白酶變性，從而使其酶活力降低所造成的。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，菜籽肽得率與水解度反應(yīng)的趨勢基本一致，從經(jīng)濟因素及工作量方面考慮，故僅選取菜籽蛋白DH(Y)作為響應(yīng)值。同時選取了對菜籽蛋白DH變化影響較大的3個因素，即酶解pH值、加酶量和底物質(zhì)量分數(shù)，分別將其標記為自變量X1、X2和X3，每一個自變量按低、中、高3個水平分別以—1、0、1進行編碼。采用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，各因素及水平編碼如表1所示。

表 1 Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計因素水平及編碼Table 1 Coded values and corresponding values of the optimization parameters used in response surface analysis

為了最優(yōu)擬合二次多項回歸方程各項系數(shù)，依據(jù)統(tǒng)計學(xué)試驗設(shè)計要求，對影響菜籽蛋白DH的關(guān)鍵內(nèi)在因素進行15組試驗，其中12組析因試驗，3組為零點試驗，用以估計試驗誤差，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表 2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design matrix and results for response surface analysis

利用Design Expert 7.0軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，選擇對響應(yīng)值顯著的各項，可得酶解pH值、加酶量及底物質(zhì)量分數(shù)與菜籽蛋白水解度的二次多項回歸方程：

對該回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果見表3和表4。

表 3 菜籽蛋白DH二次多項式擬合模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the fi tted quadratic polynomial model for hydrolysis degree

由表3中二次多項式擬合模型進行方差分析表明，本實驗所選用DH模型具有高度的顯著性(P＜0.01)，模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率用模型失擬項表示，失擬項在α=0.05水平上不顯著(P＞0.05)，表明該模型不必引入更高次數(shù)項，模型選擇合理；Y的變異系數(shù)較低(2.96%)，表明實驗操作可信；模型校正決定系數(shù)為0.9414，存在顯著性差異，同時模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.9744，大于0.9，表明該模型擬合優(yōu)度良好。因此該模型可以用來分析DH隨酶解pH值、加酶量和底物質(zhì)量分數(shù)的變化。從表4可知，X1、X2、X3的Prob＞F值分別為0.0206、＜0.0001、 0.0007，所以3個因素中對DH的影響效果最大的為加酶量，底物質(zhì)量分數(shù)的影響次之，酶解pH值的最小。

表 4 菜籽蛋白DH回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果Table 4 Statistical signif i cance of regression coeff i cients in the fi tted quadratic polynomial model for hydrolysis degree

2.7 模型驗證性實驗

通過Design-Expert軟件的預(yù)測分析功能，在DH取最大值，加酶量盡量少的條件下，得到菜籽蛋白酶解最佳工藝條件為：pH8.45、溫度55℃、加酶量5000U/g pro、底物質(zhì)量分數(shù)4.49%、酶解時間180min，蛋白質(zhì)水解度為15.00%。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗和二次多項回歸方程分析結(jié)果，此條件下實際所得菜籽肽得率為73.02%，菜籽蛋白水解度為14.71%，這與模型預(yù)測值(15.00%)僅偏差1.93%，較為接近，說明該模型能夠較好地預(yù)測實際的酶解情況，所以響應(yīng)面分析法應(yīng)用于菜籽肽酶解條件的優(yōu)化是可靠的。

3結(jié) 論

本實驗以菜籽蛋白DH、多肽得率為評價指標，初步研究了堿性蛋白酶Alcalace酶解菜籽蛋白的相關(guān)條件，并以菜籽蛋白DH為響應(yīng)值，應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了菜籽蛋白酶解條件。通過單因素試驗，確定酶解pH值、加酶量和底物質(zhì)量分數(shù)對DH有顯著影響，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理采用響應(yīng)面分析實驗，對實驗結(jié)果進行分析比較：得到菜籽蛋白酶解最佳工藝條件為：pH8.45、溫度55℃、加酶量5000U/g pro、底物質(zhì)量分數(shù)4.49%、酶解時間為180min，在該優(yōu)化條件下，菜籽蛋白DH理論可達15.00%，模型驗證實驗DH實際可達14.71%，菜籽肽得率為73.02%。

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Optimization of Enzymatic Preparation of Rapeseed Peptides

YI Qi-da，WANG Xi-xi，WANG Li-feng，GAO Yu-long，YUAN Jian，JU Xing-rong*
(College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China)

Rapeseed protein was extracted from defatted rapeseeds and hydrolyzed by alcalase. Response surface methodology was employed to optimize enzymatic hydrolysis conditions based on degree of hydrolysis (DH) and rapeseed peptide yield. The optimum conditions for enzymatic preparation of rapeseed peptides were found to be hydrolysis at 55 ℃and pH 8.45 for 180 min with a substrate concentration of 4.49% and an enzyme concentration of 5000 U/g protein. Under these conditions, the theoretical value of degree of hydrolysis was 15.00%, while the actual value was 14.71%.

rapeseed peptides；alcalase；degree of hydrolysis；response surface analysis

TS201.2

A

1002-6630(2013)01-0166-05

2012-09-30

國家農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化基金項目(2012GB24490611；2011GB2C100012)；江蘇省科技支撐計劃項目(BE2011386)；十二五國家科技支撐計劃項目(2012BAD37B08)

易起達(1987ü)，男，碩士研究生，研究方向為食品加工與營養(yǎng)。E-mail：yi.qida@yahoo.com.cn

*通信作者：鞠興榮(1957ü)，男，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)及功能性成分開發(fā)。E-mail：xingrongju@163.com