辣椒t“花殼?”主要致變細菌的分離及鑒定

劉 海，丁筑紅*，鄭文宇，肖治柔，鄧 程，楊 茜

(貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

辣椒t“花殼?”主要致變細菌的分離及鑒定

劉 海，丁筑紅*，鄭文宇，肖治柔，鄧 程，楊 茜

(貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

采用微生物學傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法從辣椒花殼組織中分離到可致辣椒花殼細菌，并從中選取主要致變細菌，進行常規(guī)鑒定和分子生物學鑒定。通過對其形態(tài)特征觀察、生理生化特征分析以及測定16S rDNA序列，用BLAST 軟件對測序結(jié)果進行相似性比對，鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Bacillus subtilis 2株；Lysinibacillus sphaericus 1株；Bacillus amyloliquefaciens 1株；Bacillus pumilus 1株。

辣椒；花殼；分離；鑒定；系統(tǒng)發(fā)育分析

干辣椒是鮮紅辣椒經(jīng)過干制而成的辣椒產(chǎn)品，是辣椒產(chǎn)品加工的主要原料。通過對鮮辣椒進行干制，可以將鮮辣椒的可溶性固形物濃度提高到微生物難于在其上生存和利用的程度，同時抑制辣椒體內(nèi)酶的活性，以達到長期保存的目的[1]。由于干辣椒的水分含量低、體積小、質(zhì)量輕，運輸、貯藏等相對容易，因此，干辣椒的國際貿(mào)易額大大高于鮮辣椒，其產(chǎn)量也逐年增長[2-3]。然而，在辣椒的干制過程中，特別是自然干制中，辣椒果實會出現(xiàn)紅色褪變，形成花殼或白殼干辣椒，嚴重影響辣椒的感官品質(zhì)和商品價值[4-5]。導致辣椒紅素褪變的原因很多[6-7]，但在辣椒自然干制中引起花殼的原因主要是微生物的作用[8-10]。2008年，李桂舫等[10]對干制辣椒紅色素喪失與病原菌的關系進行了研究，通過對褪色的干制辣椒種子及組織的分離培養(yǎng)，得到4種真菌菌株，分別為Acremonium sp.、Alternaria sp.、Cladosporium sp.和Fusarium sp.。采用刺傷法將這4種真菌接種到轉(zhuǎn)紅期的健康辣椒果實上，初步發(fā)現(xiàn)Acremonium sp.和Fusarium sp.可混合侵染引起辣椒紅色素喪失。

真菌可導致辣椒色素褪色，造成辣椒花殼[9-10]。然而，細菌對辣椒干制過程中辣椒色素的影響卻鮮見報道。本實驗通過對自然干制過程中花殼致變細菌的分離，利用傳統(tǒng)的細菌分類鑒定方法和分子生物學鑒定方法對辣椒花殼致變細菌進行鑒定，分析辣椒花殼致變細菌的群屬，為預防辣椒花殼提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒(Capsicum annuum L.)，花溪黨武本地辣椒二金條[11]購于花溪農(nóng)貿(mào)市場，新鮮且充分成熟，無腐爛變質(zhì)。

DNA提取試劑盒(離心柱型) 北京三博遠志生物技術有限責任公司。

1.2 培養(yǎng)基配方

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、牛肉膏3、氯化鈉5、瓊脂15，蒸餾水1000mL，pH7.2～7.4。

1.3 方法

1.3.1 辣椒花殼致變細菌的分離純化[12]

將新鮮紅色辣椒在室溫條件下自然風干。對出現(xiàn)

花殼的辣椒進行隨機抽樣，無菌水沖洗花殼辣椒果實表面，用無菌剪刀在花殼辣椒病健處剪取(1～2)cmh(1～2)cm大小辣椒組織于無菌研缽中，加入10mL無菌生理鹽水研磨，將辣椒組織磨碎，靜置5min，吸取0.5mL涂布于無菌營養(yǎng)瓊脂平板上，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待其長出菌落，用無菌接種環(huán)挑取不同單個菌落劃線轉(zhuǎn)接純化多次，直至通過鏡檢觀察確定其為純培養(yǎng)物后，挑取單個菌落接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 辣椒花殼致變細菌致病性接種

選取健康成熟的花溪黨武本地新鮮紅辣椒，用自來水沖洗3h后瀝干，切取(1～2)cmh(2～4)cm大小的辣椒組織，用70%乙醇溶液消毒2min，0.1%升汞溶液滅菌30min，然后用無菌水沖洗9～10次。將消毒滅菌的辣椒組織放入無菌的培養(yǎng)皿中，置于30℃的培養(yǎng)箱中觀察5d，剔除被污染的辣椒組織。將花殼辣椒組織中分離純化的細菌菌種用無菌生理鹽水洗下，制成1h107CFU/mL菌懸液，取1mL接種于經(jīng)消毒滅菌的辣椒組織，同時，用無菌水潤濕培養(yǎng)皿中紗布，每一菌株做3個重復，將接種后的辣椒組織置于30℃的培養(yǎng)箱中保濕5d后，再培養(yǎng)20d，以無菌生理鹽水作為空白對照。培養(yǎng)期間觀察其色澤變化，將導致辣椒花殼的菌株保存于4℃冰箱。

1.3.3 辣椒花殼致變細菌形態(tài)學特征觀察

將導致辣椒花殼的菌株接種于無菌營養(yǎng)瓊脂平板上30℃培養(yǎng)24h，菌落形態(tài)觀察按袁麗紅[13]的方法進行。然后分別對培養(yǎng)24h的培養(yǎng)物按照結(jié)晶紫草酸銨染色法進行革蘭氏染色，按鍍銀染色法進行鞭毛染色，按孔雀綠芽孢染色法進行芽孢染色[14]。菌體細胞大小利用測微尺測量[15]，菌株運動性和好氧性通過穿刺接種觀察[16-17]。

1.3.4 生理生化指標測定

按照東秀珠等[14]分類方法進行生理生化實驗。

1.3.5 16S rDNA分子測序及序列分析

DNA按照細菌基因組DNA提取試劑盒手冊中細菌基因組DNA提取步驟進行。

采用細菌16S rDNA通用引物(正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物1492R：5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3')，以導致辣椒花殼菌株的基因組DNA為模板進行PCR擴增。擴增體系為50μL：DNA模板1～5μL，5U/μL Taq plus DNA聚合酶0.2μL、10hPlus PCR Buffer 5μL、dNTP(10mmol/L) 2μL、上下游引物(10μmol/L)各2μL、ddH2O補足至50μL。擴增條件為：94℃預變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35個循環(huán)；72℃最后延伸5min，4℃保存。

取3～5μL擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為10hTBE，凝膠濃度為1.5%，恒定電壓為150V，電泳15min后，通過EB染色在紫外燈下觀察目的條帶，質(zhì)量濃度＞50ng/μL為合格。質(zhì)量濃度達不到或沒有擴增條帶的樣品重新擴增。對目標片段，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行純化與回收，操作步驟參照試劑盒說明書進行。對純化和回收的DNA序列進行測序，菌株測序的整個過程由北京三博遠志生物技術有限責任公司完成。將菌株的16S rRNA基因序列提交GenBank進行BLAST比對，查找相似性較高菌株序列。使用序列分析軟件ClustalX2.0.11程序?qū)ο嗨菩员容^高的菌株序列進行多序列比對(multiple alignments)，采用Kimura2-Parameter距離模型[18]計算核苷酸差異值，利用MEGA4.1建樹軟件采用Neighbor-Joining[19]法以相近序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)(bootstrap)為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒花殼致變細菌的分離與回接結(jié)果

圖 1 5株細菌對辣椒作用結(jié)果Fig.1 Effect of inoculation with 5 selected bacterial isolates on red pepper

從辣椒花殼組織中分離純化得到63株菌株，將所分離純化的63株菌種接種于經(jīng)滅菌的新鮮健康的紅辣椒組織。在接種后的第5天，接種菌株B3、B5、B7、B15的辣椒組織開始出現(xiàn)橘黃色斑塊，并且橘黃色斑塊向周圍擴散，第6天B26出現(xiàn)橘黃色斑塊，橘黃色斑塊也向周圍擴散。第20天B19和B20開始出現(xiàn)紅色褪變，經(jīng)過12d的培養(yǎng)，B2、B23和B52的辣椒組織的剪切邊沿處開始出現(xiàn)黃色，其黃色由辣椒邊沿向辣椒組織中部擴散。第15天，B31、B35和B36均出現(xiàn)變色現(xiàn)象。

經(jīng)過25d的培養(yǎng)觀察，有13株菌株可導致辣椒顏色從紅色變?yōu)辄S色或橘黃色。如圖1所示，B2、B23、B31和B35菌株對辣椒組織的影響較其他菌株弱。B3、B5、B7、B15、B19、B20、B26、B36和B52的顏色變化較明顯，辣椒組織完全由紅色變?yōu)辄S色或橘黃色。在辣椒自然干制過程中，辣椒一般在15～20d后開始出現(xiàn)花殼現(xiàn)象，B3、B5、B7、B15和B26菌株接種辣椒組織變色時間較其他菌株短。空白組辣椒的顏色加深，變?yōu)樯罴t色。經(jīng)過對辣椒組織進行接種培養(yǎng)觀察，此13株菌株均可導致辣椒組織變色，形成花殼辣椒。然而，其中B3、B5、B7、B15和B26能在短時間使辣椒組織發(fā)生明顯變色，因此，可初步斷定B3、B5、B7、B15和B26是辣椒花殼的主要致變細菌，對其進行初步鑒定和分子生物學鑒定。

2.2 辣椒花殼致變細菌形態(tài)特征及生理生化分析

將變色明顯的5株菌株B3、B5、B7、B15和B26分別用劃線法接種于無菌的營養(yǎng)瓊脂平板上，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察其菌落形態(tài)。菌落形態(tài)特征見圖2。5株菌株的菌落顏色均為灰白色，圓形，不透明，直徑0.5～3.5mm，菌落濕潤。其中，B15菌落的菌落中間有白色十字狀皺褶。

圖 2 5株辣椒“花殼”致變細菌菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of 5 selected bacterial isolates

對5株菌株進行革蘭氏染色、芽孢染色和鞭毛染色，5株細菌均為革蘭氏陽性桿菌，以周生鞭毛運動，產(chǎn)芽孢。其中，B5產(chǎn)球狀芽孢，芽孢膨大，頂端著生。B3、B7、B15和B26的芽孢形狀為橢圓形，B3和B26的芽孢偏端著生，B7和B15的芽孢的著生位置為中部(圖3)。5株菌株均為好氧菌。

圖 3 5株辣椒“花殼”致變細菌細胞形態(tài)結(jié)構Fig.3 Cell morphology of 5 selected bacterial isolates

表 1 辣椒“花殼”致變細菌形態(tài)特征Table 1 Morphological features of 5 selected bacterial isolates

表 2 辣椒“花殼”致變細菌生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical properties of 5 selected bacterial isolates

辣椒花殼致變細菌形態(tài)特征如表1所示。由表2可見，B3能利用葡萄糖產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，能利用蔗糖產(chǎn)酸，不能利用乳糖、棉子糖、麥芽糖、鼠李糖、D-阿拉伯糖、山梨醇、木糖醇、肌醇、甘露醇、水楊苷產(chǎn)酸；水解淀粉，葡萄糖銨陽性，能還原硝酸鹽，但不能還原亞硝酸鹽，V-P實驗陽性，甲基紅實驗陰性，不產(chǎn)氧化酶、苯丙氨酸脫羧酶和精氨酸雙水解酶，尿素酶和接觸酶陽性；不利用檸檬酸鹽和丙二酸鹽，不產(chǎn)硫化氫和吲哚，不能在氰化鉀培養(yǎng)基中生長，能液化明膠。B5不能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、麥芽糖、鼠李糖、D-阿拉伯糖、山梨醇、木糖醇、肌醇、甘露醇、水楊苷產(chǎn)酸。不水解淀粉。葡萄糖銨和檸檬酸鹽利用陰性，不還原硝酸鹽和亞硝酸鹽，不產(chǎn)苯丙氨酸脫羧酶和精氨酸雙水解酶，產(chǎn)氧化酶、尿素酶和接觸酶，不產(chǎn)硫化氫和吲哚，能利用丙二酸鹽和液化明膠，V-P和甲基紅均為陰性，能在氰化鉀培養(yǎng)基中生長。B7能利用葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，能利用蔗糖產(chǎn)酸，不能利用乳糖、棉子糖、麥芽糖、鼠李糖、D-阿拉伯糖、山梨醇、木糖醇、肌醇、甘露醇產(chǎn)酸。葡萄糖銨陰性，不水解淀粉；能利用水楊苷產(chǎn)酸，能還原硝酸鹽，不還原亞硝酸鹽，V-P實驗陽性，甲基紅實驗陰性，不產(chǎn)尿素酶、苯丙氨酸脫羧酶和精氨酸雙水解酶，氧化酶和接觸酶陽性，不產(chǎn)硫化氫和吲哚，不利用檸檬酸鹽和丙二酸鹽，能液化明膠，氰化鉀生長實驗陰性。B15能利用葡萄糖產(chǎn)酸，但不產(chǎn)氣，不能利用蔗糖、乳糖、棉子糖、麥芽糖、鼠李糖、D-阿拉伯糖、山梨醇、木糖醇、肌醇、甘露醇、水楊苷產(chǎn)酸；葡萄糖銨陽性，水解淀粉，能還原硝酸鹽，但不能還原亞硝酸鹽，V-P實驗陽性，甲基紅實驗陰性，不產(chǎn)尿素酶、苯丙氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶和氧化酶，產(chǎn)接觸酶，不利用檸檬酸鹽和丙二酸鹽，能液化明膠，氰化鉀生長實驗陰性，不產(chǎn)硫化氫和吲哚。與B3相比，B26能利用甘露醇產(chǎn)酸和檸檬酸鹽，但不能水解淀粉。參照伯杰細菌鑒定手冊[20]初步判定此5株菌株屬于芽孢桿菌屬。

2.3 16S rDNA序列測定分析結(jié)果

圖 4 5株菌株16S rDNA擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖Fig.4 Gel electrophoresis of PCR amplif i cation products of 16S rDNA sequences from 5 selected bacterial isolates

經(jīng)過對5株菌株16S rDNA進行擴增，所得序列大小約為1500bp左右(圖4)。對5株辣椒花殼致變細菌的16S rDNA進行測序，將測得菌株的16S rDNA序列進行BLAST同源比對分析。一般情況下，16S rDNA序列相似性在98%以上的可以認為是同種，97%以上可以認為是同屬[21]，序列相似性小于96%～97%的可以認為是不同種，小于93%～95%的可以認為是不同屬[22]。

將所測16S rDNA序列登陸GenBank進行BLAST比對，5株菌株通過BLAST比對，都能在數(shù)據(jù)庫中找到同源性非常高的相似菌株序列。菌株B3、B7、B15和B26均與芽孢桿菌屬(Bacillus)具有較高的序列相似性，B5與賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)有較高的序列相似性。經(jīng)過對比分析，菌株B3與菌株Bacillus subtilis strain C11D(HQ388812)的16S rDNA序列相似性達到99.9%，菌株B26與菌株Bacillus subtilis strain SCD115030(JN998727)的16S rDNA序列相似性達到99.8%。對菌株B3與B26的16S rDNA序列進行比對，其相似性可達到99.7%。菌株B5與菌株Lysinibacillus sphaericus strain JV(HM234124)、菌株B7與菌株Bacillus pumilus strain ZAQ1(HQ143667)、菌株B15與菌株Bacillus amyloliquefaciens strain JXQZ11(HQ844481)的16S rDNA序列相似性分別達到99.7%、99.8%和99.1%。

圖 5 5株辣椒“花殼”致變細菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of 5 selected bacterial isolates fruits

對5株辣椒花殼致變細菌及其同源菌株的16S rDNA序列，利用MEGA4.1建樹軟件采用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖5可見，菌株B5與Lysinibacillus sphaericus strain JV(HM234124)聚合，且自信度高達96%，其親緣關系較近；菌株B7與Bacillus pumilus strain ZAQ1 (HQ143667)聚成一支，其親緣關系較近；菌株B15與Bacillus amyloliquefaciens strainJXQZ11(HQ844481)有較近的親緣關系；菌株B3、B26與Bacillus subtilis strain SCD115030(JN998727)、Bacillus subtilis strain C11D(HQ388812)和Bacillus tequilensis strain 10b(HQ223107)聚在一起，其中，B3、 B26、Bacillus subtilis strain SCD115030(JN998727)、Bacillus subtilis strain C11D(HQ388812)之間的親緣關系較近。

因此，綜合5株辣椒花殼致變菌的細胞形態(tài)結(jié)構、生理生化特性及16S rDNA 序列測序結(jié)果，分別將B5、B7、B15準確鑒定為Lysinibacillus sphaericus、Bacillus pumilus和Bacillus amyloliquefaciens，將B3和B26均鑒定為Bacillus subtilis。

3 討 論

辣椒花殼現(xiàn)象不僅出現(xiàn)在采后，辣椒在采前也會出現(xiàn)辣椒顏色褪變現(xiàn)象[9]。辣椒花殼致變菌的作用是辣椒采前顏色褪變的主要原因，在辣椒生長紅熟期間，辣椒花殼致變菌可侵入辣椒果實組織中，引起辣椒果實顏色褪變現(xiàn)象的發(fā)生。李明遠等[9]對田間采集的虎皮病辣椒果實進行病原分離，發(fā)現(xiàn)病原真菌是干辣椒

虎皮現(xiàn)象產(chǎn)生的主要原因，其病原真菌主要有細交鏈孢(Alternarialternata)、青霉菌(Penieillium sp.)、芽枝霉菌(Cladosporium sp.) 和鐮刀菌(Fusariom sp.) 等。由于采前侵入辣椒果實組織內(nèi)的花殼致變菌可在采后辣椒果實組織中繼續(xù)生長繁殖，從而導致在辣椒采后自然干制和貯藏期間辣椒花殼現(xiàn)象的產(chǎn)生。此外，在辣椒果實自然干制過程中，由于辣椒組織脫水死亡，花殼致變菌極易侵入辣椒果實組織內(nèi)部，引起辣椒顏色褪變。李桂舫等[10]從干制辣椒的褪色組織和辣椒種子中分離出4種辣椒花殼致變真菌。其中，有3種真菌是在辣椒生長紅熟期間所攜帶的花殼致變真菌，另一種真菌在辣椒干制和貯藏期間侵入并導致辣椒褪色。

辣椒果實顏色與其所含類胡蘿卜素成分有關[23-25]。從辣椒花殼致變細菌所導致辣椒顏色的變化可見，辣椒的顏色由紅色變?yōu)辄S色或橘黃色，而空白對照組辣椒組織的顏色由紅色變?yōu)樯罴t色，這可能與其中呈現(xiàn)紅色的類胡蘿卜素降解有關[26-28]。辣椒紅素對外界環(huán)境比較敏感，辣椒紅色素貯存在辣椒果實的完整細胞組織中，由于有細胞膜及細胞內(nèi)某些成分的保護并形成脂類，其對光熱等具有較高的穩(wěn)定性，但當辣椒紅色素失去了細胞膜等生物保護機制，辣椒紅色素在有氧條件下會產(chǎn)生自氧化反應，而外界的光照高溫及助氧化劑等的存在又會加速其氧化分解而褪色[29]。因此，辣椒花殼致變細菌對辣椒色素的影響可能是對辣椒組織結(jié)構造成破壞，使辣椒紅色素的保護機制受到影響而發(fā)生變化，加速色素氧化褪色出現(xiàn)辣椒花殼。本實驗分離得到的辣椒花殼致變細菌主要為芽孢桿菌，其中，經(jīng)鑒定的5株主要辣椒花殼致變細菌中，有2株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。然而枯草芽孢桿菌主要作為共生菌存在于辣椒組織中[30]，其致變機制有待進一步研究。

芽孢桿菌是辣椒中的優(yōu)勢菌群，張曉玲[31]從市售10種干辣椒樣品中共分離得到了13種細菌，發(fā)現(xiàn)其中12種細菌為芽孢桿菌。張春燕等[32]對低水分辣椒粉帶菌狀況進行調(diào)查，對48份低水分辣椒粉樣品帶菌狀況進行取樣分析，結(jié)果表明其帶菌量在2.2h104～2.8h106CFU/g之間，平均帶菌量為4.8h105CFU/g，球菌和芽孢桿菌為優(yōu)勢菌，含量分別為52.0%和46.0%，而桿菌(無芽孢)所占比例較低為2.0%。由此可見，辣椒所帶菌群極易引起辣椒果實顏色的褪變，盡量減少辣椒果實的帶菌量有助于減少辣椒花殼現(xiàn)象的發(fā)生。

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Isolation and Identif i cation of Bacteria Causing Discoloration in Red Pepper Fruits (Capsicum annuum L.)

LIU Hai，DING Zhu-hong*，ZHENG Wen-yu，XIAO Zhi-rou，DENG Cheng，YANG Qian
(College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

Five dominant bacteria causing the discoloration of red pepper fruits (Capsicum annuum L.) were isolated from red pepper fruits following the traditional bacterial isolation procedures. Meanwhile, they were identified based on morphological observation, physiological and biochemical properties, 16S rDNA sequences and BLAST homology alignment as two Bacillus subtilis strains, one Lysinibacillus sphaericus strain, one Bacillus amyloliquefaciens strain, and one Bacillus pumilus strain, respectively.

red pepper；discoloration；isolation；identif i cation；phylogenetic analysis

TS207.4

A

1002-6630(2013)01-0160-06

2012-04-10

國家自然科學基金項目(31060228/C200301)

劉海(1988ü)，男，碩士研究生，研究方向為食品加工與貯運保鮮技術。E-mail：573390817@qq.com

*通信作者：丁筑紅(1966ü)，女，教授，學士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工與利用。E-mail：gzdxdzh@163.com