萊克多巴胺人工抗原的合成與鑒定

鄧發(fā)亮，劉曉云，唐時幸，王繼華

(廣州萬孚生物技術股份有限公司，廣東 廣州 510663)

萊克多巴胺人工抗原的合成與鑒定

鄧發(fā)亮，劉曉云，唐時幸，王繼華

(廣州萬孚生物技術股份有限公司，廣東 廣州 510663)

為合成新的、穩(wěn)定的萊克多巴胺人工抗原，對萊克多巴胺結構進行修飾，合成帶羧基基團的萊克多巴胺半抗原，經(jīng)碳二亞胺法與載體BSA蛋白偶聯(lián)制備萊克多巴胺人工抗原，采用紫外光譜掃描法、蛋白質電泳法和膠體金免疫層析法檢測偶聯(lián)物。萊克多巴胺半抗原的結構經(jīng)氣相質譜聯(lián)用儀確證。結果表明：萊克多巴胺人工合成抗原連接成功，與抗萊克多巴胺抗體有特異性反應，具有抗原性。該方法合成的萊克多巴胺人工抗原結構未見報道、穩(wěn)定性優(yōu)越，可作為萊克多巴胺免疫檢測方法中包被抗原用于萊克多巴胺檢測，也可作為免疫源性抗原用于制備抗萊克多巴胺抗體。

萊克多巴胺；半抗原；人工抗原；免疫檢測

萊克多巴胺(ractopamine，RAC)是化學合成苯乙醇胺類β-興奮劑中的一種，臨床上曾用于治療支氣管哮喘、慢性支氣管炎和肺氣腫等疾病。與其他β-興奮劑一樣，當萊克多巴胺的用量達到臨床用量的5～10倍時，具有促進營養(yǎng)重分配、促進家禽肌肉生長、降低脂肪含量、增加瘦肉產(chǎn)量等作用[1-2]。但實驗證明萊克多巴胺會在動物臟器中蓄積殘留，可通過食物鏈進入人體，將對食用者的安全帶來隱患[3-5]。目前，我國已經(jīng)禁止生產(chǎn)和銷售萊克多巴胺，但非法使用的現(xiàn)象依然存在。

經(jīng)過十幾年的發(fā)展和實踐，免疫檢測法已被廣泛應用于各類毒物和毒品等小分子物質的檢測[6]。與常用的獸藥殘留檢測方法，如微生物法和儀器檢測法[7]相比，免疫檢測法具有操作簡便、高效、靈敏、特異、適合大規(guī)模檢測等優(yōu)點。

免疫學檢測方法的建立，首先必須獲得結構穩(wěn)定、具有免疫源活性的萊克多巴胺全抗原[8]。萊克多巴胺全抗原的合成多是在鹽酸萊克多巴胺的酚羥基位點進行改造，目前常用的合成方法有3種：方法1[9-13]是通過酸酐(戊二酸酐或丁二酸酐)作為連接臂，一端與萊克多巴胺的酚羥基形成酯鍵，和另一端與載體蛋白的氨基形成酰胺鍵，制備含酯鍵的萊克多巴胺人工抗原(圖1)。該類抗原因酯鍵遠離載體蛋白，容易受環(huán)境的影響而降解，因此其穩(wěn)定性較差；方法2[14-16]是使用1,4-丁二醇二縮水甘油醚等連接臂，一端與小分子的酚羥基成醚，另一端在載體蛋白的氨基上氮烷基化，形成含醚鍵的萊克多巴胺人工抗原(圖2)。單從結構的角度上考慮，醚鍵不易受環(huán)境pH值和離子強度的影響，其穩(wěn)定性優(yōu)于酯鍵，但報道的連接臂存在長度和性質不穩(wěn)定等因素；方法3[15,17]是在萊克多巴胺的苯環(huán)上進行改造，采用對氨基苯甲酸將萊克多巴胺與載體蛋白偶聯(lián)形成含重氮鍵的萊克多巴胺人工抗原(圖3)。重氮法方案的缺點是選擇性差，副反應多且產(chǎn)物難以純化分離，從而影響全抗原的純度；萊克多巴胺酚羥基可被氧化劑氧化形成醌式結構，在對氨基苯甲酸重氮化過程中，具有氧化性的亞硝酸只要稍過量，將破壞萊克多巴胺的結構；最后，抗原中的重氮鍵易受環(huán)境的影響，發(fā)生氧化、還原反應而斷裂。

本實驗在方法2的基礎上選擇合適長度和穩(wěn)定的連接臂，以期保證抗原在結構上穩(wěn)定以及后期抗體制備時篩選出針對萊克多巴胺的特異性抗體，為萊克多巴胺殘留免疫學檢測方法的建立提供人工合成抗原。圖4為本實驗的萊克多巴胺人工抗原的合成路線。

圖1 含酯鍵的萊克多巴胺人工抗原Fig.1 Artificial ractopamine antigens containing ester bonds

圖2 含醚鍵的萊克多巴胺人工抗原Fig.2 Artificial ractopamine antigens containing ether bonds

圖3 含重氮鍵的萊克多巴胺人工抗原Fig.3 Artificial ractopamine antigens containing diazo bonds

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸萊克多巴胺(RAC) 上海晶純試劑有限公司；抗萊克多巴胺抗體 廣州萬孚生物技術股份有限公司；4-溴丁酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、三乙胺、三氯甲烷、乙酸乙酯 廣州化學試劑廠；牛血清白蛋白(BSA，MW 67000)、1-乙烷基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C氣相-質譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；UV-1601紫外分光光度計 日本島津公司；DYY-Ⅲ型垂直電泳槽 北京六一儀器廠；GL20-C型高速冷凍離心機 中科院武漢科學儀器廠；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱、SCZL-A型磁力攪拌器 河南鞏義予華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 萊克多巴胺人工抗原的制備

1.3.1.1 萊克多巴胺半抗原的合成

稱取鹽酸萊克多巴胺68mg(約0.2mmol)，置于25mL單口瓶中，加入DMF 5mL，攪拌溶解；加入無水碳酸鉀固體69mg(0.5mmol)，混勻；10min后，加入4-溴丁酸乙酯32μL(約0.22mmol)，加干燥管隔絕外界水汽，控溫55～60℃，攪拌反應6h，TLC法跟蹤反應進程。反應完畢后，冷卻至室溫，加入冰水20mL攪拌均勻，用乙酸乙酯10mL萃取3次，合并有機相；用飽和食鹽水20mL、水20mL各洗滌1次，收集有機相。無水硫酸鈉干燥2h，過濾，減壓回收溶劑，得淺黃色油狀物80mg。

將上述淺黃色油狀物溶于3mL無水乙醇中，加入飽和氫氧化鋰溶液，室溫攪拌反應3h。反應完畢，加入冰水30mL，攪拌均勻，用1mol/L 鹽酸調pH6～6.5，用三氯甲烷10mL萃取3次，合并有機相，經(jīng)洗滌，干燥，減壓回收溶劑得萊克多巴胺半抗原62mg。半抗原的結構經(jīng)氣相色譜-質譜聯(lián)用(gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS)儀確證。

1.3.1.2 萊克多巴胺人工抗原合成

取萊克多巴胺半抗原12mg(0.031mmol)，溶于DMF 1.0mL中，加入EDC 0.03mmol、NHS 0.03mmol，于4℃攪拌活化4h，加入預先準備的BSA 24mg溶于3mL PBS(0.05mol/L，pH6.0)的溶液，室溫攪拌反應24h。之后于蒸餾水中透析3d，換液3次，高速冷凍離心機離心，收集上清液，得萊克多巴胺人工抗原(RAC-BSA)。

1.3.2 萊克多巴胺半抗原GC-MS分析

該檢測工作委托廣州正孚檢測技術有限公司完成。1.3.3 萊克多巴胺人工抗原的鑒定

1.3.3.1 紫外光譜法

用0.01mol/L PBS(pH7.4)將蛋白質BSA、RAC-BSA和RAC半抗原配成0.5mg/mL待用，用0.01mol/L PBS(pH7)在波長190～400nm范圍內進行基線平衡。然后分別對BSA、RAC-BSA和RAC半抗原進行掃描，記錄各波段波長掃描OD值，繪制曲線觀測結果，推測萊克多巴胺半抗原與BSA是否偶聯(lián)成功[18-19]。

1.3.3.2 蛋白質電泳

[20]進行操作，下膠用10%聚丙烯酰胺，上膠用5%聚丙烯酰胺，上樣量20μg。

1.3.4 萊克多巴胺人工抗原抗原性檢測

利用膠體金免疫層析法(競爭法)對萊克多巴胺人工抗原進行抗原性檢測。用噴膜機將合成的萊克多巴胺抗原噴到硝酸纖維素膜上，以抗萊克多巴胺抗體標記膠體金，結合玻璃纖維紙及吸水紙，組裝成萊克多巴胺快速檢測試紙條[21]，對試紙條進行檢測。

1.3.5 膠體金免疫層析法(競爭法)評估萊克多巴胺人工抗原穩(wěn)定性

本公司購買過多個廠家的萊克多巴胺人工抗原制備萊克多巴胺快速檢測試紙條，但都無法通過常溫或破壞穩(wěn)定性實驗，究其原因，是人工抗原的穩(wěn)定性差。因此考察萊克多巴胺人工抗原的穩(wěn)定性意義重大。

取1批具有抗原性的萊克多巴胺人工抗原(溶液)，用10mL帶蓋的離心管盛裝，于冰箱4℃冷藏保存，間隔1個月從中取出部分抗原用于包被，制成膠體金試紙條，檢測其靈敏度和特異性的變化，以評估抗原在4℃條件下的穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 萊克多巴胺半抗原衍生化后GC-MS圖譜解析

圖5 萊克多巴胺半抗原衍生化后的總離子峰圖(A)和24.455min離子峰裂解圖((BB))Fig.5 GC－MS analysis of ractopamine hapten derivatized with trimethylchlorosilane under optimized conditions

從圖5可以看出，萊克多巴胺半抗原不純；經(jīng)分析，24.455min組分的結構為本實驗設計的萊克多巴胺半抗原的結構。

2.2 紫外掃描圖譜

圖6 RAC-BSA、BSA和RAC半抗原紫外掃描圖譜Fig.6 UV spectra of RAC-BSA, BSA and RAC hapten

由圖6可知，在波長260～300nm范圍內，RAC-BSA在276nm波長處有最大吸收峰，OD值約為0.569，與BSA(OD值為0.35)和RAC半抗原(OD值為3.073)的特征吸收峰有明顯區(qū)別，鑒于這一結果可推測RAC半抗原與BSA偶聯(lián)成功[19]。

2.3 萊克多巴胺人工抗原電泳圖譜

圖7 萊克多巴胺人工抗原蛋白質電泳圖Fig.7 SDS-PAGE of RAC–BSA conjugate

由圖7可知，萊克多巴胺人工抗原的分子質量比BSA蛋白的稍大，說明載體蛋白連接了萊克多巴胺小分子，進一步證實萊克多巴胺與蛋白偶聯(lián)成功；同時表明合成的萊克多巴胺人工抗原的純度高。

2.4 抗原抗原性檢測

將RAC-BSA用作包被抗原，組裝成萊克多巴胺快速檢測試紙條，對陰性、陽性樣本進行檢測，結果如圖8所示。

圖8 萊克多巴胺快速檢測試紙條的陽性(A)和陰性(B))結果Fig.8 Positive and negative results from rapid ractopamine test strip

由圖8A可知，檢測3組陰性樣本時，試紙條檢測區(qū)域均出現(xiàn)紫紅色色帶，且深、淺程度均一，表明制備的RAC-BSA與廣州萬孚生物技術股份有限公司提供的抗RAC抗體可特異性地結合，具有抗原性；圖8B中試紙條檢測3ng/mL的陽性樣本時，檢測區(qū)域出現(xiàn)較淺紫紅色色帶，檢測5ng/mL的樣本時，檢測區(qū)域未出現(xiàn)紫紅色色帶，呈陽性結果，說明該快速檢測試紙條的靈敏度約為5ng/mL。

2.5 萊克多巴胺人工抗原4℃放置穩(wěn)定性

在指定的日期，將4℃放置的萊克多巴胺人工抗原用作包被抗原，組裝成萊克多巴胺快速檢測試紙條，檢測其特異性和靈敏度，結果如表1所示。

表1 萊克多巴胺人工抗原4℃放置穩(wěn)定性實驗結果Tabble 1ble 1 The stability of RAC-BSA conjugate at 4℃

由表1可知，檢測區(qū)域顯色深度相差半個梯度，無明顯差別，表明半年間萊克多巴胺快速檢測試紙條的特異性和靈敏度無明顯變化，其穩(wěn)定性優(yōu)。所以，在忽略抗萊克多巴胺抗體穩(wěn)定性變化的條件下，RAC-BSA的穩(wěn)定性優(yōu)，在4℃保存的保質期大于6個月。

3 結 論

Wie等[22]認為，引入長度合適的連接臂有助于半抗原結構的暴露和特異性抗體的產(chǎn)生，連接臂過長易被細胞識別而產(chǎn)生“橋抗”，連接臂過短則載體蛋白的空間位阻將影響細胞對半抗原的識別，不產(chǎn)生特異性抗體，最好的間隔臂是3～6個直鏈碳，長度以5～8?為宜。本實驗選擇區(qū)別文獻報道方法合成含醚鍵和合適長度連接臂的RAC抗原，即保證了RAC抗原保存和使用過程中的穩(wěn)定性，又使萊克多巴胺分子的特征結構遠離偶聯(lián)位點(—COOH)，與載體蛋白偶聯(lián)后，不易受載體蛋白空間位阻的影響。

本實驗合成的RAC半抗原結構經(jīng)GC-MS確證，雖然半抗原的純度不高，但經(jīng)過后處理，雜質中不含帶羧基的物質，不參與偶聯(lián)反應，在透析過程中被除去，保證了RAC人工抗原的純度。

設計合成具有抗原性的RAC人工抗原是制備抗RAC抗體和建立RAC免疫檢測方法的前提。RAC人工抗原的結構相當大程度上決定了由其免疫動物產(chǎn)生的抗RAC抗體的性質和自身的穩(wěn)定性，RAC人工抗原的穩(wěn)定性又將影響RAC免疫檢測方法的實施和推廣。本實驗合成的RAC人工抗原具有很好的抗原性和穩(wěn)定性，此外，該RAC人工抗原也可用作免疫原，用于抗RAC抗體的制備。

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Synthesis and Identification of Stable Artificial Ractopamine Antigen

DENG Fa-liang，LIU Xiao-yun，TANG Shi-xing，WANG Ji-hua
(Guangzhou Wondfo Biotechnology Co. Ltd., Guangzhou 510663, China)

A novel and stable artificial ractopamine hapten with the active group carboxyl group was designed and synthesized by chemical modification, and linked to bovine serum albumin through ethyl carbodiimide hydrochloride method to form artificial ractopamine antigen. The conjugation was confirmed by UV scanning method and protein electrophoresis. The binding reaction of the artificial ractopamine antigen with anti-ractopamine antibody was verified by gold immunochromatography assay. The ractopamine hapten was characterized by gas chromatography-mass spectrometry. The ractopamine-BSA conjugation was stable and active for at least 6 months at 4 ℃. Our results indicate that ractopamine-BSA can be successfully synthesized by the above method, and can be used as coating antigen in immunoassay for ractopamine detection. In addition, we found that the synthesized antigen could be used as an immunogen to produce antiractopamine antibody.

ractopamine；hapten；artificial antigen；ractopamine；immunoassay

TS202.3

A

1002-6630(2013)18-0146-04

10.7506/spkx1002-6630-201318029

2012-08-06

國家“863”計劃項目(2008AA10Z424)

鄧發(fā)亮(1981—)，男，工程師，碩士，研究方向為濫用藥物的免疫檢測技術。E-mail：faliangdeng@163.com