慢性坐骨神經損傷對MCP/DAF雙基因重組轉染大鼠的行為學影響

王金保，王 琪，朱海娟，蔡增華，王 媛

（1.中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院麻醉科，河北石家莊050082；

2.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院感染控制科，河北石家莊050011）

·論 著·

慢性坐骨神經損傷對MCP/DAF雙基因重組轉染大鼠的行為學影響

王金保1，王 琪1，朱海娟1，蔡增華1，王 媛2

（1.中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院麻醉科，河北石家莊050082；

2.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院感染控制科，河北石家莊050011）

目的評價慢性坐骨神經損傷對膜輔助因子蛋白（membrame cofactor protein，MCP）/衰變加重因子（decay accelerating facter，DAF）重組轉染大鼠的行為學影響，為神經病理性疼痛（neuropathic pain，NPP）大鼠的治療探索新的靶標。方法MCP/DAF雙基因重組轉染SD大鼠24只，體質量200～250kg，按照隨機數字表法分為Rsham和RCCI2組（n=12）；健康雄性SD大鼠24只，體質量200～250kg，按照隨機數字表法分為Nsham和NCCI2組（n=12）。RCCI組和NCCI組大鼠行右側坐骨神經4道環(huán)形結扎，Rsham組和Nsham組大鼠只暴露右側坐骨神經，不予環(huán)形結扎。分別于術前1d和術后1、3、7d測定大鼠的熱痛閾值和機械痛閾值。術后7d測定痛閾值后，立即處死大鼠，取L4～5脊髓組織，其中6只用于免疫組織化學實驗（測定OX-42表達），另外6只用于RT-PCR實驗（測定MCPmRNA和DAFmRNA）。結果與Nsham組相比，NCCI組大鼠術后1、3、7d熱痛閾值和機械痛閾值降低（P＜0.05），脊髓組織中OX-42表達升高（P＜0.05），MCPmRNA和DAFmRNA表達下降（P＜0.05），Rsham組和RCCI組大鼠術后上述時間點熱痛閾值和機械痛閾值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），OX-42表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），MCPmRNA和DAFmRNA表達顯著升高（P＜0.05）；與NCCI組相比，RCCI組大鼠術后上述時間點熱痛閾值和機械痛閾值升高（P＜0.05），脊髓中OX-42表達下降（P＜0.05），MCPmRNA和DAFmRNA表達升高（P＜0.05）。結論MCP/DAF重組轉染大鼠可抑制慢性坐骨神經損傷引起的痛覺過敏形成，MCP/DAF可作為NPP治療的新靶標。

坐骨神經痛；痛閾；大鼠

神經病理性疼痛（neuropathic pain，NPP）是一組頑固性疾病，由于其發(fā)病機制不清，目前缺乏有效治療手段。研究［1］表明，NPP大鼠脊髓背角發(fā)生補體異?；罨夷そY合性補體調節(jié)蛋白膜輔助因子蛋白（membrane cofactor protein，MCP）、衰變加重因子（decay accelerating factor，DAF）表達下降。那么，改變脊髓中MCP、DAF表達是否能影響NPP的形成，目前尚未見報道。本研究探討慢性坐骨神經損傷對MCP/DAF重組轉染大鼠的行為學影響，旨在為NPP的治療提供新的靶標。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組：MCP/DAF雙基因重組轉染SD大鼠（由武漢大學生命科學院提供）24只，體質量200～250kg，按照隨機數字表法分為Rsham和RCCI2組（n=12）；健康雄性SD大鼠（由武漢大學生命科學院提供）24只，體質量200～250kg，按照隨機數字表法分為Nsham和NCCI2組（n=12）。RCCI組和NCCI組大鼠行右側坐骨神經慢性壓迫性損傷，Rsham組和Nsham組大鼠只暴露右側坐骨神經。術后7 d測定痛閾值后，立即處死大鼠，取L4～5脊髓組織，其中6只用于免疫組織化學實驗（測定OX-42表達），另外6只用于RT-PCR實驗（測定MCPmRNA和DAFmRNA）。

1.2 坐骨神經慢性壓迫性損傷：RCCI組和NCCI組參照文獻［2］介紹的方法行大鼠右側坐骨神經慢性壓迫性損傷。腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉后，取俯臥位，固定于自制手術臺上，用硫化鈉均勻的涂在手術區(qū)域，2min后用棉簽輕輕擦掉手術區(qū)域的毛發(fā)，用碘伏消毒2遍后鋪洞巾，在股骨外側上方縱形切開皮膚，順肌紋鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經，游離周圍組織，在坐骨神經三叉分支的近端約5mm處，分別用4-0鉻制羊腸線環(huán)繞坐骨神經干松弛結扎4道，間距約1mm，要求僅留下縊痕而不阻斷神經和血供，以引起小腿肌肉輕度顫動反應為宜，然后逐層縫合皮膚。假手術組僅分離暴露右側坐骨神經干后逐層縫合；所有手術操作均由同一人完成。Rsham組和Nsham組大鼠只暴露右側坐骨神經，然后逐層縫合。

1.3 痛閾測定：于術前1d（基礎值，T0），術后1d（T1）、3d（T2）和7d（T3）測定大鼠機械痛閾值和熱痛閾值。參照文獻［3］介紹的方法測定機械痛閾。測定前將大鼠置于底為1cm×1cm鐵絲網的透明有機玻璃箱內適應15min后，用von Frey纖維絲（Stoelting醫(yī)療公司，美國）篩網下部垂直刺激大鼠后肢足底中部，持續(xù)時間≤4s，大鼠出現(xiàn)縮足或舔足行為視為陽性反應，否則為陰性反應。測定首先從2g刺激開始，當該力度的刺激不能引起陽性反應，則給予相鄰高一級力度的刺激；如出現(xiàn)陽性反應則給予相鄰低一級力度的刺激。如此連續(xù)進行，直至出現(xiàn)第一次陽性和陰性反應的騎跨，再連續(xù)測定4次，每次刺激間隔30s。采用內推法計算誘發(fā)大鼠出現(xiàn)50%機械縮足反應的刺激力度為機械痛閾，公式=10 lgX+κδ（X為最后一次刺激力度，κ為不同刺激方式的系數，在內推法的表格中查找，δ為各刺激力度取對數后間距的平均值，δ=0.179）。參照文獻［2］介紹的方法測定熱痛閾。應用RTY-1型熱痛刺激儀（第四軍醫(yī)大學生理教研室研制），將大鼠置于3mm厚的玻璃板上，使用熱輻射光源照射右后肢足底中部，記錄從照射到出現(xiàn)縮足反應的時間，即熱痛閾值。單次照射不超過20s，同一部位刺激的間隔時間為5min，重復3次，取其平均值。

1.4 脊髓水平OX-42表達的測定：于術后7d，每組隨機選取6只大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉后，經左心室灌注200mL生理鹽水和300mL 4%多聚甲醛溶液，充分固定后，縱向剖開椎管，取L4～5節(jié)段脊髓組織，固定24h，經脫水、透明、浸蠟包埋后，切片機連續(xù)切片厚度為4μm。石蠟切片經二甲苯透明，常規(guī)梯度酒精脫蠟，浸入0.01mol/L，pH6.0枸櫞酸鹽溶液中，加熱至98℃進行抗原修復，30min后冷卻至室溫，3%H2O2去離子水室溫孵育20min，正常兔血清封閉液室溫孵育20min。采用免疫組織化學方法檢測。將切片置入抗OX-42抗體稀釋液（1∶10，Chem icon），室溫孵育24h；生物素標記相應種屬抗體（1∶200，Sigma，博士德公司分裝），室溫放置2h；生物素-卵白素-辣根過氧化物酶復合物（1∶500，Sigma，博士德公司分裝），室溫浸泡2h。OX-42陽性產物呈藍色，位于小膠質細胞胞漿。陰性對照以0.01mol/L PBS代替抗OX-42抗體液，亦按生物素化酶復合物法進行染色。結束染色的切片經漂洗后脫水、透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。應用MIAS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)在高倍鏡下（×400）對脊髓背角淺層進行平均灰度分析，每個脊髓標本隨機選取5張切片，求其灰度的平均值。

1.5 脊髓MCPmRNA和DAFmRNA表達的測定：采用RT-PCR法檢測。取L4～5節(jié)段脊髓背角，用Trizon提取總RNA，紫外分光光度儀測定RNA濃度。采用Primer premier5.0軟件設計引物，MCP上游引物5'-CTATGTTACAGGACCCTTCGT-3'，下游引物5'-CTCTTAGCACCACAGACCACC-3'，擴增片段為889bp；DAF上游引物5'-CTGAACGGTGAAGTAGGAGGA-3'，下游引物5'-TCAACTAGCCAGTGAGTAAGAG-3'，擴增片段為477bp；PCR反應條件95℃預變性5min后進行如下循環(huán)擴增，95℃變性1min，53℃復性2min，72℃延伸1min，共循環(huán)30次。PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)和凝膠分析系統(tǒng)進行PCR產物掃描和半定量分析，以MCP和DAF的條帶積分光密度值與GAPDH條帶積分光密度值的比值，表示MCPmRNA和DAF mRNA的表達。

1.6 統(tǒng)計學方法：應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以±s表示，分別采用重復測量設計資料的方差分析和單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 行為學結果：坐骨神經慢性壓迫損傷后大鼠后肢出現(xiàn)跛行，足呈輕度外翻狀，且有時出現(xiàn)如舔舐、懸空等后肢保護現(xiàn)象。各組痛閾值的基礎值比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與基礎值比較，Rsham組、Nsham組和RCCI組觀察期間機械痛閾值和熱痛閾值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Nsham組相比，NCCI組術后各觀察時間點機械痛閾值和熱痛閾值降低（P＜0.05）；與NCCI組相比，RCCI組大鼠機械痛閾值和熱痛閾值升高（P＜0.05）。見表1。

2.2 RT-PCR結果：與Nsham組相比，NCCI組MCPmRNA和DAFmRNA表達下降（P＜0.05），Rsham組和RCCI組MCPmRNA和DAFmRNA表達顯著升高（P＜0.05）；與Rsham組相比，RCCI組MCPmRNA和DAFmRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與NCCI組相比，RCCI組MCPmRNA和DAFmRNA表達升高（P＜0.05）。見表2。

2.3 免疫組織化學結果：Nsham組、Rsham組和RCCI組大鼠OX-42非特異性染色較淺，OX-42陽性細胞數量少；NCCI組OX-42染色深，OX-42陽性細胞數多。OX-42陽性細胞平均灰度值測定結果顯示，與Nsham組相比，NCCI組OX-42表達升高（P＜0.05），Rsham組和RCCI組MCPmRNA和DAFmRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與NCCI組相比，RCCI組OX-42表達降低（P＜0.05）。見表2。

表1 4組大鼠不同時間點熱痛閾值和機械痛閾值的比較Table 1 Com parison ofmechanical and thermal pain threshold in different time points in four groups（n=12，±s）

表1 4組大鼠不同時間點熱痛閾值和機械痛閾值的比較Table 1 Com parison ofmechanical and thermal pain threshold in different time points in four groups（n=12，±s）

*P＜0.05 vs Nshamgroup #P＜0.05 vs NCCIgroup by ANOVA test

Groups Thermal pain threshold（s）T0T1T2T3Mechanical pain threshold（g）T0T1T2T3Nsham18.1±2.5 14.7±1.7 16.6±2.3 17.8±2.2 15.2±1.9 13.5±3.1 13.8±2.8 14.7±2.5 NCCI17.5±1.9 13.8±3.2*11.6±2.1*10.9±3.0*14.8±3.2 7.6±1.9*8.8±2.5*8.2±1.4*Rsham17.7±2.9 14.9±2.2 16.8±1.8 17.4±3.5 15.6±2.0 13.8±1.5 15.4±2.2 15.3±1.7 RCCI17.9±3.6 14.3±2.2 16.1±3.2#16.8±2.7#15.4±3.0 13.2±1.5#15.8±1.5#14.9±2.3#

表2 4組大鼠脊髓背角OX-42陽性細胞平均灰度值和脊髓組織MCPm RNA、DAFm RNA表達的比較Table 2 Comparison of OX-42 positive cell，MCPmRNA and DAFm RNA in four groups (n=6，±s）

表2 4組大鼠脊髓背角OX-42陽性細胞平均灰度值和脊髓組織MCPm RNA、DAFm RNA表達的比較Table 2 Comparison of OX-42 positive cell，MCPmRNA and DAFm RNA in four groups (n=6，±s）

*P＜0.05 vs Nshamgroup #P＜0.05 vs NCCIgroup by ANOVA test

Groups MCPmRNA DAFmRNA OX-42 positive cell Nsham1.12±0.23 1.15±0.26 155±17 NCCI0.51±0.20*0.49±0.37*179±26*Rsham1.48±0.22 1.52±0.46 154±25 RCCI1.53±0.33#1.49±0.29#157±21#

3 討 論

補體異常活化在許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，以補體調節(jié)蛋白為靶標抑制補體活化是治療疾病的策略之一［4-8］。大量研究［1，9-10］表明，NPP大鼠脊髓背角發(fā)生補體異?；罨匝a體調節(jié)蛋白為靶標來治療NPP值得研究。

本研究采用武漢大學生命科學院提供的MCP/DAF雙基因重組轉染SD大鼠，是利用人補體調節(jié)蛋白基因DAF和MCP整合在轉化的SD大鼠神經細胞的染色體上，連續(xù)傳代30次獲得的MCP/DAF雙基因重組轉染SD大鼠。RT-PCR測定顯示，MCP/DAF雙基因重組轉染SD大鼠脊髓中MCPmRNA和DAFmRNA表達顯著高于正常SD大鼠。提示本研究采用的MCP/DAF雙基因重組轉染SD大鼠是可靠的。

慢性坐骨神經壓迫損傷是研究NPP的經典模型，本研究參考文獻采用鉻制羊腸線4道環(huán)形結扎手段實現(xiàn)大鼠右側坐骨神經慢性壓迫性損傷，結果顯示，損傷側后爪收攏，不敢著地，熱痛閾值和機械痛閾值均明顯減低，提示本研究制作的坐骨神經慢性壓迫性損傷是成功的。OX-42是小膠質細胞的特異性標記物，在靜止狀態(tài)下，小膠質細胞很少表達OX-42，只有在激活狀態(tài)，小膠質細胞大量表達OX-42，本研究通過觀察OX-42的表達來了解大鼠脊髓背角小膠質細胞的活化情況。

本研究結果顯示，慢性坐骨神經壓迫損傷后，沒有誘發(fā)MCP/DAF雙基因重組轉染SD大鼠產生痛覺過敏現(xiàn)象。而正常SD大鼠在慢性坐骨神經壓迫損傷后出現(xiàn)明顯的痛覺過敏現(xiàn)象；本研究中還采用免疫組織化學手段觀察脊髓中小膠質細胞活化情況，結果顯示MCP/DAF雙基因重組轉染SD大鼠慢性坐骨神經壓迫損傷后脊髓背角沒有發(fā)現(xiàn)明顯的小膠質細胞活化，而正常SD大鼠在慢性坐骨神經壓迫損傷后出現(xiàn)明顯小膠質細胞活化現(xiàn)象。提示MCP/DAF的表達改變可影響大鼠遭遇外周神經損傷后脊髓中小膠質細胞的活化，進而影響大鼠痛覺過敏的形成。DAF和MCP為膜結合型補體調節(jié)蛋白，它們可阻斷補體級聯(lián)反應，保護宿主細胞免受傷害。NPP大鼠脊髓背角發(fā)生了補體異常活化，活化的補體蛋白不僅激活小膠質細胞，而且影響脊髓背角感覺神經元的興奮性，促使神經元釋放大量興奮性神經遞質，這些興奮性神經遞質通過突觸間隙作用于突觸后神經元，使傷害性信息不斷上傳，經過大腦的信息整合，產生痛覺過敏現(xiàn)象［10］。MCP/DAF雙基因重組轉染大鼠其MCP/DAF表達增加，阻斷脊髓背角補體級聯(lián)反應，從而抑制NPP的形成。

綜上所述，MCP/DAF雙基因重組轉染大鼠可抑制外周神經損傷引起的痛覺過敏。表明提高脊髓中MCP/DAF的表達，可在一定程度上對NPP治療發(fā)揮作用。本研究只是為NPP的治療靶標提供新思路，如何治療NPP還有待進一步研究。

［1］ MIKA J，ROJEWSKA E，MAKUCHW，et al.Minocycline reduces the injury-induced expression of prodynorphin and pronociceptin in the dorsal rootganglion in a ratmodel of neuropathic pain［J］. Neuroscience，2010，165（4）：1420-1428.

［2］ 王金保，王姝媛，王琪，等.眼睛蛇毒因子對神經病理性疼痛大鼠脊髓背角神經元的保護效應［J］.臨床麻醉學雜志，2010，26（4）：1129-1133.

［3］ 胡興國，范素貞，張云翔，等.脊髓NF-κB信號通路在大鼠持續(xù)性術后痛中的作用［J］.中華麻醉學雜志，2011，31（7）：833-836.

［4］ KAIKKONEN MU，MAATTA AI，YL?-HERTTUALA S，et al. Screening of complement inhibitors：shielded baculoviruses increase the safety and efficacy of gene delivery［J］.Mol Ther，2010，18（5）：987-992.

［5］ DAS N，BISWAS B，KHERA R.Membrane-bound complement regulatory proteins as biomarkers and potential therapeutic targets for SLE［J］.Adv Exp Med Biol，2013，735（6）：55-81.

［6］ 陳杰文，方艷偉.CD105與人腦膠質瘤研究進展［J］.河北醫(yī)科大學學報，2012，33（1）：122-124.

［7］ WIRSTLEIN P，MIKOLAJCZYKM，SKRZYPCZAK J.Assessment of the transcription levels for the complement activation control system in eutopic endometrium in women with two or more consecutive miscarriages of unknown etiology［J］.Folia Histochem Cytobiol，2010，30，48（3）：328-332.

［8］ 趙瓊，孫黔云，楊慶雄.香椿果抗補體活性多酚對補體損傷神經細胞的保護作用研究［J］.中國藥理學通報，2011，27（8）：1086-1090.

［9］ KUSNER LL，KAMINSKI HJ.The role of complement in experimental autoimmunemyasthenia gravis［J］.Ann N Y Acad Sci，2012，1274（12）：127-132.

［10］ BORSOOK D，BECERRA L，Hargreaves R.Biomarkers for chronic pain and analgesia.Part 1：the need，reality，challenges，and solutions［J］.Discov Med，2011，11（58）：197-207.

（本文編輯：趙麗潔）

EFFECT OF CHRONIC CONSTRICTIVE INJURY TO SCIATIC NERVE ON MCP-DAF TRANSGENIC RAT

WANG Jinbao1，WANG Qi1，ZHU Haijuan1，CAIZenghua1，WANG Yuan2
(1.Department of Anesthesiology，Bethune International Peace Hospital of PLA，Shijiazhuang 050082，China；
2.Department of Infection Control，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050011，China）

ObjectiveTo investigate the effect of chronic constrictive injury（CCI）to sciatic nerve on the behavior of MCP-DAF transgenic rats，and to find a new way to treat neuropathic pain（NPP）.MethodsTwenty-four MCP-DAF transgenic SD rats weighting 200-250kg were randomly divided into two groups（n=12）Rshamgroup and RCCIgroup，while twenty-four adult male SD rats weighting 200-250kg were randomly divided into two groups（n=12）：Nshamgroup and NCCIgroup. Sciatic nerve on one side was exposed and 4 loose ligatures were placed on the sciatic nerve at 1 mm intervalswith 4-0 catgut in rat in NCCIgroup and RCCIgroup.Mechanical and thermal pain threshold were measured by paw withdrawal latencies to von frey hair and radiant heat stimulation at1 d before operation（baseline）and 1，3，7 d after operation.The animals were killed at 7 d after operation and the L4-5segment of the spinal cord was removed for determination of expression of membrane cofactor protein（MCP）mRNA and decay accelerating facto（r DAF）mRNA（by reverse-transcription PCR［RT-PCR］）and OX-42（by immuno-histochemistry）.Resultscompared with Nshamgroup，the pain threshold was significantly decreased in NCCIgroup and no obvious change in rats in Rshamgroup and RCCIgroup；the expression of MCP mRNA and DAF mRNA were significantly decreased in spinal cord in rats in NCCIgroup，and were increased in Rshamgroup and RCCIgroup；the expression of OX-42 in spinal cord was obviously increased in rats in NCCIgroup，but had no significant change in Rshamgroup and RCCIgroup. Conclusion The hyperalgesia was not induced by chronic constrictive injury to sciatic nerve in MCPDAF transgenic rats，which can offer a new way to treat the NPP.

sciatic neuropathy；pain threshold；rats

R735.7

A

1007-3205（2013）09-0997-04

2013-02-25；

2013-04-17

國家自然科學基金資助項目（30772077），河北省自然科學基金資助項目（2010001881）

王金保（1974-），男，河南衛(wèi)輝人，中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事神經病理學疼痛發(fā)病機制研究

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.09.003