甲霜靈在人參和土壤中的殘留動(dòng)態(tài)1)

王春偉 許允成 高 潔 王 燕

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春，130118)

甲霜靈即N－(2－甲氧基乙?；?－N－(2，6－二甲苯基)－D，L－丙氨，屬酰胺類殺菌劑，高效低毒、殘效期長(zhǎng)，具有很強(qiáng)的保護(hù)和治療作用［1］，屬于特異性位點(diǎn)抑制劑［2］，作用機(jī)制是通過抑制卵菌綱真菌的蛋白質(zhì)合成而起作用。甲霜靈能透過種皮，隨著種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)，可內(nèi)吸傳導(dǎo)到植株的根莖葉，并隨植物體內(nèi)水分運(yùn)轉(zhuǎn)而轉(zhuǎn)移到植物的各器官，可以做莖葉處理、種子處理和土壤處理。可有效防治霜霉病菌、疫霉病菌和腐病菌引起的多種作物霜霉病，瓜果蔬菜類的疫霉病、谷子白發(fā)病、煙草黑脛病、大豆根腐病、花生根腐病、棉花猝倒病、水稻爛秧病和向日葵霜霉?。?］。最近幾年甲霜靈作為防治苗期根部病害和疫病的藥劑在人參上得到了廣泛應(yīng)用［4］。

目前，國(guó)外對(duì)中藥材中農(nóng)藥殘留日益重視，并制定了嚴(yán)格的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，農(nóng)殘問題已成為我國(guó)人參出口的主要障礙［5］。甲霜靈的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法［6］、高效液相色譜法［7－8］、氣質(zhì)聯(lián)用［9－11］、液質(zhì)聯(lián)用［12］等，其在水果、蔬菜上的殘留檢測(cè)方法和殘留限量有報(bào)道［8－11］，但在人參上的殘留檢測(cè)方法和殘留限量未見報(bào)道。液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(LC－MS/MS)是以質(zhì)譜儀為檢測(cè)手段，集高效液相色譜(HPLC)高分離能力與質(zhì)譜(MS)高靈敏度和高選擇性于一體的分離分析方法，具有靈敏度高、廣譜性強(qiáng)、抗干擾好等優(yōu)點(diǎn)。為此，本試驗(yàn)采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究了甲霜靈在人參和土壤中的檢測(cè)方法并制定了最大殘留限量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1110 高效液相色譜儀(ChemStantion 工作站，美國(guó)安捷倫公司)，色譜柱為Kromasil Eternity－5－C18，2.1 mm×150 mm;API 4000 液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Applied Biosystems 公司);組織搗碎機(jī)(20 000 r/min);T18 ULTRA－TURRAX 勻漿機(jī)(德國(guó)IKA 公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀SA31(瑞士Büchi 公司);Mettler PL1500－s 電子天平(0.01 g);彩色單道移液槍(1、5、10 mL)(德國(guó)Eppendorf 有限公司);固相萃取柱:迪馬公司ProElut GPR 固相萃取柱(1.5 g，12 mL);渦漩混勻器;離心機(jī):10 000 r/min;醫(yī)用注射器，0.22 μm 濾膜等。

甲苯為色譜純;丙酮、乙腈、甲酸均為優(yōu)級(jí)純(GR);水為GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水;甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品純度為98.0%，由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息中心提供;35%甲霜靈拌種劑由浙江禾本農(nóng)藥化學(xué)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)

人參上的消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)為土壤拌土處理，一次施藥，多次采樣。施藥劑量為5 250 g/hm2(推薦劑量的1.5 倍)，小區(qū)面積為15 m2，3 次重復(fù)。分別在施藥后的采樣間隔為0(在施藥后藥液基本風(fēng)干的2 h 之內(nèi))、7、14、21、28、35 d 采樣。土壤采樣每小區(qū)按對(duì)角線取5 點(diǎn)，深度為0 ～10 cm，四分法留樣2.0 kg;人參五點(diǎn)法取樣，樣品為1.0 kg。同期采集空白樣品，標(biāo)簽標(biāo)記后于－20 ℃條件下保存待測(cè)［13］。

1.2.2 最終殘留試驗(yàn)

設(shè)2 個(gè)處理分別為3 500 g/hm2和5 250 g/hm2，設(shè)空白小區(qū)，每處理設(shè)3 次重復(fù)。在施藥后的14、21、35 d 和人參收獲期采集人參樣品，同期采集空白樣品，采樣方法同1.2.1。－20 ℃條件下保存待測(cè)。

1.2.3 樣品前處理方法

提取方法:稱?。?0 ℃冷凍保存的鮮人參、土壤樣品各100 g，依次用搗碎機(jī)將樣品粉碎;取1 g 樣品于50 mL 離心管中，加入丙酮20 mL，用渦漩混勻器混合1 min 后以8 000 r/min 離心5 min;取上清液，再向離心管中加入20 mL 丙酮，重復(fù)提取1 次;合并上清液于35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入5 mLV(乙腈)∶V(甲苯)=3 ∶1 乙腈—甲苯溶解，待凈化。

固相萃取凈化(SPE):10 mL V(乙腈)∶V(甲苯)= 3 ∶1 預(yù)淋洗GPR 固相萃取柱，流出液棄去。將5 mL 溶解液傾入GPR 固相萃取柱中，用20 mL V(乙腈)∶V(甲苯)=3 ∶1 進(jìn)行洗脫。收集全部洗脫液于雞心瓶中，于35 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干。用乙腈溶解，并定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后供LC－MS/MS 測(cè)定。

1.2.4 檢測(cè)方法

色譜柱柱溫度:40 ℃;流動(dòng)相為V(甲酸水)∶V(乙腈)= 1 ∶9，其中甲酸水為V(甲酸)∶V(水)=1 ∶999;流速250 μL/min;離子源溫度為725 ℃;進(jìn)樣量10 μL;正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);電離方式為電噴霧(ESI)，電噴霧電壓5 500 V，霧化氣壓力為0.483 MPa;氣簾氣壓力為0.138 MPa，輔助加熱氣壓力為0.379 MPa。甲霜靈的質(zhì)譜檢測(cè)條件見表1。

表1 甲霜靈的ESI－MS 的質(zhì)譜檢測(cè)條件

1.2.5 定性測(cè)定

利用串聯(lián)質(zhì)譜作為檢測(cè)器進(jìn)行定性分析，在上述條件下，甲霜靈的出峰時(shí)間為4.13 min。甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量濃度為0.01 μg/g)的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖見圖1。

圖1 甲霜靈液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖

在扣除背景后的樣品譜圖中，各定性離子的相對(duì)豐度與質(zhì)量濃度接近，且與同樣條件下的標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖相比，最大允許相對(duì)偏差不超過表2中的規(guī)定范圍。

表2 定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許相對(duì)偏差

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別準(zhǔn)確稱取甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.1 mg)，置于100.0 mL 容量瓶中，用丙酮溶解，并定容至刻度配制成質(zhì)量濃度100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用移液管準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，根據(jù)需要用空白基質(zhì)液定容配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.5 mg/L 5 個(gè)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 方法的準(zhǔn)確度、精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取空白對(duì)照區(qū)的1 g 土壤、1 g 人參空白試樣，分別添加適量甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.01、0.02、0.2 μg/g，按1.2.3 所述方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)添加試驗(yàn)設(shè)定10 個(gè)平行和1 個(gè)對(duì)照，計(jì)算添加回收率、變異系數(shù)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.8 方法的穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取不同基質(zhì)的空白樣品各1.0 g，分別添加適量甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02 μg/g，5 h 后按1.2.3 所述方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)添加試驗(yàn)設(shè)定10 個(gè)平行和1 個(gè)對(duì)照，計(jì)算添加回收率、變異系數(shù)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

甲霜靈在0.01 ～0.5 mg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度與響應(yīng)值有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，線性方程為Y=30 300X+247 000，相關(guān)系數(shù)為0.999 3。

圖2 甲霜靈的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法的準(zhǔn)確度、精密度、最低檢出限

方法的準(zhǔn)確度用添加回收率來(lái)表示，精密度用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示。

對(duì)10 個(gè)近似空白的樣本進(jìn)行測(cè)定，得出響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)差，按最小檢出限為空白值3 倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，將峰面積換算成被測(cè)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，甲霜靈的最小檢出限為0.01 μg/g。

取空白人參和土壤試樣1.0 g，分別添加0.01、0.02、0.20 μg/g 3 個(gè)水平，甲霜靈在人參和土壤中的平均添加回收率分別為88.70% ～90.40%，86.56 ～92.70%，變異系數(shù)分別為6.60% ～8.51%，4.80% ～6.24%，符合殘留試驗(yàn)要求，結(jié)果見表3。

表3 甲霜靈在人參及土壤中的添加回收率

2.3 方法的穩(wěn)定性

當(dāng)添加0.02 μg/g，5 h 后測(cè)定，甲霜靈在人參和土壤中的平均添加回收率分別為86.50%，83.50%，變異系數(shù)分別為6.70%，8.95%，見表3。通過對(duì)比2.2 試驗(yàn)結(jié)果，回收率、變異系數(shù)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差變化很小，表明本方法具有很好的穩(wěn)定性。

表3 甲霜靈在人參及土壤中的添加回收率

2.4 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)

通過2011年在吉林省撫松縣的田間試驗(yàn)研究了甲霜靈在人參和土壤中的降解動(dòng)態(tài)。從表4可知:甲霜靈在人參根和土壤中降解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程Ct=C0e－Kt。其中:Ct為施藥后間隔時(shí)間t 時(shí)農(nóng)藥質(zhì)量分?jǐn)?shù);C0為施藥后的原始沉積量;K為降解速率常數(shù);t 為施藥后的時(shí)間。由此可求出降解半衰期t1/2=ln2·K－1。試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換與回歸分析，在5 250 g/hm2處理劑量下，甲霜靈在人參根和土壤中半衰期分別為15.04、6.67 d，屬于易降解農(nóng)藥(t1/2＜30 d)。

2.5 最終殘留試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明:施用35%甲霜靈拌種劑，3 500 g/hm2劑量下人參和土壤中的殘留量分別為0.009、0.004 8 μg/g;5 250 g/hm2劑量下人參和土壤中的殘留量分別為0.017、0.010 4 μg/g，見表5。

表4 甲霜靈在人參根和土壤中的消解動(dòng)態(tài)

表5 甲霜靈在人參和土壤中的最終殘留

3 結(jié)束語(yǔ)

建立了液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)甲霜靈在人參及土壤中的殘留方法。研究結(jié)果表明，甲霜靈在人參和土壤中的平均添加回收率分別為88.70% ～90.40%和86.56 ～92.70%，變異系數(shù)分別為6.60% ～8.51%和4.80% ～6.24%。該方法測(cè)定人參及土壤中的甲霜靈殘留，操作簡(jiǎn)單，定性、定量準(zhǔn)確，精密度高，重現(xiàn)性好，檢出限低，能滿足生產(chǎn)上對(duì)甲霜靈檢測(cè)限量的要求。

試驗(yàn)結(jié)果表明:按5 250 g/hm2劑量施藥，甲霜靈在人參和土壤中的降解半衰期分別為15.04 d 和6.67 d，甲霜靈在土壤中的消解率明顯快于人參，可能是因?yàn)橥寥乐形⑸锝到獾淖饔?。我?guó)尚未制定甲霜靈在人參中最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，而韓國(guó)規(guī)定甲霜靈在紅人參中最大殘留限量為2 μg/g，在干人參中最大殘留限量為0.5 μg/g，日本制訂的人參殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為0.05 μg/g，歐盟制訂的人參殘留限量標(biāo)準(zhǔn)0.1 μg/g［14］。因此，參照以上殘留限量規(guī)定及田間試驗(yàn)殘留動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)，35%甲霜靈拌種劑在施藥劑量為3 500 ～5 250 g/hm2時(shí)，施藥1 次，建議人參根中最大殘留限量值為0.05 μg/g，人參的安全間隔期為14 d。

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