GFP標(biāo)記Lewis肺癌細(xì)胞3LL頸內(nèi)動(dòng)脈注射建立腦轉(zhuǎn)移癌動(dòng)物模型的可行性研究＊

徐 磊，周 偉，劉 科

（重慶市急救醫(yī)療中心神經(jīng)外科 400014）

肺癌是當(dāng)今世界上對(duì)人類健康和生命威脅最大的惡性疾病之一，肺癌腦轉(zhuǎn)移（lung cancer brain metastasis）是肺癌患者主要的死亡原因，也是肺癌治療失敗的常見原因之一，肺癌腦轉(zhuǎn)移的主要途徑是通過血運(yùn)轉(zhuǎn)移。血運(yùn)性腦轉(zhuǎn)移癌的發(fā)病率較高、臨床預(yù)后極差，影響因素錯(cuò)綜復(fù)雜。本研究使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的Lewis肺癌細(xì)胞系3LL通過頸內(nèi)動(dòng)脈注射入C57BL／6小鼠腦部，建立血運(yùn)性腦轉(zhuǎn)移癌模型，觀察肺癌腦轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 C57BL／6小鼠16只，雌雄各8只，4月齡，雄性體質(zhì)量（35±1）g，雌性體質(zhì)量（30±1）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.1.2 細(xì)胞株 Lewis lung cancer cell line 3LL細(xì)胞購(gòu)自A-merican Type of Cell Culture （ATCC，Cat.CRL1642），與C57BL／6小鼠有相同遺傳背景。

1.1.3 試劑 pGPU6-GFP-Neo siRNA質(zhì)粒來自GenePharma。Lippo2000來自Invitrogen。高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司、胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青生物工程公司；一抗羊多聚抗中間絲蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）來自Santa Cruz，二抗HRP多聚抗羊來自Sigma-Aldrich。牛血清清蛋白來自鹽城賽寶生物科技有限公司。DAB來自DAKO公司。

1.1.4 特殊手術(shù)器械 BD Micro-Fine 31Gx5mm胰島素注射針頭。自制注射器。Hugo Sachs Elektronik微血管夾（Micro Vascular Clips）購(gòu)自東樂自然基因生命科學(xué)公司。

1.1.5 設(shè)備 奧林巴斯BX41光學(xué)顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 GFP轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系 使用Invitrogen公司Lippo2000標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)GPU6-GFP-Neo siRNA vector轉(zhuǎn)染進(jìn)Lewis肺癌細(xì)胞系3LL，用1 000μg／mL G418篩選1周后，改用500μg／mL濃度維持篩選壓力，生長(zhǎng)至6個(gè)10cm培養(yǎng)皿細(xì)胞滿90%時(shí)用流式細(xì)胞儀篩選出GFP表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性的10%細(xì)胞，如此篩選重復(fù)3次，建立100%GFP強(qiáng)陽(yáng)性的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。為了保證盡可能多的細(xì)胞基因型存在，避免單克隆株篩選法篩選到不具備致病力的細(xì)胞，不采用挑選單克隆株的辦法。如圖1。

圖1 100%穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP的Lewis肺癌3LL細(xì)胞系（×200）

1.2.2 頸內(nèi)動(dòng)脈注射Lewis 3LL肺癌細(xì)胞建立肺癌腦轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型及分組 采用的頸內(nèi)動(dòng)脈注射法系Schackert和Fidl改良法［1］，C57BL／6小鼠腹腔注射氯胺酮（5mg／kg）／甲苯噻嗪（50mg／kg）的混合物以麻醉，麻醉后放置在解剖顯微鏡下的塑料板上。用橡皮筋放置在門齒之間固定小鼠頭部。頸部備皮、消毒后。做2cm長(zhǎng)正中切口，暴露氣管，分離胸鎖乳突肌及肩胛舌骨肌暴露頸動(dòng)脈鞘，游離頸動(dòng)脈，近心端和遠(yuǎn)心端各放置1枚微血管夾。閉合近心端微血管夾，用BD 31G針頭輕輕挑破頸動(dòng)脈，插入自制注射器至頸內(nèi)動(dòng)脈。將100 000細(xì)胞／20μL Lewis 3LL肺癌細(xì)胞緩慢注入20μL，再緩慢追加20 μL PBS。穿刺點(diǎn)遠(yuǎn)端上微血管夾，取出注射器，10-0強(qiáng)生公司prolene縫線縫合血管穿刺口，取出微血管夾，輕壓頸動(dòng)脈穿刺點(diǎn)1～3min以止血，縫合皮膚。術(shù)畢使用熒光影像系統(tǒng)檢測(cè)帶綠色熒光蛋白的3LL細(xì)胞注射入腦成功。麻醉復(fù)蘇后次日，從存活的15只小鼠中隨機(jī)選擇雌雄各6只，用熒光影像系統(tǒng)檢測(cè)后隨機(jī)按雌雄各分為2組，每組3只：雄性2組編號(hào)分別為M1、M2，雌性2組編號(hào)分別為F1、F2。

1.2.3 記錄 接種完成后，每天早、晚2次觀察手術(shù)部位有無感染，每日稱量小鼠體質(zhì)量并記錄，繪制曲線，觀察小鼠有無毛發(fā)混亂、弓背、行走不穩(wěn)等癥狀出現(xiàn)，選用全身嚴(yán)重衰竭、行走不穩(wěn)、呼吸短促、體質(zhì)量下降30%以上作為處死標(biāo)準(zhǔn)。記錄小鼠處死時(shí)間。

1.2.4 收集腦組織和病理染色

1.2.4.1 小鼠多聚甲醛灌注固定 小鼠腹腔注射氯胺酮（50 mg／kg）／甲苯噻嗪（5mg／kg）的混合物深度麻醉平穩(wěn)后，在解剖顯微鏡下剪開胸腔，暴露心臟。吊瓶里裝入預(yù)冷PBS，將輸液套筒針刺入左心室（心尖處），打開輸液開關(guān)，快速灌注。同時(shí)在右心房剪一小口，使血液和灌洗液可以排出。灌入約50 mL生理鹽水后，觀察從右心房流出的液體已經(jīng)變成無色透明，說明血液已經(jīng)沖洗干凈。換1個(gè)裝有過濾后預(yù)冷過的4%多聚甲醛的吊瓶繼續(xù)輸液。當(dāng)多聚甲醛輸入體內(nèi)時(shí)，小鼠會(huì)劇烈抽搐。待抽搐停止后，再持續(xù)輸注4%多聚甲醛5min（每只小鼠量共約100mL），多聚甲醛即可將小鼠體內(nèi)各臟器充分固定，牽拉四肢有僵硬感。此時(shí)已經(jīng)固定完畢，可以取出腦組織。

1.2.4.2 病理和免疫組織化學(xué)染色鑒定 收集腦組織，更換4%多聚甲醛3次并用70%乙醇溶液漂洗3次后，脫水、固定、包埋、切片、烘干。染色時(shí)二甲苯脫蠟后梯度乙醇水化。（1）直接H＆E染色封片；（2）浸泡在枸櫞酸抗原修復(fù)液中加熱做抗原修復(fù)，PBS漂洗后1%過氧化氫-50%甲醇溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS漂洗后5%牛血清清蛋白溶液封閉20min，加1∶500稀釋的一抗羊多聚抗GFAP 4℃孵育過夜，PBS漂洗后加1∶200稀釋的二抗HRP抗羊孵育30min，PBS漂洗后鏡下觀察控制DAB染色時(shí)間，及時(shí)PBS漂洗，漂洗終止染色，H＆E染色封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，多組間的比較采用單因素χ2分析，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 體質(zhì)量觀察 見表1。

表1 頸內(nèi)動(dòng)脈注射GFP（＋）3LL細(xì)胞后C57BL／6小鼠體質(zhì)量觀察（g）

續(xù)表1 頸內(nèi)動(dòng)脈注射GFP（＋）3LL細(xì)胞后C57BL／6小鼠體質(zhì)量觀察（g）

2.2 存活時(shí)間 見表2、圖2。

表2 頸內(nèi)動(dòng)脈注射GFP（＋）3LL細(xì)胞后小鼠生存時(shí)間（d）

圖2 頸內(nèi)動(dòng)脈注射3LL細(xì)胞后小鼠生存時(shí)間

2.3 腦組織熒光顯微鏡觀察 見圖3。

圖3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后GFP（＋）的3LL細(xì)胞注射3周后鼠腦（×20）

2.4 病理染色 見圖4～5。

圖4 頸內(nèi)動(dòng)脈注射3周后腦內(nèi)多發(fā)轉(zhuǎn)移性腫瘤

圖5 頸內(nèi)動(dòng)脈注射4周后腦內(nèi)融合的轉(zhuǎn)移性腫瘤

3 討 論

3.1 肺癌腦轉(zhuǎn)移是最常見的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，患者的中位生存時(shí)間僅為2～3個(gè)月，即使積極手術(shù)切除、放療、化療，也僅僅只能延長(zhǎng)它的中位生存期至6～8個(gè)月［2］。肺癌腦轉(zhuǎn)移是臨床上肺癌患者病情發(fā)展或晚期的表現(xiàn)，是肺癌患者死亡的主要原因，也是治療肺癌失敗的常見原因之一，無論是否手術(shù)切除原發(fā)病灶，有50%～60%的肺癌患者最終會(huì)發(fā)生腦轉(zhuǎn)移［3］。隨著CT、MRI、PET、SPECT等各種影像學(xué)檢查手段的不斷進(jìn)步［4］，肺癌腦轉(zhuǎn)移的早期檢出率大大提高，手術(shù)療效得到判斷［5-6］，患者的預(yù)后得到改善，生存時(shí)間得到延長(zhǎng)。但由于患者往往伴有因腦轉(zhuǎn)移灶占位以及瘤周腦組織水腫嚴(yán)重導(dǎo)致高顱壓所引起的劇烈頭痛、嘔吐、肢體偏癱、語(yǔ)言功能障礙、智力智能減退等神經(jīng)功能障礙癥狀，生活質(zhì)量極差。

3.2 肺癌腦轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前尚不明確，目前公認(rèn)的肺癌腦轉(zhuǎn)移的主要途徑是通過血運(yùn)。肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)快速、癌細(xì)胞之間縫隙連接松散使細(xì)胞容易脫落，癌細(xì)胞易脫落后移行進(jìn)入肺組織豐富的血管中，隨血液經(jīng)肺靜脈進(jìn)入體循環(huán)，隨頸動(dòng)脈或椎-基底動(dòng)脈上行到達(dá)腦組織后停留、聚集、黏附在終末血管床，增殖、腦血管內(nèi)皮包裹生長(zhǎng)、跨內(nèi)皮遷移穿透血腦屏障（bloodbrain barrier，BBB）［7］，形成轉(zhuǎn)移灶。要研究“轉(zhuǎn)移”，最可行的方法就是體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)加體內(nèi)實(shí)驗(yàn)——建立腫瘤轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。目前，建立腦轉(zhuǎn)移癌動(dòng)物模型的方法主要有4種：（1）腦內(nèi)局部原位注射；（2）皮下注射；（3）尾靜脈注射；（4）頸內(nèi)動(dòng)脈注射。其中腦內(nèi)原位注射建模成功率高，但一般只有單發(fā)腫瘤，且不能模擬腫瘤細(xì)胞自血管內(nèi)生長(zhǎng)移行透過血腦屏障的過程；皮下注射一般只產(chǎn)生局部腫塊，僅少數(shù)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，往往需要在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)反復(fù)傳代才可能有很低的概率誘發(fā)腦轉(zhuǎn)移；尾靜脈注射后發(fā)生腦以外的肺部、骨等其他部位轉(zhuǎn)移的概率高，建立腦轉(zhuǎn)移癌模型的成功率低。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中系使用100%穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP的Lewis 3LL肺癌細(xì)胞細(xì)胞經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈注射直接入腦建立小鼠腦轉(zhuǎn)移癌模型的方法。收集的注射3周以后腦組織標(biāo)本在熒光顯微鏡下觀察有綠色熒光蛋白的富集區(qū)域，證實(shí)有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP的Lewis 3LL肺癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)形成腫瘤。免疫組織化學(xué)染色見細(xì)胞核膜增厚，核大小、形狀、染色不一，核分裂像增多，核仁肥大數(shù)目增多，有雙核、多核、巨核及奇異形核，核內(nèi)染色加深，染色質(zhì)呈粗顆粒狀，分布不均勻，為惡性腫瘤的病理組織學(xué)特征。病灶周圍有激活的反應(yīng)性星型膠質(zhì)細(xì)胞增生，符合腦內(nèi)惡性腫瘤的生物學(xué)特性——就像一個(gè)永不愈合的傷口，起到與創(chuàng)傷性損傷類似的作用，導(dǎo)致反應(yīng)性星型膠質(zhì)細(xì)胞的增生［8-11］，而與此同時(shí)反應(yīng)性星型膠質(zhì)細(xì)胞又反過來保護(hù)腫瘤細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)［12-13］。證明這一模型能真實(shí)地模擬肺癌血運(yùn)型轉(zhuǎn)移的過程和結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)中采用的頸內(nèi)動(dòng)脈注射法直接模擬癌細(xì)胞在腦部的終末毛細(xì)血管床內(nèi)聚集、黏附、侵襲穿透血腦屏障、增殖和在腦血管內(nèi)皮包裹之下生長(zhǎng)、跨內(nèi)皮遷移穿透BBB形成轉(zhuǎn)移灶，長(zhǎng)出新生微血管的真實(shí)過程。頸內(nèi)動(dòng)脈注射顯微手術(shù)技術(shù)簡(jiǎn)單、手術(shù)技巧要求低，成功率高，本例手術(shù)存活率93.75%。使用的Lewis肺癌細(xì)胞與C57BL／6小鼠具有相同遺傳背景，建模成功率高，手術(shù)成功的小鼠術(shù)后100%發(fā)生腦轉(zhuǎn)移癌。未作特殊藥物處理的自然病程的小鼠中位數(shù)生存時(shí)間僅為24.5d，實(shí)驗(yàn)周期短，節(jié)約資金和人力成本。是一種經(jīng)濟(jì)有效的建立腦轉(zhuǎn)移癌動(dòng)物模型的方法。

3.3 頸內(nèi)動(dòng)脈注射手術(shù)技巧。術(shù)中鈍性分離胸鎖乳突肌及肩胛舌骨肌以暴露頸動(dòng)脈鞘，暴露困難時(shí)可剪斷肩胛舌骨肌。解剖游離出頸動(dòng)脈時(shí)注意不要過度牽拉或損傷迷走神經(jīng)以及頸動(dòng)脈鞘下方的頸交感干。上微血管夾時(shí)避開頸動(dòng)脈分叉處、迷走神經(jīng)以及頸交感干。手術(shù)中小鼠死亡1只，手術(shù)死亡率為6.25%?？紤]系牽拉迷走神經(jīng)導(dǎo)致心跳呼吸驟停，注射成功后10-0強(qiáng)生公司prolene縫線縫合血管穿刺口，輕壓頸動(dòng)脈穿刺點(diǎn)1～3min均即可以可靠止血。

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