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    6種海洋微藻β-葡聚糖的累積特征及其免疫活性分析

    2013-03-03 10:31:52周成旭劉寶寧陳海敏嚴小軍
    食品科學 2013年3期
    關(guān)鍵詞:微藻葡聚糖海洋

    田 甜,周成旭*,劉寶寧,陳海敏,嚴小軍

    (寧波大學 應用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室,浙江 寧波 315211)

    6種海洋微藻β-葡聚糖的累積特征及其免疫活性分析

    田 甜,周成旭*,劉寶寧,陳海敏,嚴小軍

    (寧波大學 應用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室,浙江 寧波 315211)

    跟蹤檢測6種海洋微藻在生長過程中單位細胞β-葡聚糖的含量變化,分析其累積時期、累積速率以及提取制備的得率和純度,并對幾種微藻來源的β-葡聚糖進行免疫活性檢測。結(jié)果表明:β-葡聚糖在微藻種群增殖的平臺期累積量最大,不同種類的微藻細胞累積β-葡聚糖能力差異較大。假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)具有較大的累積速率、提取制備得率以及較大的免疫活性。6種海洋微藻來源的β-葡聚糖都顯示比酵母來源的β-葡聚糖免疫活性高。

    海洋微藻;β-葡聚糖;累積效率;提取率;免疫活性

    葡聚糖又稱為右旋糖酐,廣泛分布在細菌、真菌、高等植物體內(nèi),有α-葡聚糖和β-葡聚糖兩種,α-葡聚糖一般沒有生物活性,多數(shù)具有明顯生物學活性的葡聚糖都是β-葡聚糖[1]。不同來源的β-葡聚糖,其結(jié)構(gòu)和生物活性都存在差異,真菌提取的如酵母β-葡聚糖,主鏈由1,3-β糖苷鍵連接,帶有由1,6-β糖苷鍵連接的分支,具有抗腫瘤活性;高等植物如燕麥β-葡聚糖,不僅帶有1,3-β和1,6-β糖苷鍵,還存在1,4-β糖苷鍵連接的分子內(nèi)連接[2],具有降低總膽固醇的作用[3]。即使是同種來源的β-葡聚糖,也可能同時具有單螺旋、三螺旋或隨機螺旋等立體構(gòu)象[4],從而表現(xiàn)多種生物活性,如防護系統(tǒng)增強劑(HDP)[5]、抗腫瘤[6]、抗感染[7]和免疫調(diào)節(jié)功能。β-葡聚糖既可作為膳食纖維來源,又是一種優(yōu)質(zhì)的保健食品添加劑,已被正式列入國家資源產(chǎn)品[8]。

    海洋微藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的最主要初級生產(chǎn)者,也是海洋生物資源的重要組成部分。海洋微藻生長速度快,單位面積產(chǎn)量大,相對于高等植物,可以更有效地利用陽光、水和二氧化碳等無機物合成有機物[9],而且在生產(chǎn)過程中不占用耕地,是未來海洋資源開發(fā)的重要對象。糖類是海洋微藻重要的代謝產(chǎn)物,海洋微藻多糖除了具有傳統(tǒng)的工業(yè)價值外,還具有多種生物活性及藥用功能[10],如增強機體免疫、抗病毒作用、抗惡性腫瘤、抗炎癥[11-15]。已有分析顯示,來源于微型藻類牟氏角毛藻的β-葡聚糖較市售產(chǎn)品的免疫活性高[16]。綜上所述,從微藻中提取高活性β-葡聚糖有重要科學意義。

    本實驗以微型藻類生產(chǎn)β-葡聚糖為目標,在實驗研究的基礎(chǔ)上,對幾種可以快速增殖的海產(chǎn)微型藻類β-葡聚糖的產(chǎn)生規(guī)律、制備產(chǎn)率和產(chǎn)量以及生物活性等進行分析,為微藻來源β-葡聚糖的選種、采收時機選擇等方面的研究和生產(chǎn)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    藻種及其培養(yǎng):選取6種海產(chǎn)微藻,均為寧波大學微藻種質(zhì)庫保存種質(zhì)。其中硅藻4種:中肋骨條藻(Skeletonema costatum (Greville) Cleve)、角毛藻(Chaetoceros debilis Cleve)、假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana Hasle & Heimdal)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum Bahl.)。金藻2種:等鞭金藻(Isochrysis galbana Parke)和一種顆石藻(Pleurochrysis sp.)。各種微藻在相同的培養(yǎng)條件下,用f/2培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境溫度20℃、光照度2500lx(白天:黑夜=12:12),每天搖瓶2次。每種藻設(shè)3個平行組,培養(yǎng)體積800mL,起始培養(yǎng)密度為1.9×105~2.1×105cells/mL。

    1.2 試劑與儀器

    β-葡聚糖標準品(純度>95%) 武漢百特純大分子科技有限公司;玻璃纖維濾紙 英國Whatman公司;小鼠腫瘤壞死因子-α ELISA試劑盒 武漢博士德生物有限公司;小鼠巨噬細胞(Raw 246.7) 武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心;剛果紅 上海遠航試劑廠;Sephadex G-50美國Pharmacia公司;其余試劑均為為國產(chǎn)分析純。

    GXZ-128A智能光照培養(yǎng)箱 寧波江南儀器有限公司;酶標儀 德國Thermo公司;UV-7540紫外-可見光分光光度計 上海欣茂儀器有限公司;TS100倒置生物顯微鏡 日本尼康公司;超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;BUCHI R-210/215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海萬捷科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 β-葡聚糖在種群生長過程中變化規(guī)律的研究

    1.3.1.1 微藻種群生長過程跟蹤

    以微藻懸浮液光密度值表征種群生長狀態(tài),培養(yǎng)微藻至平臺期,將藻液2倍稀釋成4個梯度,取200μL各梯度藻液至96孔板,于630nm波長測吸光度;同時用血球計數(shù)板計數(shù)對應藻液細胞密度,設(shè)3個平行,繪制藻液吸光度和對應細胞數(shù)的關(guān)系曲線。樣品檢測時,取200μL藻液至96孔板,于630nm波長處測吸光度。比照吸光度與細胞數(shù)關(guān)系曲線,計算細胞數(shù)。隔天取樣,培養(yǎng)至20d。

    1.3.1.2 種群生長過程中細胞內(nèi)β-葡聚糖含量測定

    參考Granum等[17]的方法,制作葡萄糖吸光度標準曲線。樣品測量時將藻液搖勻,吸取10mL藻液用玻璃纖維濾紙(Whatman CF/C)過濾,收集濾膜上的藻細胞。往藻細胞中加入5mL 0.05mol/L H2SO4,于60℃水浴加熱30min,再用玻璃纖維濾紙過濾,收集過濾液。取1mL濾液,于485nm波長處測吸光度,比照標準曲線計算相應的β-葡聚糖含量。隔天取樣,培養(yǎng)至20d。

    1.3.2 β-葡聚糖制備及其得率分析

    1.3.2.1 β-葡聚糖的提取制備

    按上述條件培養(yǎng)微藻至平臺期,4℃、4800r/min離心10min,收集藻細胞,冷凍干燥收集干藻粉。稱取一定量的各種藻粉,按照Hirokawa等[18]的方法提取葡聚糖,得到淡黃色蓬松纖維狀葡聚糖粗糖。

    參考何貺等[19]的方法:取粗糖溶解后進行Sephadex G-50柱層析純化,以純水洗脫,控制流速大約0.25mL/min,每管收集2.5mL分部收集。每管吸取少量收集液用苯酚-硫酸法檢測,按照管號對光密度繪制洗脫曲線,將最大峰處的洗脫液合并,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),冷凍干燥,得到淡黃色粉末狀葡聚糖純糖。

    1.3.2.2 β-葡聚糖的含量測定

    剛果紅法測β-葡聚糖含量:剛果紅與β-葡聚糖反應具有高度專一性,形成有色物質(zhì),當反應條件一致時,溶液中β-葡聚糖含量在一定范圍內(nèi)吸光度變化與β-葡聚糖濃度成正比[20],本研究以剛果紅法檢測粗糖樣品中β-葡聚糖純度。參考張娟等[21]的方法制作葡聚糖光密度標準曲線,樣品檢測時稱取0.005g樣品,加少量去離子水,70℃水浴助溶,再加去離子水至體積為10mL配成500μg/mL的樣品液,冰箱儲存?zhèn)溆?。測量時,取80μL的樣品液,添加去離子水至體積為1mL,配成40μg/mL葡聚糖溶液,再加入2mL剛果紅溶液,20℃水浴加熱30min后取1mL于545nm波長處測吸光度,比照標準曲線計算樣品液β-葡聚糖含量。

    1.3.3 β-葡聚糖免疫活性檢測

    1.3.3.1 細胞培養(yǎng)

    取小鼠巨噬細胞Raw 264.7細胞液1mL/孔于24孔板,37℃培養(yǎng)24h,控制細胞數(shù)為2×105cells/mL,再依次加入5、10、20μL 10mg/mL β-葡聚糖溶液,形成50、100、200μg/mL的質(zhì)量濃度梯度,留一個孔的細胞液不加葡聚糖作空白對照,培養(yǎng)24h后取出備用。

    1.3.3.2 免疫活性檢測

    收集細胞液,4℃、5000r/min離心5min,取上清液,按照小鼠腫瘤壞死因子-α ELISA試劑盒說明書操作ELISA實驗。每組做2個平行。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    實驗數(shù)據(jù)采用x±s表示。

    圖1 6種海產(chǎn)微藻培養(yǎng)增殖過程中細胞數(shù)和單位細胞β-葡聚糖含量變化特征Fig.1 Population growth and cellular β-glucan content variations in different species of marine microalgae

    2 結(jié)果與分析

    2.1 微藻培養(yǎng)過程中β-葡聚糖含量變化特征

    由圖1可知,比較6種海洋微藻在種群生長過程中單位細胞β-葡聚糖含量變化趨勢,受初始接種微藻狀態(tài)的影響,種群生長初期即在新的營養(yǎng)條件下都表現(xiàn)為胞內(nèi)β-葡聚糖降低,指數(shù)增長期中出現(xiàn)β-葡聚糖的最低值,以后各藻細胞中β-葡聚糖逐漸累積,到平臺期后期或衰亡期β-葡聚糖累積得最多。在進入平臺后期(或衰亡期)后,三角褐指藻、假微型海鏈藻和等鞭金藻細胞內(nèi)β-葡聚糖含量持續(xù)增加,中肋骨條藻、角毛藻和顆石藻單位細胞β-葡聚糖含量的增加則趨于平緩。顯示了不同種類對β-葡聚糖的代謝利用特征上的差異。

    表1 海產(chǎn)微藻單位細胞β-葡聚糖含量最小、最大值及累積倍增效率Table1 Maximum and minimum contents and cumulative doubling efficiency of β-glucans from different species of marine microalgae at the same culture

    進一步分析各種增殖培養(yǎng)過程中β-葡聚糖從最小值至最大值的累積效率。從表1可以看出,在相同培養(yǎng)條件下,不同微藻β-葡聚糖的累積量差異明顯。分析微藻種群增殖過程中,單位細胞β-葡聚糖含量從最低到最高變化過程發(fā)現(xiàn),假微型海鏈藻單位β-葡聚糖增加倍數(shù)最大,為1002.5%,增加速率最快,平均達71.61%/d,而其他微藻的增加倍率在200%~500%之間。顯示假微型海鏈藻細胞β-葡聚糖與生長代謝關(guān)系密切,利用其生產(chǎn)β-葡聚糖的可調(diào)節(jié)程度高。

    2.2 β-葡聚糖的得率和純度分析

    得率和純度都能反映提取方法的提取效率。由表2可見,中肋骨條藻、三角褐指藻、角毛藻和等鞭金藻提取β-葡聚糖的得率在0.2%以上、純度在91%以上,假微型海鏈藻和顆石藻提取β-葡聚糖的得率分別為0.346%和0.329%,純度分別為93.99%和94.21%,相對于其他微藻的得率和純度都較高??傮w來說,6種海產(chǎn)藻β-葡聚糖提取得率、純度跟平均值比較差距相對不大,可能是因為提取方法一樣。關(guān)于β-葡聚糖提取的方法較多,主要的提取方法有酸堿法[22]、酶法[23]等,比較Wood等[24]溫和堿法提取燕麥β-葡聚糖的得率達0.7%,純度低于90%,本提取方法提取β-葡聚糖的純度較高,提取得率卻比較低,今后需要改進提取條件進一步提高得率。

    表2 海產(chǎn)微藻β-葡聚糖提取效率Table2 Extraction efficiency ofβ-glucans from different species of marine microalgae

    2.3 β-葡聚糖免疫活性檢測

    腫瘤壞死因子(TNF-α)是目前發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強的細胞因子,它可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長。很多細胞都可以合成TNF-α,包括各種免疫細胞,如單核細胞、巨噬細胞、T細胞、B細胞等。將不同濃度的海洋微藻β-葡聚糖作用于小鼠單核巨噬細胞(RAW246.7),通過ELISA實驗觀察β-葡聚糖誘導TNF-α生成量的變化,結(jié)果如圖2所示。

    圖2 6種海洋微藻的生成量Fig.2 Production of TNF-α induced by β-glucans at different concentrations from different species of marine microalgaeβ-葡聚糖在不同濃度下誘導TNF-α

    將6種海產(chǎn)微藻β-葡聚糖作用于小鼠巨噬細胞均誘導TNF-α生成量的增加,由此可以推測海產(chǎn)微藻β-葡聚糖有具有激活巨噬細胞、促進細胞因子合成和抗腫瘤等生物學活性[25]。比較不同質(zhì)量濃度β-葡聚糖對Raw264.7細胞生成TNF-α量的影響,不同微藻來源的β-葡聚糖有質(zhì)量濃度相關(guān)的不同效應。對中肋骨條藻和顆石藻來源而言,TNF-α生成量隨β-葡聚糖質(zhì)量濃度增加而增加,在200μg/mL時TNF-α生成量最大;角毛藻和假微型海鏈藻的β-葡聚糖質(zhì)量濃度在100μg/mL時TNF-α生成量達到飽和,β-葡聚糖質(zhì)量濃度為200μg/mL TNF-α生成量跟100μg/mL沒有顯著差別;三角褐脂藻和等鞭金藻的β-葡聚糖質(zhì)量濃度為100μg/mL時TNF-α生成量最大,當質(zhì)量濃度為200μg/mL TNF-α生成量反而下降,顯示了免疫抑制的特點。

    由圖3可知,比較相同質(zhì)量濃度(100μg/mL)的幾種海洋微藻β-葡聚糖誘導TNF-α增加量,三角褐指藻來源的β-葡聚糖活性最大,角毛藻來源的β-葡聚糖活性最小,其他微藻來源的β-葡聚糖誘導TNF-α生成量在600~700pg/mL。與陳璐等[26]100μg/mL酵母β-葡聚糖誘導TNF-α最大增加量為232.18pg/mL相比,相同濃度海洋微藻β-葡聚糖誘導TNF-α增加量是酵母β-葡聚糖的2.5~3.2倍,所以海洋微藻來源的β-葡聚糖抗腫瘤活性高于酵母β-葡聚糖。

    增加量的比較Fig.3 Comparison of TNF-α production induced by 100 μg/mL β-glucans from different origins圖3 100μg/mL不同來源的β-葡聚糖誘導TNF-α

    3 結(jié) 論

    3.1 海產(chǎn)微藻細胞的β-葡聚糖在種群增殖過程中都發(fā)生變化,在平臺后期達到最大累積。

    3.2 由于海洋微藻生長及代謝的差異,使不同海洋微藻在種群生長過程中β-葡聚糖的累積特征和累積效率有所差別,并且其免疫活性也有所不同。但相同質(zhì)量濃度下,海產(chǎn)微藻來源β-葡聚糖的免疫活性均比酵母來源的β-葡聚糖活性高。

    3.3 假微型海鏈藻β-葡聚糖的累積速率和提取效率明顯高于其他海洋微藻;三角褐指藻提取的β-葡聚糖免疫活性最高,這兩種藻都可能成為今后β-葡聚糖重要的微藻來源。

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    Accumulation Features and Immuno-stimulative Effects of β-Glucans from Six Species of Marine Microalgae

    TIAN Tian,ZHOU Cheng-xu*,LIU Bao-ning,CHEN Hai-min,YAN Xiao-jun
    (Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

    The accumulation features of microalgal β-glucans, including accumulation phase and rate, have been characterized by monitoring the content of β-glucans from six marine microalgae during their growth cycles. The extraction and immuno-stimulative effects of β-glucans were also studied. The results indicated that the content of cellular β-glucans reached the maximum level at stationary phase for all microalgae, however, with large variation depending on species. Among six microalgae, Thalassiosira pseudonana showed outstanding features for its β-glucans with high accumulation rate, isolation yield, and significant immuno-stimulative effects. Therefore, the immuno-stimulative effects of β-glucans were higher from microalgae than that from yeast.

    marine microalgae;β-glucans;accumulative rate;extraction rate;immune activity

    Q945.79

    A

    1002-6630(2013)03-0188-05

    2012-10-20

    教育部“長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”項目(IRT0734);國家自然科學基金項目(31172448);浙江省重點基金項目(Z3100565);浙江省自然科學基金項目(LY12D06001);海洋可再生能源專項資金項目(GHME2001SW02);國家公益性行業(yè)(海洋)科研專項(201105009)

    田甜(1987—),女,碩士研究生,研究方向為微型藻類生理生態(tài)學。E-mail:liazajoy@163.com

    *通信作者:周成旭(1968—),女,副研究員,碩士,研究方向為海洋微型藻類的基礎(chǔ)研究及應用。E-mail:zhouchengxu@nbu.edu.cn

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