金針菇子實(shí)體多糖均一組分FVP60-C2制備及單糖組成分析

楊俊紅，張安強(qiáng)，孫培龍*

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

金針菇子實(shí)體多糖均一組分FVP60-C2制備及單糖組成分析

楊俊紅，張安強(qiáng)，孫培龍*

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

金針菇子實(shí)體經(jīng)水提醇沉得水溶性粗多糖，再經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱和凝膠柱層析純化，得到均一多糖FVP60-C2；采用高效液相色譜、紫外-可見光光譜全掃描和傅里葉變換紅外光譜研究其理化性質(zhì)；樣品經(jīng)三氟乙酸水解，乙酰衍生化后，用單糖標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，用氣相色譜分析其單糖組成。結(jié)果表明：FVP60-C2為均一多糖，平均分子質(zhì)量為1.429 ×104D；其是由巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的雜多糖，各單糖的物質(zhì)的量比為0.74:0.21:1.36:1.00:1.31。

金針菇；多糖；理化特征；氣相色譜；單糖組成

金針菇(Flammulina velutipes)又名樸菇、冬菇、構(gòu)菌、青杠菌、毛柄金錢菌，隸屬擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口蘑科，金錢菌屬[1]。金針菇含有豐富的VC、尼克酸等多種維生素及鈣、鐵等多種礦物質(zhì)[2-3]，具有眾多的藥理作用，是較普遍的藥食兩用真菌，具有廣闊的開發(fā)前景。金針菇多糖是金針菇中主要的生物活性物質(zhì)之一，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、護(hù)肝和抗氧化等作用[4-8]。目前有關(guān)金針菇多糖研究主要集中在粗多糖提取和生物活性[9-13]方面，對(duì)粗多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)分析研究還較少。本實(shí)驗(yàn)從金針菇中經(jīng)提取、純化獲得均一多糖FVP60-C2組分，應(yīng)用紫外-可見光光譜全掃描(UV)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)和高效液相色譜(HPLC)研究其理化性質(zhì)，應(yīng)用氣相色譜(GC)確定其單糖組成和物質(zhì)的量比，旨在為金針菇的精深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥金針菇子實(shí)體購(gòu)買于浙江江山縣，江山市農(nóng)業(yè)局農(nóng)科所鑒定。

DEAE-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S100和S400 High-Resolution填料 美國(guó)GE公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、單糖標(biāo)準(zhǔn)品(巖藻糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖)、硼氫化鈉 美國(guó)Sigma公司；三氟乙酸 德國(guó)Merck公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AKT? prime低壓層析儀 美國(guó)AKT?公司；RI2000示差檢測(cè)器 德國(guó)Schambeck SFD GmbH公司；Waters1525 高效液相色譜儀、Waters2414示差檢測(cè)器美國(guó)Waters公司；TSKgel G4000PWXL高效液相色譜柱 日本Tosoh公司；XK雙層層析柱(16mm×100cm、26mm×100cm) 美國(guó)GE公司；UV-2450PC紫外-可見分光光度儀 日本島津公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Nicolet公司；Agilent 7890A氣相色譜 美國(guó)Aglient公司。

1.3 金針菇多糖均一組分FVP60-C2的制備

1.3.1 粗多糖提取

稱取干燥金針菇子實(shí)體2kg，加20倍蒸餾水，于90℃水浴條件下提取3次，每次3h。合并3次浸提液，離心，減壓濃縮，濃縮液在攪拌下緩緩加入95%乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到40%，靜置過夜，離心，上清液中繼續(xù)加入乙醇至終體積分?jǐn)?shù)為60%，離心，收集沉淀，蒸餾水溶解，冷凍干燥，得多糖粗品FVP60。

1.3.2 粗多糖的分離純化

將粗多糖FVP60溶于蒸餾水中，配成1mg/mL溶液，10000r/min離心10min，取上清液經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱(XK 26mm×100cm)層析，每次上樣20mL，依次用蒸餾水洗脫500mL，0～2mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫200mL，2mol/L NaCl溶液洗脫200mL，蒸餾水洗脫600mL，自動(dòng)部分收集，每管10mL，苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)，根據(jù)糖顯色反應(yīng)收集多糖組分。

離子柱洗脫下來的樣品配制成10mg/mL水溶液，0.45μm膜過濾，采用AKT? prime層析系統(tǒng)進(jìn)一步純化。溶液先經(jīng)Sephacryl S100 High-Resolution凝膠柱(XK 16mm×100cm)脫鹽。上樣量：5mL；流速：1mL/min；每管5mL自動(dòng)部分收集，苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)，收集多糖組分。脫鹽后組分再用Sephacryl S400 High-Resolution凝膠柱(XK 16mm×100cm)按照上述洗脫條件進(jìn)一步純化，得到FVP60-C2均一組分。

1.4 FVP60-C2的純度及分子質(zhì)量[14]

采用Waters1525高效液相色譜系統(tǒng)。色譜柱：TSKgel G4000PWXL；流動(dòng)相：脫氣雙重蒸水；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：(30±1)℃；檢測(cè)器：Waters2414示差檢測(cè)器檢測(cè)。

取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖(分子質(zhì)量分別為1、5、12、80、150、270、670kD)配成適當(dāng)濃度的溶液，0.45μm膜過濾，進(jìn)樣10μL，測(cè)定保留時(shí)間。以分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(y)，保留時(shí)間為橫坐標(biāo)(x，min)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=—0.5854x+9.7143(R2=0.9935)。

取樣品2mg溶于2mL蒸餾水，微孔濾膜過濾，取濾液10μL進(jìn)樣，測(cè)得保留時(shí)間，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算分子質(zhì)量。

1.5 FVP60-C2的理化特征分析

1.5.1 紫外-可見光光譜全掃描檢測(cè)

稱取FVP60-C2樣品2mg，配成1mg/mL水溶液，采用紫外-可見分光光度計(jì)在200～800nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描檢測(cè)。

1.5.2 傅里葉變換紅外光譜分析[15]

取2mg干燥FVP60-C2樣品，采用KBr壓片，在4000～400cm-1內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.6 FVP60-C2的單糖組成分析

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品乙?；痆16-17]

精確稱取等物質(zhì)的量(2mmol)的半乳糖、木糖、巖藻糖、葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖，分別溶于3mL蒸餾水中，加入20～30mg硼氫化鈉(NaBH4)，于室溫下還原3h，然后用冰醋酸中和過量的NaBH4，加入3mL甲醇，減壓濃縮蒸干，重復(fù)4～5次，真空干燥過夜。加入4mL醋酐，100℃反應(yīng)1h，然后加入少量甲苯，減壓濃縮蒸干。將乙酰化后的產(chǎn)物用3mL氯仿溶解后轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入少量蒸餾水充分振蕩后，除去上層水層，如此重復(fù)4次，氯仿層以適量的無(wú)水硫酸鈉干燥，定容至10mL待GC分析。

1.6.2 樣品乙?；?/p>

取FVP60-C2樣品2mg，放入薄壁長(zhǎng)試管中，加入2mol/L的三氟乙酸(TFA)4mL，在110℃水解2h。將水解液在低于40℃減壓蒸干，然后加入3mL甲醇蒸干，重復(fù)上述操作4～5次，以完全除去TFA，然后按照1.6.1節(jié)的方法進(jìn)行還原、乙?；?，用氯仿定容至5mL，待GC分析。

1.6.3 色譜條件

Agilent 7890A氣相色譜：氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)，高純氮?dú)庾鳛檩d氣；毛細(xì)管柱：Agilent 19091J-413(30m×320μm，0.25μm)。

色譜條件：初始柱溫為120℃，以15℃/min升溫至240℃，恒溫6min，進(jìn)樣量2μL，進(jìn)樣口溫度為250℃，分流比1:50，檢測(cè)器溫度為250℃，氫氣流速35mL/min，空氣流速350mL/min，尾吹氣流速30mL/min，柱內(nèi)流速為1mL/min。

1.6.4 GC分析及定量分析

所有單糖標(biāo)樣均按照1.6.1節(jié)方法處理后用GC測(cè)定，確定每個(gè)單糖的保留時(shí)間。混標(biāo)以同樣的方法處理后GC測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，根據(jù)各組分峰面積值計(jì)算混標(biāo)氣相色譜圖的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD1)；做6組混標(biāo)樣品后GC測(cè)定，并計(jì)算出其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD2)。

根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間確定單糖種類。計(jì)算各糖組分的峰面積，采用面積歸一化方法，計(jì)算單糖面積平均百分含量，并計(jì)算各單糖響應(yīng)因子，再根據(jù)等物質(zhì)的量比的標(biāo)樣組分，計(jì)算樣品各單糖物質(zhì)的量比。

2 結(jié)果與分析

2.1 FVP60-C2的提取純化

金針菇子實(shí)體經(jīng)熱水浸提，乙醇沉淀后得FVP60。FVP60經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱層析的結(jié)果見圖1，收集FVP60-C。FVP60-C經(jīng)Sephacryl S100 High-Resolution凝膠柱(圖2)脫鹽，再經(jīng)Sephacryl S400 High-Resolution凝膠柱(圖3)進(jìn)一步純化后得均一組分FVP60-C2。

圖1 FVP60 DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution curve of FVP60 by DEAE-Sepharose Fast Flow column chromatography

圖2 FVP60-C Sephacryl S100 層析洗脫曲線Fig.2 Elution curve of FVP60-C by Sephacryl S100 column chromatography

圖3 FVP60-C 脫鹽后Sephacryl S400 洗脫曲線Fig.3 Elution curve of FVP60-C without salt by Sephacryl S400 column chromatography

2.2 FVP60-C2的純度及平均分子質(zhì)量

圖4 FVP60-C2 HPLC 曲線Fig.4 HPLC of FVP60-C2

FVP60-C2經(jīng)HPLC檢測(cè)為單一對(duì)稱峰，如圖4所示，說明FVP60-C2為均一多糖，根據(jù)保留時(shí)間計(jì)算出其平均分子質(zhì)量為1.429×104D。

2.3 FVP60-C2的理化特征分析結(jié)果

2.3.1 紫外-可見光譜全掃描檢測(cè)結(jié)果

FVP60-C2的紫外-可見光譜全掃描結(jié)果(圖5)顯示在206nm波長(zhǎng)處有多糖吸收峰，在280、260、620nm波長(zhǎng)處未觀察到蛋白質(zhì)(280nm)、核酸(260nm)及色素(620nm)等雜質(zhì)峰。

圖5 FVP60-C2 紫外-可見光全掃描光譜圖Fig.5 UV scanning curve of FVP60-C2

2.3.2 紅外光譜分析

圖6 FVP60-C2紅外光譜圖Fig.6 FT-IR spectrum of FVP60-C2

由圖6可知，3410cm-1寬而強(qiáng)的吸收峰為糖分子內(nèi)及分子外—OH基團(tuán)伸縮振動(dòng)峰；2930cm-1處為—CH2基團(tuán)反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰；在1660cm-1左右的峰是多糖水合振動(dòng)峰；1360cm-1附近為飽和C—H彎曲振動(dòng)吸收峰；1077cm-1較強(qiáng)的吸收峰為C=O伸縮振動(dòng)特征峰，包括吡喃糖環(huán)的C—O—C伸縮振動(dòng)和吡喃環(huán)中與羥基連接的C—O伸縮振動(dòng)；1100cm-1和1010cm-1之間的3個(gè)吸收峰為吡喃糖環(huán)羥基的彎曲振動(dòng)吸收峰；1730cm-1及1259cm-1附近無(wú)特征吸收峰，說明不含糖醛酸；831cm-1處有一吸收峰，提示FVP60-C2可能主要以α-糖苷鍵連接[18-20]。

2.4 FVP60-C2的單糖組成分析

混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的GC圖及其分析結(jié)果分別見表1和圖7。RSD1和RSD2均小于5%，表明本研究所采用的乙?；椒梢詽M足實(shí)驗(yàn)要求，具有可操作性。根據(jù)平行處理6種混標(biāo)的平均面積百分含量，計(jì)算出各個(gè)單糖組分相對(duì)于儀器的響應(yīng)因子。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜結(jié)果及分析Table1 GC results and analysis of mixed standards

圖7 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖Fig.7 Gas chromatogram of mixed monosaccharide standards

FVP60-C2的GC結(jié)果見圖8。將圖8與圖7相對(duì)照，根據(jù)保留時(shí)間推斷出，F(xiàn)VP60-C2是由巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成的雜多糖。采用面積歸一化方法，根據(jù)平均百分含量和響應(yīng)因子得出其物質(zhì)的量比為0.74:0.21:1.36:1.00:1.31。

圖8 FVP60-C2氣相色譜圖Fig.8 Gas chromatogram of FVP60-C2

3 討 論

本研究對(duì)金針菇子實(shí)體多糖進(jìn)行分離純化得到均一組分FVP60-C2，經(jīng)高效液相檢測(cè)為較單一的組分，表明所采用的純化方法具有較好的效果。確定多糖中單糖的組成是研究多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的重要前提。根據(jù)金針菇多糖FVP60-C2水解成單糖后經(jīng)乙?；蟮腉C分析結(jié)果及面積歸一化法確定了各單糖的含量，但不能確定其糖苷鍵連接方式及構(gòu)型的結(jié)構(gòu)特征，詳細(xì)結(jié)構(gòu)仍需做進(jìn)一步的研究。

[1] 畢志樹, 鄭國(guó)揚(yáng), 李泰輝. 廣東大型真菌志[M]. 廣州: 廣東科技出版社, 1994.

[2] 蔡和暉, 廖森泰, 葉運(yùn)壽, 等. 金針菇的化學(xué)成分、生物活性及加工研究進(jìn)展[J]. 食品研究與開發(fā), 2008, 29(11): 171-175.

[3] 于榮利, 秦旭升, 宋鳳菊. 金針菇研究概況[J]. 食用菌學(xué)報(bào), 2004, 11(4): 63-68.

[4] 嚴(yán)茂祥, 陳芝蕓, 項(xiàng)柏康, 等. 金針菇多糖對(duì)小鼠移植性腫瘤抗瘤效應(yīng)研究[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥科技, 1999, 6(6): 379-380.

[5] LEUNG M Y K, FUNG K P. The isolation and characterization of an immunomodulatory and anti-tumor polysaccharide preparation from Flammulina velutipes[J]. Immunopharmacology, 1997, 35: 255-263.

[6] 王玉峰, 王旻, 尹鴻萍. 金針菇中菌絲體多糖的分離、結(jié)構(gòu)鑒定及免疫學(xué)活性[J]. 中國(guó)天然藥物, 2008, 7(6): 312-315.

[7] 張健, 姚文兵, 謝晨, 等. 富鍺金針菇多糖肝保護(hù)有效成分的研究[J].中國(guó)生化藥物雜志, 2007, 28(6): 366-368.

[8] HUYNH N D, BAO H, OCHIAI Y, et al. Antioxidative activities of hydrophilic extracts prepared from the fruiting body and spent culture medium of Flammulina velutipes[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(15): 6248-6255.

[9] 孔曉雪, 安辛欣, 趙立艷, 等. 金針菇水溶性多糖物理提取工藝及優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(24): 230-235.

[10] PANG Xiubing, YAO Wenbing, YANG Xiaobing, et al. Purification, characterization and biological activity on hepatocytes of a polysaccharide from Flammulina velutipes mycelium[J]. Carbohydrate Polymers, 2007, 70(3): 291-297.

[11] 楊念, 芮漢明. 響應(yīng)面法優(yōu)化金針菇抗氧化物質(zhì)的超聲波輔助提取工藝[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(4): 126-130.

[12] 鄒宇曉, 廖森泰, 吳娛明, 等. 金針菇多糖提取物對(duì)記憶障礙模型大鼠、小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2010, 10(1): 28-33.

[13] 劉冬, 姚文兵, 張健, 等. 富鍺金針菇多糖對(duì)小鼠肝臟的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 37(6): 565-568.

[14] 魏遠(yuǎn)安, 方積年. 高效凝膠滲透色譜法測(cè)定多糖純度及分子量[J].藥學(xué)學(xué)報(bào), 1989, 24(7): 532-536.

[15] 謝晶曦, ?？?biāo), 王緒明, 等. 紅外光譜在有機(jī)化學(xué)和藥物化學(xué)中的應(yīng)用[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2001.

[16] 張惟杰. 糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M]. 2版. 杭州: 浙江大學(xué)出版社, 1999.

[17] 徐桂云, 陳汝賢, 常理文. 用毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定多糖中單糖的組成[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2000, 19(3): 71-73.

[18] SEKKAL M, HUVENNE J P, LEGRAND P, et a1. Direct structural identification of polysaccharides from red algae by FTIR microspectrometry I: localization of agar in Gracilatia verrucosa sections[J]. Mikrochim Acta, 1993, 112(1): 1-10.

[19] 孫培龍, 魏紅福, 楊開, 等. 姬松茸多糖的分離純化與理化性質(zhì)研究[J]. 中草藥, 2006, 37(2): 190-192.

[20] 孫元琳, 崔武衛(wèi), 顧小紅, 等. 傅里葉變換紅外光譜法測(cè)定當(dāng)歸果膠多糖的酯化度[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2009, 19(3): 682-685.

Preparation and Monosaccharide Composition Analysis of Homogeneous Polysaccharide FVP60-C2 from Fruit Bodies of Flammulina velutipes

YANG Jun-hong，ZHANG An-qiang，SUN Pei-long*
(School of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Hot water extraction and ethanol precipitation were used to extract polysaccharide from fruit bodies of Flammulina velutipes. Crude polysaccharide extract was purified to obtain FVP60-C2 by ion exchange chromatography and gel filtration chromatography. The physicochemical properties of FVP60-C2 were investigated by HPLC, UV and IR. Following the hydrolysis and acetylation of FVP60-C2, the monosaccharide compositions of FVP60-C2 were analyzed by GC. The results showed that FVP60-C2 was a homogeneous polysaccharide with molecular weight of 1.429 × 104D, which was composed of fucose, xylose, mannose, glucose and galactose with a molar ratio of 0.74:0.21:1.36:1.00:1.31.

Flammulina velutipes；polysaccharide；physico-chemical property；gas chromatography；monosaccharide composition

TQ929.2

A

1002-6630(2013)03-0086-04

2011-12-12

浙江省食用菌創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2009R50029)

楊俊紅(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)的分離提取。E-mail：luoyuheluoxue@126.com

*通信作者：孫培龍(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)的分離提取。E-mail：sun_pl@zjut.edu.cn