單癸月桂酸甘油酯的抑菌作用及機理研究

曾哲靈，趙存洋，羅春燕，周 星

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330031；3.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330031)

單癸月桂酸甘油酯的抑菌作用及機理研究

曾哲靈1,2，趙存洋1,3，羅春燕1,3，周 星1,3

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330031；3.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330031)

對不同質(zhì)量濃度的單癸月桂酸甘油酯的抑菌活性及其抑菌機理進(jìn)行研究。采用濾紙片法對單癸月桂酸甘油酯進(jìn)行細(xì)菌敏感性測試；二倍試管稀釋法測定最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)；光電比濁法測定抑菌效果；二乙酸熒光素(FDA)染色實驗研究其對細(xì)菌膜通透性的影響；分光光度法測定細(xì)菌胞內(nèi)蛋白含量、細(xì)菌細(xì)胞壁脂多糖(LPS)含量、細(xì)菌菌懸液離心后上清液中核酸物質(zhì)含量；原子吸收光譜法測定細(xì)菌菌懸液離心后上清液中胞內(nèi)內(nèi)容物K+、Ca2+、Mg2+含量；掃描電鏡觀測細(xì)菌表面形態(tài)變化。結(jié)果表明：單癸月桂酸甘油酯對革蘭氏陽性菌及陰性菌均有較好的抑制效果，對金黃色葡萄球菌(G＋)、枯草芽孢桿菌(G+)的抑制作用主要是破壞其細(xì)胞膜及細(xì)胞壁，對大腸桿菌(G―)的抑制作用主要是引起細(xì)胞壁外膜LPS外泄。

單癸月桂酸甘油酯；抑菌作用；抑菌機理

單脂肪酸甘油酯，也稱脂肪酸單甘油酯，簡稱單甘油酯。單甘油酯作為食品乳化劑廣泛應(yīng)用于各種食品中[1-2]，其使用量約占食品乳化劑的46%[3]，包括單長碳鏈脂肪酸甘油酯、單中碳鏈脂肪酸甘油酯。單中碳鏈脂肪酸甘油酯不僅乳化性優(yōu)于單長碳鏈脂肪酸甘油酯，還具有水中分散性好、抗菌譜廣、抑菌效果好的特點，已被美國食品與藥物管理局批準(zhǔn)為“一般公認(rèn)安全化合物”用于食品，德國、日本等國也廣泛將其用作食品、藥品及化妝品乳化劑和抗菌劑。單中碳鏈脂肪酸甘油酯包括單辛酸甘油酯、單癸酸甘油酯、單月桂酸甘油酯及其混合物。

近年來，國內(nèi)外有關(guān)脂肪酸和單脂肪酸甘油酯的抑菌性能研究已有文獻(xiàn)報道。1977年Kabara[4]、2003年Ruzicka[5]、2010年Bunkova[6]等研究發(fā)現(xiàn)，40多種天然脂肪酸及其單甘油酯中，月桂酸和單月桂酸甘油酯的抗菌性能較好。2012年，楊曉韜等[7]研究發(fā)現(xiàn)了單辛酯酸甘油酯對肉制品污染菌有良好的抑制效果。研究發(fā)現(xiàn)單甘酯、雙甘酯可抑制金黃色葡萄球菌的正常繁殖[8]。Bryon[9]、Zhang Hui[10]等研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸單甘油酯對于食品腐敗菌、幽門螺旋桿菌有良好的抑制效果。有關(guān)脂肪酸抑菌機理的研究也有文獻(xiàn)報道，2010年，Desbois等[11]研究闡述了脂肪酸的抑菌機理，發(fā)現(xiàn)脂肪酸的主要抑菌作用位點位于細(xì)菌的細(xì)胞膜，通過破壞細(xì)胞膜上的電子傳遞系統(tǒng)和氧化磷酸化達(dá)到抑菌效果。有關(guān)單中碳鏈脂肪酸甘油酯的抑菌機理研究，至今未見文獻(xiàn)報道，抑菌機理尚不清楚。

本實驗采用二乙酸熒光素(FDA)染色法測定細(xì)胞膜通透性，掃描電鏡觀測細(xì)胞表面形態(tài)變化，分光光度法測定細(xì)菌胞內(nèi)蛋白含量、細(xì)菌細(xì)胞壁脂多糖(LPS)含量、細(xì)菌菌懸液離心后上清液中胞外核酸物質(zhì)含量，原子吸收光譜法測定細(xì)菌菌懸液離心后上清液中細(xì)菌胞內(nèi)內(nèi)容物K+、Ca2+、Mg2+含量，研究以樟樹籽仁油為原料制備的單癸月桂酸甘油酯的抑菌作用及機理，為單中碳鏈脂肪酸甘油酯及其類似化合物抑菌作用和機理的進(jìn)一步研究及應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

大腸桿菌Escherichia coil ACCC 0169、金黃色葡萄球菌Staphylococus aureus ACCC 01170、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ACCC 01336、蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus ACCC 0563、鼠傷寒沙門氏桿菌Salmonella typhimurium ACCC 530013、單增李斯特氏菌Listeria monocytogenes ACCC 0356 中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 原料與試劑

單癸月桂酸甘油酯(單癸月桂酸甘油酯總含量為94.03%，其中單癸酸甘油酯含量為54.00%、單月桂酸甘油酯含量為40.03%)由南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室以樟樹籽仁油為原料制備；配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基所需試劑和大豆卵磷脂均為食品級；二乙酸熒光素(FDA) 美國Sigma公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

765pc型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；F-4500型熒光分光光度計 日本Hitachi技術(shù)有限公司；AA800型原子吸收光譜儀 美國Perkin Elmer公司；8500場發(fā)射掃描電子顯微鏡 美國Aglient公司。

1.2 方法

1.2.1 單癸月桂酸的含量測定

參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。

1.2.2 敏感性測試

取配成108CFU/mL的供試菌菌懸液各0.1mL涂布于牛肉膏蛋白胨固體平板上。將直徑為6mm的無菌濾紙片分別浸入0.9%的生理鹽水(對照組)和質(zhì)量濃度為5、10、15、20mg/mL單癸月桂酸甘油酯溶液中，取出，并在容器內(nèi)壁上濾去多余的溶液，然后將濾紙片貼入平板均分的4個小區(qū)內(nèi)。將貼好濾紙片的平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24h，取出測定抑菌圈直徑。

1.2.3 最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測定

采用瓊脂平板稀釋法[13]使牛肉膏蛋白胨瓊脂平板中單癸月桂酸甘油酯終質(zhì)量濃度為5、2.5、1.25、0.63、0.32、0.16、0.08、0.04mg/mL，以0.9%無菌生理鹽水牛肉膏蛋白胨瓊脂平板為實驗對照組。用生理鹽水將處于對數(shù)生長期的供試菌種稀釋為104CFU/mL的種子液，取0.1mL種子培養(yǎng)液涂布于藥敏平板表面，37℃培養(yǎng)24h,肉眼觀察，無細(xì)菌菌落形成的最低單癸月桂酸甘油酯稀釋質(zhì)量濃度即為MIC。

1.2.4 抑菌效果的測定

采用光電比濁法[14]測定單癸月桂酸甘油酯的抑菌效果。將一定量處于對數(shù)生長期的受試菌種接種至含有MIC的單癸月桂酸甘油酯的肉湯培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基A540nm凈增值為0.05左右。37℃、120r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以不含單癸月桂酸甘油酯組為陰性對照組，每隔5h測定A540nm的數(shù)值。時刻t時的抑菌率采用下式計算。

式中：A0,CK和At,CK分別作為對照的樣品在培養(yǎng)時間為0h和th的吸光度；A0,I和At,I分別為含單癸月桂酸甘油酯樣品在培養(yǎng)時間為0h和th的吸光度。

1.2.5 單癸月桂酸甘油酯對細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響

將處于對數(shù)生長期的受試菌種懸浮于生理鹽水中，使菌濃度為106CFU/mL。以加入MIC的單癸月桂酸甘油酯組為實驗組，以不加樣品組為對照組，在37℃、120r/min培養(yǎng)12h。分別取實驗組與對照組菌懸液6mL于離心管中，4000r/min離心5min，6mL PBS重懸液洗滌2次，離心棄上清液，加入2mg/mL FDA丙酮溶液250μL，常溫條件下孵育20min，PBS重懸液洗滌3次，離心棄上清液，加入6mL PBS，用熒光分光光度計測定熒光強度。FDA激發(fā)波長為297nm，發(fā)射波長為527nm。

1.2.6 單癸月桂酸甘油酯對細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物含量的影響

1.2.6.1 單癸月桂酸甘油酯對細(xì)菌蛋白含量的影響

分別取1.2.5節(jié)實驗組與對照組菌懸液各10mL于離心管中，4000r/min離心5min，棄上清液，收集菌體，10mL PBS重懸液洗滌2次，再離心棄上清液清除去胞外殘留蛋白，加入10mL蒸餾水，25kHz、600W超聲破碎細(xì)胞15min，得胞內(nèi)蛋白提取液。取2mL蛋白提取液于3mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液中，靜置染色15min，用紫外-可見分光光度計測定A595nm。

1.2.6.2 單癸月桂酸甘油酯對細(xì)菌胞外核酸含量的影響

分別取1.2.5節(jié)實驗組與對照組菌懸液各10mL于離心管中，4000r/min離心5min取上清液，用紫外-可見分光光度計測定A260nm。

1.2.6.3 單癸月桂酸甘油酯對細(xì)菌胞外K+、Ca2+、Mg2+含量的影響

分別取1.2.5節(jié)實驗組與對照組菌懸液10mL于離心管中，4000r/min離心5min取上清液，原子吸收光譜法測定上清液中K+、Ca2+、Mg2+含量。

1.2.7 單癸月桂酸甘油酯對大腸桿菌脂多糖(LPS)含量的影響

采用熱酚水提取法[15]提取1.2.5節(jié)實驗組與對照組大腸桿菌LPS。每1g細(xì)菌(4000r/min離心20min收集)加3mL蒸餾水進(jìn)行懸浮，菌懸液反復(fù)凍融3次后，與等量90%苯酚共同水浴至68℃后混合，劇烈攪拌30min，冰浴至2℃，3000r/min離心20min。酚相加等體積無菌蒸餾水洗滌2次，收集酚相于透析袋中，流水透析48h去酚，之后用蒸餾水透析48h以上，至FeCl3檢測無酚試劑反應(yīng)視為透析完成，用50%聚乙二醇20000濃縮至原體積的1/4，即得LPS粗品。1,9-二甲基亞甲藍(lán)(DMB)染色法[16]測定LPS含量，即取0.1mL LPS粗品溶于2.9mL DMB染液中，均勻混合，室溫條件下放置10min，用紫外-可見分光光度計測定A550nm。

1.2.8 掃描電鏡觀察

分別取1.2.5節(jié)實驗組與對照組菌懸液各2mL于離心管中，4000r/min離心5min收集菌體，用4%戊二醛溶液固定菌體細(xì)胞4h，PBS洗滌殘留戊二醛，50%、70%、90%、100%梯度體積分?jǐn)?shù)乙醇分別脫水處理菌體15min，將脫水后的菌體涂布于干凈的載玻片上，自然風(fēng)干，噴金于菌體表面，掃描電鏡觀察菌體表面形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單癸月桂酸甘油酯含量測定

單癸月桂酸甘油酯的含量為94.03%，其中單癸酸甘油酯含量為54.00%、單月桂酸甘油酯含量為40.03%。

2.2 敏感性測試

以常見食品致病菌與食品腐敗菌為指示菌，進(jìn)行抑菌敏感性測試。由表1可見，單癸月桂酸甘油酯對革蘭氏陽性菌及陰性菌均有抑制作用，其中金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及大腸桿菌對單癸月桂酸甘油酯高度敏感。

表1 常見食品致病菌及腐敗菌對單癸月桂酸甘油酯的敏感性Table1 Sensitivity of monolaurin and monocaprin against common food pathogenic bacteria and spoilage bacteria

2.3 單癸月桂酸甘油酯對高度敏感菌的MIC測定

表2 單癸月桂酸甘油酯對高度敏感菌的MIC測定結(jié)果Table2 MIC of monolaurin and monocaprin against highly sensitive bacteria

分別以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及大腸桿菌為指示菌，瓊脂平板稀釋法測定其MIC。由表2可見，單癸月桂酸甘油酯對金黃色葡萄球菌的MIC為0.32mg/mL，枯草芽孢桿菌的MIC為0.32mg/mL，大腸桿菌的MIC為5mg/mL。

2.4 單癸月桂酸甘油酯的抑菌效果

單癸月桂酸甘油酯抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic effect of monolaurin and monocaprin圖 1

微生物適應(yīng)性強，能通過自身代謝途徑將外來物分解而產(chǎn)生抗藥性。因此，藥物抗微生物代謝能力，抑制時效性是衡量抑菌效果的一個重要指標(biāo)。由圖1可見，單癸月桂酸甘油酯對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及大腸桿菌60h的后抑制率保持在90%以上。因此，單癸月桂酸甘油酯抗微生物代謝能力強，抑菌時效好。

表3 單癸月桂酸甘油酯對細(xì)菌內(nèi)容物泄露的影響Table3 Effect of monolaurin and monocaprin on leakage of substances in cells

2.5 單癸月桂酸甘油酯對細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響

圖2 單癸月桂酸甘油酯對金黃色葡萄球菌(A)、枯草芽孢桿菌(B)和大腸桿菌(C)FDA的熒光強度影響Fig.2 Effect of monolaurin and monocaprin on FDA fluorescence intensity of Staphylococcus aureus (A), Bacillus subtilis (B), and Escherichia coli (C)

FDA是一種不帶電荷的脂質(zhì)性分子，容易透過細(xì)胞膜，其本身不發(fā)熒光，但進(jìn)入細(xì)胞以后可被細(xì)胞內(nèi)非特異性酯酶水解，釋放出能發(fā)黃綠色熒光的熒光素分子。如果細(xì)胞膜完整，這些熒光素分子滯留在活細(xì)胞中，使細(xì)胞發(fā)出黃綠色熒光。如果細(xì)胞膜受損傷，熒光素分子將從細(xì)胞內(nèi)流失，細(xì)胞不再發(fā)黃綠色熒光。通過測定FDA熒光強度的變化可反映細(xì)胞膜完整性、通透性，F(xiàn)DA熒光強度低表明細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞膜完整性破壞，熒光從胞漿中外漏。由圖2A、B可見，經(jīng)單癸月桂酸甘油酯處理后的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌熒光強度明顯降低，說明其細(xì)胞膜受到破壞、通透性增加。由圖2C可見，經(jīng)單癸月桂酸甘油酯處理后的大腸桿菌熒光強度幾乎沒有改變，表明其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整、通透性沒有變化，單癸月桂酸甘油酯對大腸桿菌的作用位點可能不在細(xì)胞膜上。

2.6 單癸月桂酸甘油酯對細(xì)菌內(nèi)容物泄露的影響

用分光光度法分別測定單癸月桂酸甘油酯對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌胞內(nèi)蛋白、核酸物質(zhì)及金屬離子泄露的影響。由表3可見，經(jīng)處理后的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌胞內(nèi)蛋白含量明顯降低，上清液中核酸物質(zhì)、Ca2+、Mg2+、K+含量明顯增加，表明其胞內(nèi)蛋白、核酸物質(zhì)、金屬離子已通過細(xì)胞膜泄露至胞外；經(jīng)處理后的大腸桿菌的胞內(nèi)蛋白、上清液中核酸物質(zhì)均無明顯變化，上清液中Ca2+、Mg2+、K+含量明顯增加，表明其并未引起大腸桿菌胞內(nèi)蛋白、核酸物質(zhì)大分子的泄露。

2.7 單癸月桂酸甘油酯對大腸桿菌LPS含量的影響

LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要組成成分，是其外膜的特有結(jié)構(gòu)。外膜中的LPS對控制細(xì)胞通透性、提高M(jìn)g2+等陽離子濃度、維持細(xì)胞正常功能與代謝起到至關(guān)重要的作用[17-18]。分光光度法比較了處理前后大腸桿菌LPS含量。結(jié)果顯示，處理組A550nm為0.126，對照組A550nm為0.394，處理組A550nm比對照組減少了0.268。

2.8 掃描電鏡觀察結(jié)果

圖3中對照組金黃色葡萄球菌邊緣整齊、形狀規(guī)則，圖3D中的實驗組金黃色葡萄球菌邊緣模糊并發(fā)生了形變。圖3B中對照組枯草芽孢桿菌邊緣光滑、菌體飽滿，圖3E中實驗組菌體已經(jīng)明顯干癟了，將要融化破碎。圖3C、F中的對照組與實驗組大腸桿菌表面未發(fā)現(xiàn)有明顯變化。

圖3 掃描電鏡觀察細(xì)菌表面結(jié)果Fig.3 Results of SEM images

3 討 論

從抑菌活性看，單癸月桂酸甘油酯對革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌均有高效的抑制作用，但對革蘭氏陽性菌的抑制作用要優(yōu)于革蘭氏陰性菌，這可能是因為細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)存在差異，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁有一層外膜，這層外膜能與一些外來物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合，從而對菌體起到一定的保護作用。

一般認(rèn)為，食品防腐劑對微生物的抑制作用是通過影響細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)而實現(xiàn)的，這些亞結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、與代謝有關(guān)的酶、蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)及遺傳物質(zhì)。由于每個亞結(jié)構(gòu)對菌體而言都是必需的，因此食品防腐劑只要作用于其中的一個亞結(jié)構(gòu)便能達(dá)到殺菌或抑菌的目的[19]。

根據(jù)經(jīng)單癸月桂酸甘油酯處理后的金黃色葡萄球菌(G+)、枯草芽孢桿菌(G+)菌體熒光強度降低，胞內(nèi)蛋白含量減少，上清液中核酸物質(zhì)、Ca2+、Mg2+、K+含量增加，掃描電鏡觀察菌體有明顯變形或破碎的現(xiàn)象，推測單癸月桂酸甘油酯對G+菌的抑制作用主要是破壞菌體的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜。根據(jù)經(jīng)單癸月桂酸甘油酯處理后的大腸桿菌(G―)菌體熒光強度幾乎不變，胞內(nèi)蛋白含量、上清液中核酸物質(zhì)含量變化不明顯，上清液中Ca2+、Mg2+、K+含量增加，LPS含量減少，掃描電鏡觀察菌體無明顯表面形態(tài)變化，推測單癸月桂酸甘油酯對G—菌的抑制作用主要是引起細(xì)胞壁外膜LPS外泄。

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Antibacterial Function and Mechanism of Monolaurin and Monocaprin

ZENG Zhe-ling1,2，ZHAO Cun-yang1,3，LUO Chun-yan1,3，ZHOU Xing1,3
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. School of Environmental and Chemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China；3. School of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China)

The objective of this study is to explore the antimicrobial activity and mechanism of monoglycerides containing monolaurin and monocaprin. Paper disc method was used to evaluate bacterial susceptibility of monolaurin and monocaprin. Two-fold dilution method was used to test minimum inhibitory concentration (MIC), and photoelectricity turbidimetry method was used to determine antibacterial efficacy. Orescein diacetate (FDA) was used as fluorescent indicator to reflect the membrane permeability of tested bacteria after treatment with monolaurin and monocaprin. Spectropbotometric method was used to test the leakage of internal substances of tested bacteria, such as protein, nucleic acid, lipopolysaccharide, K+, Ca2+and Mg2+. The change of cell surface was characterized using scanning electron microscope. Results showed that gram-positive and gram-positive bacteria were susceptive to monolaurin and monocaprin. The activities of monolaurin and monocaprin against Bacillus subtilis (G+) and Staphylococus aureus (G+) resulted from the destruction of cell wall and membrane caused by monolaurin and monocaprin. On the contrary, its antibacterial activity against Escherichia coil (G—) resulted from the leakage of lipopolysaccharide in cell walls.

monolaurin and monocaprin；antibacterial activity；antibacterial mechanism

TS202.3

A

1002-6630(2013)03-0070-05

2011-11-11

江西省國際科技合作項目(2010EHB02500)；國家中小企業(yè)創(chuàng)新基金項目(11C26213604985)；國家國際科技合作專項(2011DFA32770)；江西省自然科學(xué)基金項目(20114BAB204018)

曾哲靈(1965—)，男，教授，博士，研究方向為食物(含生物質(zhì))資源的開發(fā)與利用。E-mail：zlzengjx@163.com