應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EphA2及其調(diào)節(jié)基因HoxA1、C-m yc在喉癌組織中的表達(dá)及相互關(guān)系

石棟梁，杜 濤，習(xí)國(guó)平*

（1.河北省邯鄲市第三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，河北邯鄲056001；2.河北省邯鄲市第二醫(yī)院內(nèi)窺鏡室，河北邯鄲056001）

·論 著·

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EphA2及其調(diào)節(jié)基因HoxA1、C-m yc在喉癌組織中的表達(dá)及相互關(guān)系

石棟梁1，杜 濤2，習(xí)國(guó)平1*

（1.河北省邯鄲市第三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，河北邯鄲056001；2.河北省邯鄲市第二醫(yī)院內(nèi)窺鏡室，河北邯鄲056001）

目的從蛋白水平探討HoxA1、C-myc、EphA2與喉癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，從分子生物學(xué)角度探討喉癌的發(fā)病機(jī)制。方法①喉癌組織40例及癌旁組織40例，取15例非喉癌患者的喉部正常黏膜組織做對(duì)照。所有腫瘤組織均經(jīng)病理學(xué)確診為鱗狀細(xì)胞癌，癌旁組織及喉部正常黏膜均經(jīng)病理證實(shí)為炎癥或正常黏膜。②應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)喉癌組織、癌旁組織及喉部正常黏膜組織的EphA2和HoxA1、C-myc蛋白表達(dá)的含量。結(jié)果EphA2蛋白、HoxA1蛋白、C-myc蛋白在喉癌組織中的表達(dá)量分別高于癌旁組織和正常喉黏膜組織，而癌旁組織與正常黏膜組織間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。喉癌組織中EphA2蛋白與HoxA1蛋白、C-myc蛋白有多元線性回歸關(guān)系，EphA2蛋白與HoxA1蛋白呈正相關(guān)，與C-myc蛋白呈負(fù)相關(guān)，Y=0.983+0.739X1-0.323X2（P=0.000）。結(jié)論EphA2蛋白、HoxA1蛋白和C-myc蛋白在喉癌中的表達(dá)與喉癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

喉腫瘤；受體，EphA2；流式細(xì)胞術(shù)

喉癌的發(fā)生、發(fā)展與多種癌調(diào)節(jié)基因及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變有關(guān)，其中促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體（Eph受體）與癌細(xì)胞增殖、發(fā)展有關(guān)；Hox基因作為細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)基因，不僅調(diào)控胚胎細(xì)胞的增殖和分化，而且也是成人組織細(xì)胞增殖和分化的重要調(diào)節(jié)基因。若Hox基因發(fā)生異常表達(dá)，就會(huì)導(dǎo)致個(gè)體發(fā)育和組織器官形成過程中出現(xiàn)異常的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并可致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化形成腫瘤。C-myc基因?qū)儆诤说鞍最愓{(diào)控基因，其在細(xì)胞周期變化，細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，基因的不穩(wěn)定性，刺激血管生成，細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、分化及凋亡中起重要的調(diào)節(jié)作用。EphA2的表達(dá)受到許多基因的調(diào)控，本研究從分子水平探討HoxA1、C-myc與EphA2在喉癌細(xì)胞中的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 材料：選擇40例喉癌組織及40例相應(yīng)癌旁組織，同時(shí)選擇15例非喉癌患者的喉部正常黏膜組織做對(duì)照。所有腫瘤組織均經(jīng)病理學(xué)確診為鱗狀細(xì)胞癌，癌旁組織及喉部正常黏膜均經(jīng)病理證實(shí)為炎癥或正常黏膜。喉癌病例中男性37例，女性3例；年齡40～72歲，中位年齡56歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例（有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移根據(jù)術(shù)后病理而定）；臨床分期采用國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)2001年公布的TNM分類分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ、Ⅱ期16例，Ⅲ、Ⅳ期24例，其中 T1N0M06例，T2N0M010例，T2N1M02例，T2N2M01例，T3N0M09例，T3N1M02例，T3N2M06例，T4N0M03例，T4N2M01例。所有標(biāo)本取材后立即用液氮冷藏保存。

1.2 方法：應(yīng)用美國(guó)Beckerman Coulter公司生產(chǎn)的Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀，激發(fā)光源為15mW氬 LogX-Mode×340，陽性結(jié)果的判定，如果FI＞1.0為陽性表達(dá)，F(xiàn)I≤1.0為陰性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，分別采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)；EphA2、Hoxa1和C-myc之間的關(guān)系采用多元線性回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

EphA2蛋白與HoxA1蛋白、C-myc蛋白在喉癌組織中的表達(dá)量均高于正常組織及癌旁組織，而正常組織與癌旁組織間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

EphA2蛋白與HoxA1蛋白、C-myc蛋白有多元線性回歸關(guān)系，EphA2蛋白與HoxA1蛋白呈正相關(guān)（EphA2蛋白表達(dá)隨著HoxA1蛋白表達(dá)的增加而增加），與C-myc蛋白呈負(fù)相關(guān)（EphA2蛋白表達(dá)隨著C-myc蛋白表達(dá)的減低而增加），多元線性回歸方程為Y=0.983+0.739X1-0.323X2（P=0.000）。離子激光器，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，應(yīng)用Expo32ADC進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，用Muticycle AN分析軟件對(duì)DNA細(xì)胞周期擬合分析。檢測(cè)前以flow-checkTMFlourpheres（10μm）熒光微球（REF 6605359.Beckman Coulter，Inc.Fullerton，CA92835）作為標(biāo)準(zhǔn)樣品調(diào)整儀器CV值在2%以下。按照Morkve等提出的熒光指數(shù)（fouling index，F(xiàn)I）表示Erythropoietinproducing hepatocellular receptor A2（EphA2），Hox genes a1（HoxA1）和cell-myc（C-myc）蛋白表達(dá)的相

表1 EphA2、HoxA1和C-myc在癌組織及癌旁、正常組織中的表達(dá)Table 1 The quantitative expression of EphA2，HoxA1 and C-myc in laryngeal carcinomas，para-carcinoma tissues and normalmucosa tissues（FI，xˉ±s）

3 討 論

Eph受體是酪氨酸蛋白激酶受體家族中最大的分支，有對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用。EphA2的過度表達(dá)具有轉(zhuǎn)化正常細(xì)胞的能力，當(dāng)Eph-ephrin系統(tǒng)正常表達(dá)時(shí)可抑制細(xì)胞增生，異常表達(dá)時(shí)又可以促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。Fujii等［1］將重組ephrinA1綁定到石川細(xì)胞的表面，而致EphA2及A4磷酸化。Hox基因不僅調(diào)控胚胎細(xì)胞的增殖和分化，而且也是成人組織細(xì)胞增殖和分化的重要調(diào)節(jié)基因。若Hox基因發(fā)生異常表達(dá)，就會(huì)導(dǎo)致個(gè)體發(fā)育和組織器官形成過程中出現(xiàn)異常的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并可致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化形成腫瘤。C-myc原癌基因激活的主要方式是該基因的擴(kuò)增和過表達(dá)，證明其在細(xì)胞周期變化，細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，基因的不穩(wěn)定性，刺激血管生成，細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、分化及凋亡中起重要的調(diào)節(jié)作用。腫瘤細(xì)胞為了生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移必須獲得血液供應(yīng)，通常認(rèn)為通過血管發(fā)生來達(dá)到上述目的。

細(xì)胞遷移是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附與解離是其必要的步驟。多種Eph受體及配體在腫瘤中尤其是腫瘤生長(zhǎng)的高侵襲性階段有正調(diào)節(jié)作用。EphA2的過度表達(dá)不僅能導(dǎo)致正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，而且能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞向外侵襲的能力，這是通過削弱腫瘤細(xì)胞之間的連接，增加腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分的黏附和增強(qiáng)在基質(zhì)的侵襲等幾方面而實(shí)現(xiàn)的。

Karidis等［2］研究發(fā)現(xiàn)EphA2與甲狀腺腫瘤生成有關(guān)。EphA2的表達(dá)增高與疾病分期及預(yù)后都有一定關(guān)系，因此，EphA2可以在臨床分析中作為一個(gè)獨(dú)立的診斷指標(biāo)。Fujii等［3］采用印跡分析證實(shí)人類子宮內(nèi)膜 EphA2蛋白的存在。Brantley-Sieders等［4］研究表明EphA2在腫瘤新血管形成及侵襲轉(zhuǎn)移中起到了很重要的作用。Cheng等［5］研究表明，阻斷EphA受體酪氨酸激酶可以抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的血管生成。Fox等［6］對(duì)3種乳腺上皮細(xì)胞（MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231）的研究結(jié)果表明，EphA2在侵襲性乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于在其他2種細(xì)胞中的表達(dá)。Giaginis等［7］發(fā)現(xiàn)EphA2在胰腺癌中的表達(dá)與患者的年齡顯著相關(guān)。

HoxA1可控制細(xì)胞周期，通過結(jié)合蛋白磷酸酶2A和蛋白磷酸酶1的催化亞基發(fā)揮作用。這種結(jié)合啟動(dòng)G2停止期的非洲蟾蜍卵母細(xì)胞以及G2停止期、DNA受損的Jurket細(xì)胞進(jìn)入M期。Kang等［8］研究表明HoxA1在胃癌細(xì)胞中較癌旁正常黏膜上皮明顯高表達(dá)，成為胃癌DNA甲基化標(biāo)記物之一。Tsou等［9］研究表明HoxA1在肺腺癌細(xì)胞中的超甲基化水平遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞（P＜0.01）。但HoxA1在喉癌中的表達(dá)未見報(bào)道。

Krecicki等［10］認(rèn)為，C-myc基因擴(kuò)增量與C-myc蛋白表達(dá)量無關(guān)，C-myc蛋白表達(dá)在淋巴結(jié)陰性組中高于淋巴結(jié)陽性組可能是由于隨著腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展其 mRNA變得更加不穩(wěn)定所致。而 Zelinski等［11］的研究顯示，C-myc對(duì)EphA2的下調(diào)在乳腺上皮細(xì)胞中有效，而在癌細(xì)胞中EphA2對(duì)C-myc卻不敏感。C-myc和EphA2在喉癌中究竟有無因果關(guān)系以及其機(jī)制是什么，有待于進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示EphA2和HoxA1、C-myc在喉癌組織中的表達(dá)陽性，其可能參與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化過程，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和分化。提示將來通過調(diào)節(jié)這些蛋白的表達(dá)可能在喉癌的臨床治療中有一定應(yīng)用價(jià)值。盡管關(guān)于喉癌的此類研究較少，但是我們也可以推測(cè)EphA2和HoxA1、C-myc蛋白的表達(dá)變化與喉癌的發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其在喉癌組織中的陽性表達(dá)可能預(yù)示癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，EphA2和HoxA1、C-myc蛋白的表達(dá)可能對(duì)判斷喉癌的惡性程度、病情進(jìn)展有重要價(jià)值。

總之，喉癌細(xì)胞中EphA2和HoxA1、C-myc共同促進(jìn)了喉癌的發(fā)生發(fā)展，為喉癌的診斷和治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。因此，深入研究EphA2和Hoxa1、C-myc的生物學(xué)作用及其作用機(jī)制，進(jìn)而選擇最佳靶位，可能為封閉、阻斷喉癌的發(fā)生發(fā)展提供更有力的依據(jù)。

［1］FUJIIH，F(xiàn)UJIWARA H，HORIE A，et al.EphrinA1 stimulates cell attachment and inhibits cell aggregation through the EphA receptor pathway in human endometrial carcinoma-derived Ishikawa cells［J］.Human Reproduction，2011，26（5）：1163-1170.

［2］KARIDISNP，GIAGINISC，TSOUROUFLISG，etal.Eph-A2 and Eph-A4 expression in human benign and malignant thyroid lesions：an immunohistochemical study［J］.Medical Science Monitor，2011，17（9）：BR257-265.

［3］FUJII H，F(xiàn)UJIWARA H，HORIE A.Ephrin A1 induces intercellular dissociation in Ishikawa cells：possible implication of the Eph-ephrin A system in human embryo implantation［J］.Human Reproduction，2011，26（2）：299-306.

［4］BRANTLEY-SIEDERS DM，F(xiàn)ANG WB，HICKS DJ，et al.Impaired tumor microenvironment in EphA2-deficient mice inhibits tumor angiogenesis and metastatic progression［J］.FASEB Journal，2005，19（13）：1884-1886.

［5］CHENG N，BRANTLEY DM，LIU H，et al.Blockade of EphA receptor tyrosine kinase activation inhibits vascular endothelial

cell growth factor-induced angiogenesis［J］.Mol Cancer Res，2002，1（1）：2-11.

［6］FOX BP，KAND PAL，RP.Invasivensess of breast carcinoma cells and transcript profile：Ephreceptors and ephrin ligands as molecular markers of potential diagnostu and prognostic application［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，318（4）：882-892.

［7］GIAGINISC，TSOUROUFLISG，ZIZI-SERBETZOGLO U，et al.A clinical significance of ephrin（eph）-A1，-A2，-A4，-A5 and-A7 receptors in pancreatic ductal adenocarcinoma［J］.Pathol Oncol Res，2010，16（2）：267-276.

［8］KANG GH，LEE S，CHO NY，et al.DNA methylation profiles of gastric carcinoma characterized by quantitative DNA methylation analysis［J］.Lab Invest，2008，88（2）：161-170.

［9］TSOU JA，GALLER JS，SIEGMUND KD，et al.Identification of a panel of sensitive and specific DNA methylation markers for lung adenocarcinoma［J］.Mol Cancer，2007，29（6）60-70.

［10］KRECICKIT，MARCIN F，MICHAL T，etal.Expression of C-myc oncoprotein in laryngeal squamous cell carcinoma［J］.Acta Otolarygol，2004，124（5）：634-637.

［11］ZELINSKI DP，ZANTEK ND，WALKER-DANIELS J，et al.Estrogen and Myc negatively regulate expression of the EphA，typrosine kinase［J］.JCell Biochem，2002，185（4）：714-720.

（本文編輯：劉斯靜）

THE EXPRESSION AND RELATIONSOF EPHA2，HoxA1 AND C-myc IN LARYNGEAL CARCINOMA W ITH FLOW CYTOMETERE

SHIDongliang1，DU Tao2，XIGuoping1*
（1.Department of Otolaryngology，the Third Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056001，China；2.Endoscopy Room，the Second Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056001，China）

Objective To explore the genesismechanism of laryngeal carcinoma at the level of molecular biology.M ethods ①Forty laryngeal carcinoma fresh sampleswere analyzed andmeanwhile 40 para-carcinoma tissues and 15 normal laryngealmucosa samples were also studied as controls.All tumor tissueswere confirmed to be squamous-cell carcinoma；the para-carcinoma tissues and normalmucosa were confirmed to be inflammatory or normalmucosa pathologically.②The expression of erythropoietinproducing hepatocellular receptor A2（EphA2），Hox genes A1（HoxA1）and cell-myc（C-myc）protein weremeasured with flow cytometere.Fluorescence index was defined as the quantitative expression index of EphA2，HoxA1 and C-myc protein.Results The quantitative and qualitative expressions of EphA2 protein，HoxA1 protein，C-myc protein in laryngeal carcinoma tissues were obviously higher than those in para-carcinoma and in normal laryngealmucosa tissues respectively；There was no significant difference between the expression of para-carcinoma and normal laryngealmucosa tissues.There wasmultiple linear regression relationship in the expression of EphA2，HoxA1 and C-myc in laryngeal carcinoma.The expression of EphA2 protein was positively correlated with HoxA1 protein，while negatively correlated with C-myc protein.The multiple linear regression equation was Y=0.983+0.739X1-0.323X2（P= 0.000）。Conclusion The expression of EphA2，HoxA1 and C-myc contribute to the carcinogenesis and

laryngeal neoplasms；receptor EphA2；flow cytometry

R735.7

A

1007-3205（2013）03-0294-04

2012-02-25；

2012-05-19

石棟梁（1971-），男，河北魏縣人，河北省邯鄲市第三醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事頭頸腫瘤外科疾病診治研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.03.016

development of laryngeal carcinoma.