CD40信號對宮頸癌血管生成的影響

·論 著·

CD40信號對宮頸癌血管生成的影響

CD40是相對分子質(zhì)量為4 800的Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNF-R）超家族成員，不僅表達(dá)于B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，在機(jī)體免疫應(yīng)答中占極重要的作用。研究［1］發(fā)現(xiàn)CD40還表達(dá)于一些腫瘤細(xì)胞，如霍奇金淋巴瘤、急慢性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等，具有促進(jìn)腫瘤血管生成的作用，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。干預(yù)CD40信號有望成為腫瘤治療的新方向。本文通過研究CD40在宮頸鱗癌細(xì)胞株（human cervical squamous epithelium cancer cell line，SiHa）上的表達(dá)情況，以及CD40信號對宮頸癌血管生成的影響，旨在為宮頸癌的治療尋找新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料：SiHa購自上海中科院細(xì)胞研究所。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）受贈于蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所。激發(fā)型鼠抗人CD40單克隆抗體（5C11）由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)研究所研制［2］。PE-二抗購自法國Immunotech公司。白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）檢測試劑盒購自上海晶美生物工程公司。EPICS-ALTRA型流式細(xì)胞儀為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為美國BIORAD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞儀分析CD40在SiHa及HUVEC

細(xì)胞上的表達(dá)：收集對數(shù)生長期SiHa及HUVEC細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，與 1μg 5C11在 4℃作用30min，PBS洗滌2次，離心后棄上清，再與50μL工作濃度PE-二抗在4℃作用30min，洗滌2次，加入固定液，上流式細(xì)胞儀檢測分析。同時用同種亞型的鼠IgG作為陰性對照。

1.2.2 ELISA法檢測5C11對SiHa及HUVEC細(xì)胞分泌VEGF及IL-6的影響：收集對數(shù)生長期SiHa及HUVEC細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板中，每組3個復(fù)孔，每孔體積1mL。a組，每孔接種105個SiHa細(xì)胞。b組，每孔接種105個SiHa細(xì)胞，并加入5C11，使其終濃度為 2mg/L。c組，每孔接種 105個HUVEC細(xì)胞。d組，每孔接種105個HUVEC細(xì)胞，并加入5C11，使其終濃度為2mg/L。置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h，收集細(xì)胞上清，在2 000r/min下離心 5min后，ELISA檢測上清中VEGF及IL-6的分泌情況。

1.2.3 MTT法檢測5C11對HUVEC細(xì)胞增殖的影響：收集對數(shù)生長期SiHa及HUVEC細(xì)胞，分6組接種于96孔培養(yǎng)板中，每組3個復(fù)孔，每孔體積200μL。A組，每孔接種104個HUVEC細(xì)胞。B組：每孔接種104個HUVEC細(xì)胞，并加入5C11，使其終濃度為2mg/L。C組，每孔接種103個SiHa細(xì)胞。D組，每孔接種103個SiHa細(xì)胞，并加入5C11，使其終濃度為2mg/L。E組，每孔接種104個HUVEC細(xì)胞和103個SiHa細(xì)胞，使其濃度比為10∶1。F組，每孔接種103個SiHa細(xì)胞，并用2mg/L 5C11預(yù)處理8～12h，再與104個HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，噻唑藍(lán)［3-（4，5）-dimethylthna 20（-z-yl）-2，5-diphernyltetra zolium bromide，MTT］法測吸光度（obsorbance，OD）值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CD40在SiHa及HUVEC細(xì)胞上的表達(dá)：SiHa及HUVEC細(xì)胞表面均高表達(dá)CD40（圖1），表達(dá)率分別為91.3%、91.1%。

圖1 SiHa及HUVEC細(xì)胞表面CD40的表達(dá)A.IgG（CD40 1.1%）；B.SiHa（CD40 91.3%）；C.HUVEC（CD40 91.1%）Figure 1 The expression of CD40 in SiHa and HUVECA.IgG（CD40 1.1%）；B.SiHa（CD40 91.3%）；C.HUVEC（CD40 91.1%）

2.2 5C11對 SiHa分泌 VEGF及 IL-6的影響：SiHa細(xì)胞能夠自分泌VEGF及IL-6，經(jīng)5C11刺激后分泌量增加。5C11刺激前后 SiHa細(xì)胞分泌VEGF的濃度分別為（1 436.73±193.40）、（1 983.17±119.12）ng/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。5C11刺激前后SiHa細(xì)胞分泌IL-6的濃度分別為（902.13±132.61）、（1 397.50±122.45）ng/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 5C11對HUVEC分泌VEGF及IL-6的影響：HUVEC能夠自分泌VEGF及IL-6，經(jīng)5C11刺激后分泌量無明顯變化。5C11刺激前后HUVEC分泌VEGF的濃度分別為（2 084.80±217.88）、（2 131.13±144.71）ng/L，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。5C11刺激前后HUVEC分泌IL-6的濃度分別為（1 461.40±74.70）、（1 466.73±58.49）ng/L，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 5C11及SiHa細(xì)胞對HUVEC細(xì)胞增殖的影響：5C11對HUVEC的生長無明顯影響，HUVEC單獨(dú)培養(yǎng)48h的OD值為1.262±0.116，與5C11共同培養(yǎng)48h OD值為1.221±0.063，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

SiHa細(xì)胞對 HUVEC的生長有促進(jìn)作用，HUVEC單獨(dú)培養(yǎng)48h的OD值為1.262±0.116，與1/10數(shù)量的SiHa共同培養(yǎng)48小時OD值明顯升高，為 2.081±0.059，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

5C11激發(fā)SiHa細(xì)胞后對HUVEC的生長促進(jìn)作用更明顯。1/10數(shù)量的SiHa與5C11共培養(yǎng)48h OD值為0.187±0.025，SiHa細(xì)胞無明顯增殖或生長抑制（P＞0.05）。SiHa細(xì)胞經(jīng)5C11刺激后再與HUVEC共同培養(yǎng)48h OD值為2.425±0.103，較HUVEC單獨(dú)培養(yǎng)時OD值明顯增高（P＜0.05），同時較HUVEC與SiHa細(xì)胞共培養(yǎng)時OD值也明顯升高（P＜0.05）。

3 討 論

子宮頸癌是全球第2位高發(fā)婦科惡性腫瘤。研究［3］顯示，我國子宮頸癌有發(fā)病率進(jìn)一步增高，且發(fā)病年齡趨于年輕化趨勢。目前臨床應(yīng)用的手術(shù)、放療、化療以及介入等治療，在殺死癌細(xì)胞的同時損傷人體正常細(xì)胞，且無法從根本上將癌癥根治，尤其是中晚期癌癥。故對宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移機(jī)制以及診治的研究具有重要意義。

研究［4-7］發(fā)現(xiàn) CD40還表達(dá)于一些腫瘤細(xì)胞上，如霍奇金淋巴瘤、急慢性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌等。其介導(dǎo)的信號在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。

血管生成與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，1971年哈佛大學(xué)Folkman教授［8］提出實體腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管生成的觀點(diǎn)。HUVEC提取于人臍帶靜脈組織，是研究血管內(nèi)皮細(xì)胞常用的細(xì)胞類型。VEGF又稱血管通透因子，是目前研究較為深入的促血管生成因子。它是一種對血管生成有極強(qiáng)誘導(dǎo)作用的因子，能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、細(xì)胞質(zhì)鈣聚集以及誘導(dǎo)血管生成等［9-10］。許多人體腫瘤均有VEGF的過度表達(dá)，在宮頸癌中VEGF的合成和分泌主要在腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，并主要以自分泌和旁分泌途徑作用于腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞及HUVEC自身能夠分泌VEGF，從而促進(jìn)血管生成，促進(jìn)腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移。

IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，在B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞的增

殖分化、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病和某些腫瘤中起重要的作用。它在多種腫瘤中有異常表達(dá)，與腫瘤中的血管生成有關(guān)，并可增加腫瘤細(xì)胞活動性，減少細(xì)胞間的粘連結(jié)合，促進(jìn)腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移［11］。Wei等［12］用重組人 IL-6加入宮頸癌C33A細(xì)胞中，可誘導(dǎo)該細(xì)胞株產(chǎn)生時間和劑量依賴性的VEGF，同樣，使用IL-6抗體或IL-6受體抗體能使另一種宮頸癌細(xì)胞SiHa細(xì)胞減少VEGF的表達(dá)。在體內(nèi)IL-6通過正向調(diào)節(jié)VEGF，可增強(qiáng)人宮頸癌細(xì)胞的血管形成，同時在裸鼠體內(nèi)使用抗VEGF抗體阻斷VEGF的功能，可抑制IL-6介導(dǎo)的血管形成及腫瘤生長。本研究發(fā)現(xiàn)SiHa及HUVEC不僅能分泌VEGF，也能分泌IL-6，從而促進(jìn)血管生成，促進(jìn)腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移。

CD40-CD40L作為機(jī)體免疫系統(tǒng)中一對重要的共刺激分子，不僅在B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的活化有重要作用，在腫瘤的生長、分化、轉(zhuǎn)移中也有一定的作用。研究［13］表明CD40的激活可以促使血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，從而促使腫瘤血管生成。CD40信號活化后，能通過MAPK、PI3K/Akt等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上調(diào)VEGF、IL-6、PAF等因子，進(jìn)而通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促使血管內(nèi)皮細(xì)胞生長等途徑促使腫瘤血管生成［14-15］。Xie等［16］在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CD40信號活化可誘導(dǎo)VEGF表達(dá)和分泌，從而參與新生血管形成。本研究表明CD40信號能夠上調(diào)宮頸癌細(xì)胞分泌VEGF及IL-6，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成，促進(jìn)宮頸癌生長、浸潤及轉(zhuǎn)移。

本研究發(fā)現(xiàn)HUVEC細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)能分泌VEGF及IL-6，而經(jīng)5C11刺激后分泌量改變不明顯。5C11作用后HUVEC細(xì)胞未出現(xiàn)明顯生長抑制或促進(jìn)。表明CD40信號不直接影響HUVEC分泌VEGF、IL-6等促血管生成因子，也不直接影響其生長增值。但是，本研究發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞能夠促進(jìn)HUVEC細(xì)胞生長，經(jīng)5C11刺激后的SiHa細(xì)胞對HUVEC細(xì)胞的生長促進(jìn)作用更明顯。

綜上所述，CD40信號可能通過促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞分泌VEGF及IL-6來促使血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，從而促使腫瘤血管生成，腫瘤發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移。干預(yù)CD40信號有望成為宮頸癌治療的新方向。

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（本文編輯：劉斯靜）

倪冬梅1，黃 沁2*，瞿秋霞3，沈宗姬2
（1.浙江省湖州市婦幼保健院婦產(chǎn)科，浙江湖州313000；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇蘇州215006，3.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所，江蘇蘇州215006）

目的探討CD40信號對宮頸癌血管生成的影響。方法采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD40在宮頸鱗癌細(xì)胞株（human cervical squamous epithelium cancer cell line，SiHa）及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）上的表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測CD40信號對SiHa及HUVEC分泌血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）的影響；噻唑藍(lán)法檢測CD40信號對HUVEC增殖的影響。結(jié)果SiHa及HUVEC細(xì)胞表面均高表達(dá)CD40。SiHa細(xì)胞能夠分泌VEGF及IL-6，經(jīng)激發(fā)型CD40單克隆抗體（5C11）刺激后分泌量均增加。HUVEC細(xì)胞能夠分泌VEGF及IL-6，經(jīng)5C11刺激后分泌量均無明顯變化。5C11對HUVEC的增殖無明顯影響，SiHa細(xì)胞對HUVEC的生長增殖有促進(jìn)作用，經(jīng)5C11激發(fā)后促增殖作用更明顯。結(jié)論宮頸鱗癌細(xì)胞能夠自分泌VEGF及IL-6，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，CD40信號可能通過促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞分泌VEGF及IL-6來促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，從而介導(dǎo)新生血管生成，腫瘤發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移。

宮頸腫瘤；CD40配體；內(nèi)皮，血管

THE EFFECT OF CD40 SIGNAL ON THE ANGIOGENESISOF CERVICAL CANCER

NIDongmei1，HUANG Qin2*，QU Qiuxia3，SHEN Zongji2
（1.Department of Gynaecology and Obstetrics，Maternal and Child Health Hospital，Huzhou City，Zhejiang Province，Huzhou 313000，China；2.Department of Gynaecology and Obstetrics，the First Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou City，Jiangsu Province，Suzhou 215006，China；3.Medical Biotechnology Institute，Soochow University，Suzhou City，Jiangsu Province，Suzhou 215006，China）

Objective To study the effect of CD40 signal on the angiogenesis of cervical cancer.M ethods The expression of CD40 in human cervical squamous epithelium cancer cell line（SiHa）and human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）were determined by flow cytometry（FCM）.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）was used to detect the secretion for vascular endothelial growth factor（VEGF）and interleukin-6（IL-6）of SiHa and HUVEC.And agonistic antihuman CD40 monoclonal antibody（5C11）was used to active CD40 signal.The proliferation of HUVEC was analyzed by 3-（4，5）-dimethylthna 20（-z-yl）-2，5-diphernyltetra zolium bromide（MTT）reduction assay after treating with 5C11 and SiHa.Results SiHa and HUVEC cell lines both highly expressed CD40，their expression rateswere 91.3%and 91.1%respectively.SiHa can autocrine VEGF and IL-6，and 5C11 can significantly increase their secretion.HUVEC can autocrine VEGF and IL-6，but，5C11 had no effect on their secretion.5C11 had no effect on the proliferation of HUVEC，while SiHa can significantly promote the proliferation of HUVEC and 5C11 combined with SiHa can much more significantly promote the proliferation of HUVEC.Conclusion Human cervical cancer cell can autocrine

uterine cervical neoplasms；CD40 ligand；endothelium，vascular

R737.33

A

1007-3205（2013）03-0287-04

2012-06-04；

2012-08-04

倪冬梅（1983-），女，四川江油人，浙江省湖州市婦幼保健院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事婦科腫瘤診治研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.03.014

VEGF and IL-6，and CD40 signal can increase their secretion.CD40 signalmay promote the proliferation of vascular endothelial cell by increasing the secretion of VEGF and IL-6 in cervical cancer.The CD40 signalmay play an important role in the angiogenesis of cervical cancer.