葉黃素對體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-9706細胞增殖和凋亡的影響

李 莉，任廣偉，趙 昱，龔 淼，孟 麗，高福祿

（1.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，河北石家莊050017；2.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院腎內科，河北石家莊050031；3.河北師范大學生命科學院，河北石家莊050024）

·論 著·

葉黃素對體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-9706細胞增殖和凋亡的影響

李 莉1，任廣偉2，趙 昱1，龔 淼1，孟 麗1，高福祿3*

（1.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，河北石家莊050017；2.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院腎內科，河北石家莊050031；3.河北師范大學生命科學院，河北石家莊050024）

目的探討葉黃素對體外培養(yǎng)的人食管癌9706細胞（esophageal carcinoma 9706，Ec-9706）增殖和細胞凋亡的影響。方法將Ec-9706細胞用含10%胎牛血清的RPMIl640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2/95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用隨機數字表法，將其隨機分為4組：對照組（C組）和不同濃度葉黃素組（L1～3組）。L1～3組分別加入40、80和160μmol/L葉黃素；C組加入等體積RPMI1640培養(yǎng)液。采用噻唑蘭法檢測不同濃度葉黃素對人食管癌Ec-9706細胞增殖的影響；采用流式細胞術檢測Ec-9706細胞凋亡情況；采用免疫細胞化學方法檢測Fas、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、cyclin D1和Caspase-3蛋白的表達。結果葉黃素可抑制Ec-9706細胞的增殖，誘導Ec-9706細胞的凋亡，且呈劑量依賴性。葉黃素可下調Ec-9706細胞PCNA和cyclin D1蛋白表達，上調Fas和Caspase-3蛋白表達，且呈劑量依賴性。結論葉黃素可抑制體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-9706細胞的增殖，誘導其凋亡，且呈濃度依賴性，其機制與下調PCNA和cyclin D1蛋白表達，上調Fas和Caspase-3蛋白表達有關。

食管腫瘤；細胞增殖；細胞凋亡；葉黃素

葉黃素是廣泛存在于自然界植物中的一種含氧類胡蘿卜素。流行病學和動物實驗研究表明，葉黃素在視覺保護、增強免疫功能、預防慢性病和降低癌癥發(fā)生等方面有廣泛的生物學活性［1］。有研究［2］表明，葉黃素在抗消化道腫瘤方面有顯著作用，尤其是食管癌。但其機制尚未見報道。本研究擬探討葉黃素對體外培養(yǎng)的人食管癌9706細胞（esophageal carcinoma 9706，Ec-9706）增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器：RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），胎牛血清（杭州四季青生物制品公司），噻唑蘭和碘化丙啶熒光染料（Sigma公司，美國），兔抗人 Fas抗體、兔抗人增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體、兔抗人cyclin D1抗體和兔抗人Caspase-3抗體、SP試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），葉黃素（Sigma公司，美國），胰蛋白酶（Sigma公司，美國）；HF-212UV CO2恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司），Motic AE31倒置顯微鏡（Motic公司，德國），DG5031型酶聯(lián)免疫檢測儀（上海華東電子集團醫(yī)療裝備公司），Epics-XLⅡ型流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）。

1.1.2 細胞株：Ec-9706細胞株由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所建系，本實驗室凍存。將Ec-9706細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2/95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天用0.25%胰酶消化，以1∶2傳代1次。

1.2 方法

1.2.1 葉黃素溶液的配制：實驗前將葉黃素用1mL二甲基亞砜充分溶解，用 RPMI1640培養(yǎng)液配成終濃度為320μmol/L的母液，4℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實驗分組：采用隨機數字表法，將其隨機分為4組，即對照組（C組）和不同濃度葉黃素組（L1～3組）。L1～3組分別加入40、80和160μmol/L葉黃素；C組加入等體積RPMI1640培養(yǎng)液。

1.2.3 葉黃素對Ec-9706細胞增殖影響的測定：取對數生長期的Ec-9706細胞和正常人外周血單個核細胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔滴加200μL單細胞懸液，使每孔含1.7×103個細胞，設8個復孔，同時接種6個96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h。分別在孵育24、48和72h，取出2塊培養(yǎng)板，每孔滴加噻唑蘭溶液（5g/L）20μL，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h后終止培養(yǎng)。棄上清，每孔滴加二甲基亞砜200μL，振蕩15 min。酶標儀在570 nm處測定各孔吸光度，計算細胞增殖抑制率 =（1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。

1.2.4 葉黃素對Ec-9706細胞凋亡影響的測定：取12瓶對數生長期 Ec-9706細胞，分別于24、48和72h取出不同藥物濃度細胞4瓶，收集細胞分別放入4個15mL離心管內標記后進行離心，制成濃度為7×108個/L的單細胞懸液離心后棄上清液緩慢加入預冷70%無水乙醇7mL，4℃過夜。采用碘化丙啶單染法，每份樣品中加入雞紅細胞作為內參標準，與樣品同步染色，每份樣品中加入1mL碘化丙啶染液，在4℃避光孵育30min。用488nm氬離子激光器激發(fā)由630nm帶通濾光片接收，通過散點圖收集10 000個細胞，分析碘化丙啶熒光直方圖上凋亡細胞百分率。

1.2.5 Fas、PCNA、cyclin D1和Caspase-3蛋白表達的測定：取對數生長期細胞制成濃度為1×107個/L的單細胞懸液，接種到放有蓋玻片的6孔板，培養(yǎng)箱孵育24h，使細胞貼壁于蓋玻片上。分別于孵育24、48和72h后取出蓋玻片，SP法進行免疫細胞化學染色，3%甲醇-H2O2室溫處理10min，微波抗原修復（9℃）15min。免疫細胞化學染色。用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。采用圖像分析系統(tǒng)進行定量分析，每張玻片隨機取5個高倍視野，測定特異性著色的積分光密度值，反映目的蛋白的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法：應用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，分別采用單因素方差分析和q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 葉黃素對Ec-9706細胞增殖的影響：與C組比較，L1～3組細胞增殖抑制率升高，且呈濃度依賴性，見表1。

表1 4組Ec-9706細胞增殖抑制率比較Table 1 Comparison of inhibitory rate of Ec-9706 cells proliferation in 4 groups（n=7，±s，%）

表1 4組Ec-9706細胞增殖抑制率比較Table 1 Comparison of inhibitory rate of Ec-9706 cells proliferation in 4 groups（n=7，±s，%）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h C ---L1 3.0±0.4 27.5±1.9* 48.9±2.2*L2 11.2±0.3*# 41.9±2.7*# 64.7±2.9*#L3 30.3±1.0*#△ 78.2±3.0*#△ 85.7±3.8*#△

2.2 葉黃對Ec-9706細胞凋亡的影響：與C組比較，L1～3組細胞凋亡率升高，且呈濃度依賴性（P＜0.05），見表2。

表2 4組Ec-9706細胞凋亡率比較Table 2 Comparison of apoptosis rate of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=3，±s，%）

表2 4組Ec-9706細胞凋亡率比較Table 2 Comparison of apoptosis rate of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=3，±s，%）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h C 1.9±0.6 3.8±1.1 4.0±0.9 L1 8.7±0.9* 14.2±1.3* 42.3±2.1*L2 12.8±1.0* 35.4±2.0*# 63.0±1.3*#L3 28.1±1.2*#△ 67.3±3.3*#△ 75.6±3.0*#△

2.3 葉黃素對Ec-9706細胞Fas、Caspase-3、PCNA、cyclin D1蛋白表達的影響：與C組比較，L1～3組細胞 PCNA和 cyclin D1蛋白表達下調，F(xiàn)as和Caspase-3蛋白表達上調，且呈濃度依賴性（P＜0.05），見表3～6。

表3 4組Ec-9706細胞PCNA蛋白表達比較Table 3 Comparison of PCNA protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

表3 4組Ec-9706細胞PCNA蛋白表達比較Table 3 Comparison of PCNA protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h C 90.5±2.3 91.9±1.6 91.4±2.1 L1 86.2±1.7 80.5±1.0* 77.3±1.4*L2 80.3±1.2 72.3±1.8*# 69.4±1.7*#L3 69.7±1.1*#△ 65.0±1.2*#△ 59.8±1.9*#△

表4 4組Ec-9706細胞cyclin D1蛋白表達比較Table 4 Comparison of cyclin D1 protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

表4 4組Ec-9706細胞cyclin D1蛋白表達比較Table 4 Comparison of cyclin D1 protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h C 89.0±2.1 88.9±1.1 90.7±2.5 L1 87.2±1.7 82.6±1.4* 78.0±1.4*L2 80.5±1.7 75.1±1.5*# 69.2±1.3*#L3 70.9±1.3*#△ 64.7±1.2*#△ 59.6±1.1*#△

表5 4組Ec-9706細胞Fas蛋白表達比較Table 5 Com parison of Fas protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

表5 4組Ec-9706細胞Fas蛋白表達比較Table 5 Com parison of Fas protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h C 5.6±2.4 7.3±3.0 10.0±2.5 L1 18.6±2.3* 26.9±3.4* 39.2±2.9*L2 30.1±3.5*# 42.5±2.6*# 51.3±3.2*#L3 49.7±3.9*#△ 60.1±4.1*#△ 70.8±3.4*#△

表6 4組Ec-9706細胞Caspase-3蛋白表達比較Table 6 Com parison of Caspase-3 protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

表6 4組Ec-9706細胞Caspase-3蛋白表達比較Table 6 Com parison of Caspase-3 protein expression of Ec-9706 cells in the 4 groups（n=5，±s，OD）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group L1△P＜0.05 vs group L2by q test

Groups 24h 48h 72h 0 6.1±2.0 7.4±1.3 9.3±2.1 L1 18.9±2.7* 29.2±2.8* 43.1±2.3*L2 32.5±3.5*# 44.1±3.0*# 55.0±2.9*#L3 52.6±3.6*#△ 62.4±3.1*#△ 74.3±4.0*#△

3 討 論

本實驗研究了葉黃素對低分化人食管癌Ec-9706細胞株的增值抑制和凋亡誘導作用。腫瘤細胞區(qū)別于正常細胞的一個重要特征就是腫瘤細胞可以持續(xù)分裂并不斷增殖［3］。本研究結果顯示，葉黃素對Ec-9706細胞增殖有顯著的抑制作用，并呈濃度依賴性，隨著作用時間的延長160μmol/L濃度葉黃素組對 Ec-9706細胞的生長抑制作用大于40μmol/L濃度組，葉黃素溶液在160μmol/L濃度下作用72h對細胞的抑制增殖作用最明顯。

PCNA又稱周期蛋白，是DNA聚合酶8的輔助成分，與細胞的DNA復制有關［4］，與細胞周期的不同時相密切相關［5］。PCNA的陽性表達程度直接反映DNA復制的程度，可作為評價細胞增殖狀態(tài)的重要指標［6］。本研究結果顯示，在 Ec-9706細胞中PCNA陽性表達的平均光密度值為90.5±2.3，隨著葉黃素濃度的增加和作用時間的延長，PCNA在Ec-9706細胞中的陽性表達率逐漸降低，160μmol/L葉黃素溶液作用72h后細胞中PCNA的陽性表達率平均光密度值僅為59.8±1.9。說明葉黃素可以抑制Ec-9706細胞的增殖。

cyclin D1是調節(jié)細胞周期的主要蛋白之一，其在細胞由G0期進入G1期的過程中起重要作用。若cyclin D1受抑制，則細胞不能進入S期，增殖受到抑制［7］。本研究結果顯示，在Ec-9706細胞中cyclin

D1陽性表達的平均光密度值為89.0±2.1，隨著葉黃素濃度的增加和作用時間的延長，cyclin D1在Ec-9706細胞中的陽性表達率逐漸降低，160μmol/L葉黃素溶液作用72h后細胞中cyclin D1的陽性表達率平均光密度值僅為59.6±1.1。此結果與流式細胞術檢測細胞周期和凋亡情況結果一致。說明葉黃素可以通過下調cyclin D1的表達抑制Ec-9706細胞的增殖，促進凋亡。

Fas屬于神經生長因子/腫瘤壞死因子受體超家族成員，是一種促進凋亡的相關基因［8］。Fas途徑是T細胞消滅腫瘤細胞的重要途徑。腫瘤細胞下調Fas的表達水平使免疫逃避發(fā)生［9］。本研究結果顯示，隨著葉黃素濃度的增加和作用時間的延長，F(xiàn)as在 Ec-9706細胞中的陽性表達率逐漸增高，160μmol/L葉黃素溶液作用72h后Fas在細胞中的陽性表達平均光密度值增高至70.8±3.4。提示葉黃素有可能作用于細胞中的Fas蛋白，使Fas信號傳導體系誘導激活細胞中的細胞凋亡途徑相關因子。說明葉黃素可以通過此途徑誘導Ec-9706細胞的凋亡。

Caspase-3是天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶家族中最重要的一員，是細胞凋亡的關鍵效應分子。其活化可以導致級聯(lián)反應活化，直接激活DNA斷裂因子和核酸內切酶，降解細胞骨架蛋白，導致細胞凋亡［10］。本研究結果顯示，隨著葉黃素濃度的增加和作用時間的延長，Caspase-3在Ec-9706細胞中的陽性表達率逐漸增高，160μmol/L葉黃素溶液作用72h后Caspase-3在細胞中的陽性表達平均光密度值增高至74.3±4.0。與Fas表達水平結果一致。提示葉黃素可以通過此凋亡共同途徑誘導Ec-9706細胞的凋亡。

腫瘤的生物學共性是失控性生長，主要機制是細胞周期紊亂導致增殖過多和凋亡過少。細胞凋亡是指由體內外因素觸發(fā)細胞內預存的死亡程序誘導的細胞死亡過程［11］。凋亡細胞的DNA分子發(fā)生斷裂，相對分子質量小的DNA片段丟失，相對分子質量大的片段形成一個DNA含量小于二倍體的區(qū)域，在流式細胞儀檢測中形成位于G0/G1峰之前的亞G1峰，壞死的細胞檢測不出現(xiàn)此峰，故此峰被稱作凋亡峰，凋亡峰的高度和寬度與凋亡細胞的數量成正比［12］。本研究結果顯示，隨著葉黃素作用濃度的增高和作用時間的延長，亞G1峰的高度和寬度隨之增加。說明葉黃素可以誘導Ec-9706細胞凋亡，并有濃度依賴關系。此結果與前面噻唑蘭和流式細胞儀分別檢測細胞的增殖能力和細胞周期相一致。

綜上所述，葉黃素可抑制體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-9706細胞的增殖，誘導其凋亡，且呈濃度依賴性，其可能機制與抑制cyclin D1和PCNA的表達，同時活化Fas和Caspase-3有關。

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（本文編輯：趙麗潔）

EFFECTSOF LUTEIN ON THE PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF HUMAN ESOPHAGEAL CARCINOMA EC-9706 CELLS IN VITRO

LILi1，REN Guangwei2，ZHAO Yu1，GONG Miao1，MENG Li1，GAO Fulu3*
（1.Department of Histology and Embryology，the School of Basic Medical Sciences，HebeiMedical University，Shijiazhuang 050017，China；2.Department of Nephrology，the First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050031，China；3.School of Life Sciences，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024，China）

Objective To observe the effects of lutein on the proliferation and apoptosis of human esophageal carcinoma 9706（Ec-9706）cell line in vitro.M ethods The inhibitory effect of lutein on the proliferation of human Ec-9706 cells at different concentrations was determined by methyl thiazolyltetrazolium（MTT）assay.The changes of cell apoptosis rate of tumor cells were determined by flow cytometry（FCM）.The expression of Fas，proliferating cell nuclear antigen（PCNA），cyclin D1 and Caspase-3 proteins were examined by immunocytochemical technique.Results Lutein significantly inhibited the proliferation and induced the apoptosis of Ec-9706 cells in a dose-dependentmanner.Lutein dramatically inhibited protein expression of PCNA and cyclin D1，while up-regulated the expression of Fas and Caspase-3 protein.Conclusion Lutein can inhibit the proliferation of Ec-9706 cells and induce the apoptosis of Ec-9706 cells in vitro by down-regulating the expression of PCNA and cyclin D1 and up-

esophageal neoplasms；cell proliferation；apoptosis；lutein

R735.1

A

1007-3205（2013）03-0249-04

2012-12-11；

2013-02-26

河北省科技廳計劃指導課題（10276181）

李莉（1976-），女，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院講師，醫(yī)學碩士，從事組織胚胎學研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.03.001

regulating Fas and Caspase-3 expression.