子宮內(nèi)膜癌端粒酶催化亞單位表達與DNA含量的相關性研究

趙文波，樊愛軍，樓正青，王育瑛

（浙江省杭州市中醫(yī)院檢驗科，浙江杭州310007）

·論 著·

子宮內(nèi)膜癌端粒酶催化亞單位表達與DNA含量的相關性研究

趙文波，樊愛軍，樓正青，王育瑛

（浙江省杭州市中醫(yī)院檢驗科，浙江杭州310007）

目的探討子宮內(nèi)膜組織中端粒酶催化亞單位（human telomerase reverse transcriptase，hTRT）表達與DNA含量對子宮內(nèi)膜癌的診斷意義以及二者之間的關系。方法采用原位雜交法對子宮內(nèi)膜癌40例、子宮內(nèi)膜不典型增生20例及正常子宮內(nèi)膜組織8例的hTRT表達進行檢測；用流式細胞儀檢測3種組織細胞的DNA含量。結果子宮內(nèi)膜癌組織hTRT表達陽性率為87.5％，明顯高于正常子宮內(nèi)膜與子宮內(nèi)膜不典型增生組織（P＜0.01）；而且子宮內(nèi)膜不典型增生組織hTRT表達陽性率（40.0％）高于正常子宮內(nèi)膜（12.5％）。從正常子宮內(nèi)膜到子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜癌，DNA指數(shù)值與S期細胞百分比值逐漸增高（P＜0.05）。hTRT陽性腫瘤組織中異倍體腫瘤（28/35）明顯高于hTRT陰性腫瘤組織（1/5）。結論從正常子宮內(nèi)膜到子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜癌，hTRT表達陽性率及DNA含量逐漸增高，提示hTRT陽性表達和DNA含量的增高與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展高度相關，對子宮內(nèi)膜癌的診斷具有重要意義。

子宮內(nèi)膜腫瘤；端粒，末端轉(zhuǎn)移酶；診斷

子宮內(nèi)膜癌是危害女性健康的主要惡性腫瘤之一，近年來，其發(fā)病率呈上升趨勢。對子宮內(nèi)膜癌及時而準確的診斷是降低其病死率的關鍵，因此，人們

一直在努力尋找子宮內(nèi)膜癌診斷的理想指標。端粒酶活化是正常組織細胞向惡性演變過程中的重要步驟，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTRT）又稱端粒酶催化亞單位，是端粒酶的重要組成部分，與酶活性密切相關，被認為是激活端粒酶的限速酶［1］。目前，端粒酶及其組分與惡性腫瘤的關系已引起人們的廣泛關注。本研究采用原位雜交法分別檢測正常、不典型增生及癌變子宮內(nèi)膜組織hTRT的表達，同時采用流式細胞術檢測其DNA含量，探討hTRT及DNA含量在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用并初步揭示二者之間的關系，以期為子宮內(nèi)膜癌的臨床診斷及治療提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源：68例子宮內(nèi)膜組織石蠟切片取材時間為2008年6月—2010年9月?；颊吣挲g28～79歲，中位年齡60歲。子宮內(nèi)膜癌40例，其中高分化癌11例，中分化癌23例，低分化癌6例；子宮內(nèi)膜不典型增生20例，其中輕度不典型增生6例，中度不典型增生12例，重度不典型增生2例；正常宮內(nèi)膜組織8例，其中增殖期5例，分泌期3例。所有標本均經(jīng)病理確診。每例標本切取4μm、50μm切片各3張。

1.2 主要試劑及設備：hTRT原位雜交試劑盒由北京大學醫(yī)學部病理教研室提供；FACSCalibur流式細胞儀及Cycle TESTTMPLUSDNA REAGENT KIT試劑盒為美國B-D公司產(chǎn)品。

1.3 hTRT檢測：按原位雜交試劑盒說明書進行操作，4μm組織切片常規(guī)脫蠟、水化→0.3％H2O2封閉→0.1mol/L HCl處理→蛋白酶K消化→4％多聚甲醛后固定→滴加雜交液20μL/片，封口膜覆蓋后放入含50％甲酰胺2×檸檬酸鹽緩沖液的濕盒中，42℃雜交過夜，PBS代替探針作陰性對照→切片于2×檸檬酸鹽緩沖液中洗3次→馬血清封閉后滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉素含素→二氨基聯(lián)苯胺-H2O2顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片鏡檢。顯微鏡下觀察，胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為hTRT陽性。弱陽性（+），陽性信號面積＜25％；陽性（++），陽性信號面積25％～50％；強陽性（+++），陽性信號面積＞50％。無棕黃色顆粒出現(xiàn)者為hTRT陰性。

1.4 DNA含量分析：每例標本取50μm組織片3張置于大試管中，常規(guī)脫蠟、水化；每管加檸檬酸鹽緩沖液5mL，置80℃2h［3］，離心棄上清；加0.5％胃蛋白酶消化液4mL（生理鹽水配制，用HCl調(diào)pH值為1.5），37℃水浴孵育30min，消化期間，每隔5 min振蕩懸浮1次；加生理鹽水終止消化，1 500r/min離心5min，棄上清；加5mL PBS，800r/min離心2min去除細胞碎片；200目尼龍網(wǎng)濾去未消化組織碎片，收集濾液，PBS離心洗滌2次，顯微鏡下計數(shù)，調(diào)節(jié)每管細胞數(shù)為5×105，離心棄上清；加試劑盒A液250μL，室溫10min；加B液200μL，室溫10min；加C液200μL，4℃避光10min；500目尼龍網(wǎng)過濾，流式細胞儀檢測。標本檢測前，以DNA QC PARTICLES試劑盒校正流式細胞儀，調(diào)節(jié)電壓及熒光強度。以淋巴細胞分離液分離人外周血單個核細胞作為外標樣品，與子宮內(nèi)膜細胞同時進行流式細胞儀分析。每份標本收取15 000個細胞。以DNA指數(shù)（DNA index，DI）表示相對DNA含量，DI=樣品G0/G1期峰均道值/正常子宮內(nèi)膜G0/G1期峰均道值。嚴格來說，二倍體或四倍體細胞的DI值應為1或2，但由于石蠟切片在處理過程中會產(chǎn)生碎片，檢驗方法學也會存在誤差，均會導致一些變異。故一般將二倍體的DI值定為0.9～1.1，DI值在此范圍之外者則為異倍體。最后，采用B-D公司提供的ModFit LT軟件進行細胞周期分析，計算標本的S期細胞百分比（S phase fraction，SPF）。

1.5 統(tǒng)計學方法：應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，采用方差分析；相關性采用Spearman相關分析；計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 hTRT表達情況：hTRT陽性信號主要位于細胞質(zhì)內(nèi)，為棕黃色顆粒。正常子宮內(nèi)膜組織hTRT陽性表達較少見且為弱陽性；子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜癌組織hTRT表達主要為陽性，并且子宮內(nèi)膜癌組織hTRT表達出現(xiàn)較多的強陽性。子宮內(nèi)膜癌組織hTRT陽性率為87.5％（35/40），正常子宮內(nèi)膜組織hTRT陽性率為12.5％（1/8），二者相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；子宮內(nèi)膜不典型增生組織hTRT陽性率為40％（8/20），與正常子宮內(nèi)膜組織差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與子宮內(nèi)膜癌組織相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。從正常、不典型增生到癌變子宮內(nèi)膜，hTRT陽性強度逐漸增強（rs=0.605，P＜0.01）。見表1。

表1 子宮內(nèi)膜組織hTRT表達Table 1 Expression of hTRT in endometrial tissue

2.2 DNA含量檢測結果：8例正常子宮內(nèi)膜組織細胞DNA含量均為二倍體，DNA以G0/G1期細胞群為主，S期細胞峰光滑平坦，G2M期細胞出現(xiàn)小峰；20例不典型增生子宮內(nèi)膜中二倍體12例，DNA顯示S期細胞峰稍高，G2M期細胞峰亦有增高；40例子宮內(nèi)膜癌組織中二倍體11例，DNA顯示S期及G2M期細胞峰均高于正常子宮內(nèi)膜組織。異倍體不典型增生及異倍體腫瘤細胞出現(xiàn)明顯的異倍體峰。子宮內(nèi)膜癌組織異倍體率為72.5％（29/40），明顯高于子宮內(nèi)膜不典型增生組織（P＜0.05）及正常子宮內(nèi)膜（P＜0.01）；子宮內(nèi)膜不典型增生組織異倍體率為40.0％，與正常子宮內(nèi)膜相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。從正常、不典型增生到內(nèi)膜癌組織，DI值及SPF值逐漸增高（P＜0.05）。見表2，3。

表4 子宮內(nèi)膜癌組織hTRT表達與DNA倍體的關系Table 4 Endom etrial cancer tissue hTRT exp ression and DNA p loidy relationship （n）

表2 3種子宮內(nèi)膜組織DNA倍體Table 2 Three kinds of endometrial tissues DNA ploidy

表3 子宮內(nèi)膜組織DI值及SPF值分布Table 3 Endometrial tissue DI value andSPF value distribution （±s）

表3 子宮內(nèi)膜組織DI值及SPF值分布Table 3 Endometrial tissue DI value andSPF value distribution （±s）

*P＜0.05 vs normal #P＜0.05 vs typical hyperplasia by ANOVA test

Endometrial tissues n DI SPF（％）Normal 8 1.01±0.07 8.21±2.30 Typical hyperplasia 20 1.16±0.13*13.66±3.22*Endometrial carcinoma 40 1.43±0.18*#23.62±4.69*#

2.3 子宮內(nèi)膜癌組織hTRT表達與DNA倍體的關系：hTRT表達陰性的子宮內(nèi)膜癌組織多為二倍體，異倍體僅占20％（1/5）；hTRT表達陽性者則多為異倍體，異倍體比例為80.0％（28/35）。hTRT表達陽性腫瘤組織異倍體率明顯高于陰性腫瘤組織（P＜0.05），hTRT表達與DNA倍體之間存在一定聯(lián)系（rs=0.44，P＜0.01）。見表4。

3 討 論

3.1 hTRT檢測對子宮內(nèi)膜癌的診斷意義：研究［2］表明大多數(shù)人類惡性腫瘤及永生化細胞中端粒酶活性顯著增高，端粒酶活化與細胞的異常增殖密切相關，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起非常重要的作用。hTRT的表達與端粒酶的活性表達完全一致，在原發(fā)性腫瘤、癌細胞系以及端粒酶陽性表達的組織中hTRT均有較高表達［3］。檢測hTRT的表達已成為端粒酶活性檢測的又一主要方法。Oshita等［4］對36例子宮內(nèi)膜癌的端粒酶活性和hTRT表達進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)端粒酶活性與hTRT的陽性率基本一致，并且均明顯高于正常子宮內(nèi)膜。本研究采用原位雜交法檢測hTRT在子宮內(nèi)膜石蠟包埋組織中的表達，即可間接反映出端粒酶活性的高低，又克服了以往方法標本限制問題。本研究結果表明，hTRT主要表達于細胞質(zhì)中，40例子宮內(nèi)膜癌組織中有35例hTRT陽性，陽性率87.5％，明顯高于正常及不典型增生子宮內(nèi)膜組織，與文獻報道接近［5］。在8例正常子宮內(nèi)膜組織中，有1例hTRT陽性。由于子宮內(nèi)膜癌多發(fā)生于絕經(jīng)后婦女，因此，hTRT檢測對于子宮內(nèi)膜癌的診斷仍具有重要價值。

3.2 子宮內(nèi)膜癌的DNA含量變化：腫瘤細胞特別是惡性腫瘤細胞的DNA含量多有不同程度的升高，DNA異倍體的出現(xiàn)則是惡性腫瘤的特征性標志之一。隨著流式細胞術在腫瘤研究中的廣泛應用，DNA含量分析與腫瘤臨床因素的關系引起人們越來越多的關注。國內(nèi)外學者一致認為，DNA倍體分析可作為評價預后的獨立指標［6］。關于DNA含量分析在子宮內(nèi)膜癌診斷方面的意義，目前國內(nèi)外報道極為少見。張蓉等［7］采用流式細胞術對30例子

宮內(nèi)膜癌患者腫瘤新鮮組織進行DNA含量分析，結果異倍體率為56.7％。本研究40例子宮內(nèi)膜癌中異倍體29例，異倍體率72.5％，內(nèi)膜癌組DNA異倍體率明顯高于正常組及不典型增生組。究其原因很可能是我們采用的石蠟切片標本在細胞制備過程中產(chǎn)生的細胞碎片較多，致使測試結果偏高。從正常子宮內(nèi)膜到子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜癌，DI值與SPF值逐漸增高。這表明DNA含量變化與子宮內(nèi)膜癌演進過程密切相關，DNA含量分析對子宮內(nèi)膜癌的診斷及其與癌前病變的鑒別診斷具有重要價值，增生子宮內(nèi)膜中出現(xiàn)較高DI值及SPF值可能提示惡變幾率的升高。

3.3 hTRT的表達與DNA含量分析：hTRT表達與DNA含量異常之間可能存在某種聯(lián)系，在細胞分裂過程中，端粒逐漸縮短，細胞停止分裂退出細胞周期而凋亡。由此可見，端粒的持續(xù)縮短降低了染色體的穩(wěn)定性，使染色體容易發(fā)生畸變，此時細胞便表現(xiàn)為異倍體，同時端粒的過度縮短也是端粒酶激活的重要原因。本研究中hTRT陽性的內(nèi)膜癌組織異倍體占80.0％，hTRT陰性者異倍體占20.0％，hTRT陽性內(nèi)膜癌的異倍體率明顯高于hTRT陰性者。有學者［8-9］認為異倍體腫瘤端粒酶活性明顯高于非異倍體腫瘤。本研究結果顯示hTRT表達與DNA倍體之間存在一定聯(lián)系，表明二者聯(lián)合檢測能進一步提高子宮內(nèi)膜癌診斷的準確性，同時也提示hTRT可能對子宮內(nèi)膜癌的預后判斷具有一定意義。由于本研究患者無隨訪資料，有關hTRT表達與子宮內(nèi)膜癌預后的關系尚有待研究。此外，因樣本例數(shù)較少，有關hTRT表達及DNA含量與子宮內(nèi)膜癌組織學類型、病理分級的關系也有待于進一步研究。

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（本文編輯：趙麗潔）

EXPRESSION OF HUMAN TELOMERASE REVERSE TRANSCRIPTASE AND DNA CONTENT IN ENDOMETRIAL CARCINOMA

ZHAOWenbo，F(xiàn)AN Aijun，LOU Zhengqing，WANG Yuying
linical Laboratory，Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang Province，Hangzhou 310007，China）

Objective To investigate the value of human telomerase reverse transcriptase（hTRT）and DNA contents in the diagnosis of endometrial carcinoma and to evaluate the relationship between the expression of hTRT and DNA content in endometrial carcinoma.MethodsThe expression of hTRT in 40 cases of endometrial carcinoma，20 cases of endometrial atypical hyperplasia and 8 cases of normal endometrium were detected by in situ hybridization.The DNA contents of the three kinds of tissue were detected by flow cytometry.ResultsThe positive rate of hTRT in endometrial carcinoma（87.5％）was remarkably higher than those in endometrial atypical hyperplasia（40.0％）and normal endometrium（12.5％），respectivel（y P＜0.01）.The difference of DNA index and S-phase fraction among the three groups were significant（P＜0.05）.The aneuploid rate（28/35）of hTRT-positive carcinoma was significantly higher than that（1/5）of hTRT-negative（P＜0.05）.ConclusionFrom normal endometrium to endometrial atypical hyperplasia and endometrial carcinoma，the expression of hTRT and DNA content increased gradually，indicating hTRT positive expression and increased DNA content being closely related to the progress of endometrial carcinoma，both of them played important role in the diagnosis of endometrial carcinoma.

endometrial neoplasms；telomerase；diagnosis

R737.33

A

1007-3205（2013）06-0674-04

2012-10-22；

2013-01-29

趙文波（1974-），男，浙江杭州人，浙江省杭州市中醫(yī)院主管技師，醫(yī)學碩士，從事免疫學檢驗及相關研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.06.020