農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆未成熟子葉節(jié)的遺傳轉(zhuǎn)化

鐘 磊，王林紅，喬亞科，崔姍姍，紀(jì)展波，李桂蘭

(河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院，河北秦皇島，066600)

大豆是公認(rèn)的較難進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的植物之一。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化是最早被開(kāi)發(fā)出來(lái)并且是目前應(yīng)用最廣泛的一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)［1］，該法具有操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉，可插入基因片段大，不容易發(fā)生重排等優(yōu)點(diǎn)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所用的外植體主要有子葉節(jié)［2～6］、無(wú)菌苗的莖尖［7］、未成熟胚子葉［8］、上胚軸和初生葉［9］、子葉［10］、成熟胚的胚尖［11］、未成熟胚體細(xì)胞胚［12］等，而對(duì)利用未成熟大豆種子子葉節(jié)的轉(zhuǎn)化研究報(bào)道則較少。筆者以不同大豆品種的未成熟種子子葉節(jié)為轉(zhuǎn)化受體，研究其遺傳轉(zhuǎn)化影響因素，為提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試大豆品種:冀豆7號(hào)，豫豆22，九農(nóng)26，鄭97196，品系10，品系12。

植物表達(dá)載體:pX6PTF1(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)張彩英研究員提供)［13］。

1.2 方法

1.2.1 外植體的制備 選取開(kāi)花后不同發(fā)育時(shí)期的大豆豆莢，清水沖洗表面，體積分?jǐn)?shù)為0.75的酒精消毒1 min，無(wú)菌水沖洗1次，質(zhì)量濃度為1.0 g/L的氯化汞溶液消毒10 min，無(wú)菌水沖洗3次。無(wú)菌條件下取出未成熟種子，滅菌的液體共培養(yǎng)基(或無(wú)菌蒸餾水)浸泡15 min，去掉種皮，將2片子葉從胚軸縱切，去除幼芽和胚尖。

1.2.2 菌液制備 挑取工程菌的單菌落，接種到鏈霉素、壯觀霉素質(zhì)量濃度為50 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min，28 ℃振蕩培養(yǎng) 2～3 d至OD600=0.6～0.8。隨后吸取OD600=0.6～0.8 菌液，接種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至OD600=0.3～0.5。將菌液5 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清，沉淀重懸于與共培養(yǎng)基成分相同的液體培養(yǎng)基中，調(diào)整菌液濃度至OD600=0.3～0.5，備用。

1.2.3 共培養(yǎng) 將制備好的農(nóng)桿菌菌液侵染外植體30 min，接種到共培養(yǎng)基，24℃恒溫培養(yǎng)4 d。

1.2.4 抗性植株再生 共培養(yǎng)后經(jīng)抗性芽誘導(dǎo)、伸長(zhǎng)、生根、移栽和馴化后獲得抗性植株。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 子葉節(jié)預(yù)處理試驗(yàn) 以冀豆7為材料，對(duì)所取材料分別進(jìn)行如下預(yù)處理:處理1，對(duì)去除莢皮的種子在4℃下處理24 h，切制子葉節(jié);處理2，將豆莢在4℃低溫處理24 h，然后消毒后除去豆莢皮切制子葉節(jié);處理3，取新鮮豆莢直接去莢皮后切制子葉節(jié)。

1.3.2 共培養(yǎng)溫度試驗(yàn) 以開(kāi)花60 d的冀豆7未成熟種子為材料，共培養(yǎng)溫度設(shè)置3個(gè)處理:22，24，26℃。

1.3.3 共培養(yǎng)光照試驗(yàn) 以開(kāi)花60 d的冀豆7未成熟子葉節(jié)為外植體，共培養(yǎng)時(shí)設(shè)置3個(gè)光照長(zhǎng)度處理:0，16，24 h/d。

1.3.4 不同品種試驗(yàn) 以豫豆22，冀豆7號(hào)，鄭97196，九農(nóng)26，品系10和品系12為受體品種，取開(kāi)花60 d的未成熟種子制備子葉節(jié)外植體。

每個(gè)單因素試驗(yàn)中每個(gè)處理切制外植體50個(gè)，3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用DPSv 7.05版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子成熟度對(duì)大豆未成熟子葉節(jié)轉(zhuǎn)化抗性芽誘導(dǎo)的影響

以冀豆7號(hào)為材料，分析開(kāi)花后50，60，67 d未成熟種子子葉節(jié)外植體的芽誘導(dǎo)率發(fā)現(xiàn)，以開(kāi)花后60 d，種子達(dá)到最飽滿程度所制備的外植體抗性芽誘導(dǎo)率和平均抗性芽數(shù)最高，與開(kāi)花后50 d的和開(kāi)花后67 d的差異均達(dá)到極顯著(表1);而開(kāi)花后50 d的未成熟子葉節(jié)經(jīng)誘導(dǎo)后易產(chǎn)生愈傷組織，抗性芽數(shù)量較少;開(kāi)花后67 d的種子由于已經(jīng)開(kāi)始縮水變小，故抗性芽率和平均抗性芽數(shù)出現(xiàn)下降現(xiàn)象。

表1 大豆未成熟種子發(fā)育程度對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響

2.2 外植體低溫預(yù)處理對(duì)大豆未成熟子葉節(jié)轉(zhuǎn)化抗性芽誘導(dǎo)的影響

分析3種外植體預(yù)處理方法對(duì)抗性芽誘導(dǎo)率的影響發(fā)現(xiàn)，以不經(jīng)過(guò)預(yù)處理的新鮮材料抗性芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)到55.9%，與其他2個(gè)處理差異顯著(p＜0.01);而經(jīng)過(guò)4℃低溫預(yù)處理24 h的抗性芽誘導(dǎo)率較低，二者差異不顯著(p＞0.05)。說(shuō)明24 h的4℃低溫處理對(duì)未成熟種子的子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化不利(圖1)。

2.3 共培養(yǎng)溫度對(duì)大豆未成熟子葉節(jié)轉(zhuǎn)化抗性芽誘導(dǎo)的影響

分析不同共培養(yǎng)溫度條件下的抗性芽誘導(dǎo)率發(fā)現(xiàn)，在一定溫度范圍內(nèi)，隨共培養(yǎng)溫度的上升，未成熟子葉節(jié)的平均出芽數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在3個(gè)處理溫度中，以26℃條件下的未成熟胚的平均抗性芽個(gè)數(shù)最高(圖2)。但是3個(gè)溫度處理之間差異不顯著。

圖1 不同預(yù)處理對(duì)大豆未成熟種子遺傳轉(zhuǎn)化的影響

圖2 共培養(yǎng)溫度對(duì)大豆未成熟子葉節(jié)出芽的影響

2.4 共培養(yǎng)階段光照對(duì)大豆未成熟子葉節(jié)轉(zhuǎn)化抗性芽誘導(dǎo)的影響

分析不同光照時(shí)間對(duì)大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化抗性芽誘導(dǎo)的影響表明，在共培養(yǎng)階段提供一定時(shí)間的光照對(duì)大豆未成熟子葉節(jié)轉(zhuǎn)化有促進(jìn)作用(表2)。光照處理的大豆子葉節(jié)共培養(yǎng)后顏色變成深綠色，其抗性芽出芽率和平均出芽數(shù)都有所提高。提供光照24 h/d的處理，子葉節(jié)抗性芽誘導(dǎo)率最高，為56.64%，平均出芽數(shù)也達(dá)到2.27個(gè)，并與其他2個(gè)處理差異顯著。

表2 共培養(yǎng)階段光照時(shí)間對(duì)大豆未成熟子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化的影響

2.5 大豆基因型對(duì)未成熟子葉轉(zhuǎn)化抗性芽誘導(dǎo)的影響

分析不同品種抗性芽誘導(dǎo)率發(fā)現(xiàn)，以冀豆7號(hào)，豫豆22和品系12的每個(gè)外植體的平均抗性芽數(shù)較高，達(dá)到2.11～2.18，3個(gè)品種之間差異不顯著;冀豆7號(hào)，豫豆22和品系12均與九農(nóng)26，鄭97196，品系10之間差異達(dá)到顯著水平(p＜0.05)(圖3)。九農(nóng)26不僅出芽率低，而且易出現(xiàn)畸形芽，成苗率最低。

圖3 不同大豆品種未成熟種子子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化比較

3 結(jié)論與討論

在遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中抗性芽形成是獲得轉(zhuǎn)基因苗的前提。王盧平等［14］研究表明，當(dāng)豆莢及種子發(fā)育到最大、鼓粒飽滿、種皮變黃時(shí)，未成熟種子子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)率最高。本研究在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系中也得到一致的結(jié)果，以豆莢和種子體積發(fā)育到最大(開(kāi)花后60～66 d)，豆莢開(kāi)始由綠色變黃時(shí)，未成熟子葉節(jié)的抗性芽率和平均抗性芽值都達(dá)到最高。

轉(zhuǎn)化過(guò)程中共培養(yǎng)階段的外部環(huán)境條件直接影響著農(nóng)桿菌的侵染及T-DNA的轉(zhuǎn)移，同時(shí)也影響著受體細(xì)胞的感受狀態(tài)。本研究表明，從大豆植株上取的新鮮豆莢直接制備外植體，不經(jīng)過(guò)預(yù)處理，產(chǎn)生的抗性芽數(shù)最多;轉(zhuǎn)化過(guò)程中，在26℃，24 h/d光照共培養(yǎng)條件下獲得較高的抗性芽產(chǎn)生率。已有研究表明，在大豆成熟種子的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，不同大豆基因型對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性存在著差異［15］。在本研究中，未成熟大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化也存在著基因型差異，冀豆7，豫豆22和品系12的未成熟子葉抗性芽率較高。

大豆未成熟種子子葉節(jié)作為遺傳轉(zhuǎn)化外植體，具有取材方便、簡(jiǎn)化遺傳轉(zhuǎn)化外植體制備過(guò)程的優(yōu)點(diǎn)，本研究?jī)H就部分影響因素進(jìn)行了初步探討，建立一個(gè)完善的大豆未成熟子葉節(jié)轉(zhuǎn)化體系尚需進(jìn)行深入研究。

［1］ HINCHEE M A W，CONNOR-WARD D V，NEWELL C A，et al.Production of transgenic soybean plants usingAgrobacterium-mediated DNA transfer［J］.Bio/Technology，1988，6:915-922.

［2］ 劉博林，徐民新.兩個(gè)栽培大豆品種的體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生研究［J］.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，1999，21(2):11-13.

［3］ CHENG T Y，SAKA H V.Plant regeneration from soybean cotyledon node segments in cultures［J］.Plant Science Letters，1980，19:91-99.

［4］ ZHANG Z Y，XIANG A Q，STASWICK Q.The use of glufosinate-arm-monium as a selective agent inAgrobacterium-mediated transformation of soybean［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1999，56:37-46.

［5］ YAMADA T，WATANABE S，ARAI M，et al.Cotyleonary node prewounding with a micro-brush increased frequency ofAgrobacterium-mediated transformation in soybean［J］.Plant Biotechnology，2010，27:217-220.

［6］ PAZ M M，MARTINEZ J C，KALVIG A B，et al.Improved cotyledonary node method using an alterntive explants derived from mature seed for efficient Agrobacterium mediated soybean transformation［J］.Plant Cell Reports，2006，25:206-213.

［7］ KARTHA K K，K Pahl，N L Leung，et al.Plant regeneration from meristems of grain legumes:soybean，cowpean，peanut，chickpea and bean［J］.Can J Bot，1981，59:1 671-1 679.

［8］ BARWALE U B，KEMS H R，WIDHOLM J M.Plant regenerating from callus cultures of several soybean genotypes via embryogensis and organogenesis［J］.Planta，1986，167:473-481.

［9］ WRIGHT M S，WARD D V，HINCHEE M A，et al.Regeneration of soybean(Glycine maxL.Merr)from cultured primary leaf tissue［J］.Plant cell Reports，1987，6:83-89.

［10］ SETH M，RALPH S，JOHN C.A simple rapid protocol for adventitious shoot development from mature cotyledons of(Glycine max)cv Bragg［J］.In Vitro Cellular and Devepmental Biology，1989，25(4):385-388.

［11］ LIU Hai-kun，YANG Chao，WEI Zhi-ming.EfficientAgrobacterium tumefaciens-mediated transformation of soybeans using an embryonic tip regeneration system［J］.Planta，2004，219:1 042-1 049.

［12］ KO T S，LEE S，F(xiàn)ARRAND S K，et al.A partially disarmed vir helper plasmid，pKYRT1，in conjunction with 2，4-dichlorophenoxyacetic acid promotes emergence of regenerable transgenic somatic embryos from immature cotyledons of soybean［J］.Planta，2004，218:536-541.

［13］ 鄭醒，張彩英，常文鎖，等.轉(zhuǎn)錄因子GmPTF1表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化大豆研究［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2011，26(6):27-31.

［14］ 王盧平，喬亞科，李桂蘭，等.大豆未成熟種子子葉節(jié)不定芽再生的初步研究［J］.大豆科學(xué)，2011，30(3):369-373.

［15］ 姬月梅，張銀霞，宋曉華.農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展［J］.農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，2009，30(1):47-50.

(責(zé)任編輯:朱寶昌)