左氧氟沙星熱敏性凝膠制備及局部治療大鼠化膿性中耳炎的研究△

李聰 程雪峰 顧健 敖華飛 王勤

·基礎研究·

左氧氟沙星熱敏性凝膠制備及局部治療大鼠化膿性中耳炎的研究△

李聰 程雪峰 顧健 敖華飛 王勤

目的評價左氧氟沙星熱敏性凝膠對大鼠化膿性中耳炎的治療效果。方法采用冷凝法制備以泊洛沙姆407為基質的左氧氟沙星熱敏性凝膠；采用經鼓膜注入金黃色葡萄球菌的方法建立大鼠化膿性中耳炎模型；將誘導化膿性中耳炎成功的模型動物隨機分為4組：生理鹽水組（A組）、左氧氟沙星溶液組（B組）、泊洛沙姆407組（C組）、左氧氟沙星熱敏性凝膠組（D組），各組分別在用藥后的3、7、10、14 d于顯微鏡下觀察鼓膜情況。結果治療初期B組和D組無明顯差別，用藥后14 d顯微鏡下D組局部炎癥明顯輕于B組，并在觀察期間沒有出現(xiàn)反復。結論左氧氟沙星熱敏性凝膠對化膿性中耳炎的治療有效，可作為治療化膿性中耳炎的新劑型做進一步的研究。（中國眼耳鼻喉科雜志，2013，13：372-375）

左氧氟沙星；熱敏性凝膠；化膿性中耳炎；局部治療

化膿性中耳炎是耳鼻咽喉科常見疾病，其病理改變主要是中耳鼓室黏膜化膿性炎癥，主要的治療方式是抗菌藥物的使用。左氧氟沙星是一種廣譜、高效的喹諾酮類抗菌藥；泊洛沙姆407（poloxamer407，P407）是研究、應用最為廣泛的一種熱敏性凝膠，具有低溫時為液體，溫度升高時轉變?yōu)槟z的反向熱敏凝膠特性。這樣便可以液體形式給藥，藥液在中耳內立刻轉變成凝膠，能夠達到延長藥物在中耳內的滯留時間，提高藥物生物利用度的效果。我們前期研究了以P407為基質制備的左氧氟沙星凝膠，并對其體外釋放性能進行了檢測，得出該熱敏性凝膠具有較好的控釋性能［1］。故本研究將該熱敏性凝膠應用于體內，觀察其治療效果，以期使之成為治療中耳炎的理想制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠32只，體質量220～250 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司［SCXK（滬）2008-0016］，合格證編號：2008001618815，無噪聲暴露和藥物使用史，耳廓反射靈敏，電子耳鏡檢查外耳道、鼓膜均無異常，術前均進行聽性腦干反應（ABR）、聲導抗結果均在正常范圍內。

1.1.2 試劑及儀器設備 左氧氟沙星（上?？笊镉邢薰荆?；P407（商品名為普朗尼克F127，平均相對分子質量：11 500，上?？笊镉邢薰荆?；左氧氟沙星對照品（中國藥品生物制品檢定所）；其他試劑均為分析純。1×108/L金黃色葡萄球菌液（上海交通大學醫(yī)學院附屬第三人民醫(yī)院檢驗科）。儀器設備MD100-1電子天平（上海天平儀器廠），88-I型定時恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司），電子耳鏡（湛江市聆聽聽力儀器中心）。

1.2 方法

1.2.1 左氧氟沙星熱敏性凝膠的制備 參照本實驗組已報道的冷溶法制備左氧氟沙星熱敏性凝膠，用注射用水配成濃度為17％的P407溶液，然后加入左氧氟沙星，使溶液中的左氧氟沙星濃度為3 mg/mL；磁力攪拌器攪拌均勻，置于4℃左右冰箱冷藏溶脹24 h，使凝膠充分溶脹，分散均勻，得澄清溶液。

1.2.2 化膿性中耳炎模型的建立及評估 SD大鼠用戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉后，用安爾碘消毒術耳及外耳道皮膚，采用1mL無菌注射器抽取1×108/L金黃色葡萄球菌液0.1 mL，在手術顯微鏡直視下于鼓膜前下方緩慢注入SD大鼠左側中耳腔內，作為實驗耳，對側右耳作為對照耳，經鼓膜注入等量（0.1 mL）的生理鹽水。隔3 d在無菌條件下沿前次注射孔再次注射，共連續(xù)注射3次。在清潔安靜的飼養(yǎng)條件下喂養(yǎng)，觀察期間未給SD大鼠進行任何治療。造模后第1、2、3周分別在顯微鏡下觀察鼓膜形態(tài)的變化。

1.2.3 分組與干預 在造模后第3周，將32只已經造模成功的SD大鼠按照隨機原則分為4組。A組：生理鹽水組；B組：左氧氟沙星溶液組（3 mg/mL）；C組：含17％P407組；D組：左氧氟沙星熱敏性凝膠組。用藥方式為顯微鏡下經鼓膜一次性直接注射0.1 mL至鼓室內。各組SD大鼠分別在用藥當天及用藥后3、7、10、14 d分別在顯微鏡下觀察鼓膜形態(tài)的變化。

1.2.4 光鏡下觀察局部病理變化 用藥后的第7天在D組隨機選取1只SD大鼠，用戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉后，經鼓膜注入10％甲醛溶液0.05 mL，快速斷頭處死，將顳骨完整取下，于10％甲醛溶液固定12 h，10％中性乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脫鈣常規(guī)石蠟包埋。所有的顳骨切片均為與蝸軸平行的水平做以4μm層厚切片，取與蝸軸對應的中耳腔黏膜區(qū)域作為觀察區(qū)域，行常規(guī)蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色。

2 結果

2.1 左氧氟沙星熱敏性凝膠的基本性質 本實驗制備的凝膠在常溫下成液體狀態(tài)，在接近人體中耳內溫度34℃時形成凝膠。

2.2 動物模型構建結果 對照耳各時間段鼓膜均未見明顯異常。實驗耳在注入金黃色葡萄球菌液后1周時均出現(xiàn)急性中耳炎，鼓膜廣泛充血、膨隆，透過鼓膜可見鼓室內有滲液。2周左右時有23只實驗耳鼓膜膨隆向外，呈半球形泡，表面充血明顯；8只實驗耳的鼓膜充血減輕，鼓室內有少量滲液滲出。3周后（圖1A）有21只實驗耳鼓膜穿孔，鼓室內可見大量黃色黏稠膿性分泌物；10只實驗耳鼓膜明顯增厚，呈黃色化膿樣改變。

2.3 藥物治療效果 由于構建模型時1只SD大鼠因麻醉過量致窒息死亡，所以最后納入藥物干預實驗的SD大鼠實際數(shù)量為31只。將31只大鼠隨機進行分組，A組7只、B組8只、C組8只、D組8只。

藥物注射后A、B、C、D各組對照耳各時間段鼓膜均未見明顯異常。藥物注射后A組、C組的大鼠實驗耳炎癥程度未得到控制，進一步惡化，黃色黏稠膿性分泌物增加，部分鼓膜未穿孔的實驗耳出現(xiàn)了鼓膜穿孔。藥物注射后第3天B組、D組的大鼠實驗耳炎癥程度都得到了一定的控制，黃色黏稠膿性分泌物減少，兩者差異不明顯。藥物注射后第7天B組大鼠實驗耳炎癥程度出現(xiàn)了反復，再次惡化，黃色黏稠膿性分泌物增加，鼓膜充血加重；藥物注射后第14天時大鼠實驗耳的炎癥程度均較重，與A組、C組大鼠實驗耳無明顯差異。而從藥物注射后第7天開始，D組大鼠實驗耳的炎癥程度進一步得到了控制，黃色黏稠膿性分泌物進一步減少，鼓膜充血減輕；至藥物注射后第14天大鼠實驗耳與其對照耳對比，炎癥程度基本消退。治療期間未出現(xiàn)炎癥反復（表1、圖1）。

2.4 鼓室黏膜病理學變化 在藥物注射后第7天隨機選取1只大鼠，其耳鏡下黏膜炎癥程度為+。組織標本切片顯示：大鼠對照耳（圖2A）鼓室內側壁黏膜呈單層扁平上皮，上皮下間隙菲薄，近咽鼓管口處及咽鼓管內為纖毛柱狀上皮，纖毛上皮細胞之間有少量的杯狀細胞，纖毛排列整齊規(guī)則，上皮下間隙明顯厚于鼓岬，其中可見成纖維細胞，有時可見少量的單核細胞。實驗耳（圖2B）鼓室內側壁上皮稍腫脹，上皮下間隙內有大量殘留滲出的炎癥細胞，以多形核中性粒細胞為主；可見大量的凝膠狀空泡，空泡將炎癥細胞包裹、消化，使炎癥局限化。即該實驗耳黏膜病理的炎癥程度與耳鏡下觀察的一致。

表1 各組實驗耳的炎癥程度

圖1. 用藥后第7天各組耳鏡下所見 A：生理鹽水組，鼓膜化膿清晰可見，還有部分穿孔；B：左氧氟沙星溶液組，鼓膜充血，可見黃色化膿灶；C：P407組，鼓膜已穿孔，周圍充血仍存在；D：左氧氟沙星熱敏性凝膠組，殘留鼓膜穿孔，但鼓膜干凈，未見化膿灶

圖2. D組病理切片 A：對照耳；B：實驗耳

3 討論

化膿性中耳炎［2］目前的主要治療方式［3］為全身和局部應用抗菌藥物：全身應用抗菌藥物，缺點是藥物達到患處需要一定的時間，而且局部藥物濃度較低，故需要的治療周期較長，對機體其他組織系統(tǒng)的影響較大；傳統(tǒng)局部應用抗菌藥物，如滴耳液，雖然克服了全身用藥對其他組織系統(tǒng)的影響，提高了患處局部藥物濃度，但是由于中耳的解剖結構特點，藥物很容易從穿刺孔和咽鼓管中流出，造成藥物在局部的作用濃度不恒定、作用時間短。雖然增加用藥次數(shù)可一定程度上維持局部藥物濃度，但也給患者使用帶來不便。

化膿性中耳炎是由于細菌如鏈球菌、葡萄球菌和肺炎鏈球菌等通過鼻咽管侵入中耳腔后感染，引起的中耳鼓室黏膜化膿性炎癥。其病理改變主要局限在中耳鼓室內，故我們認為主要的治療方式是局部抗菌藥物的使用。但傳統(tǒng)用藥很難使抗菌藥物在局部保持較長的作用時間，因此如何保持抗菌藥物在局部的長時間、有效濃度范圍的作用一直是研究化膿性中耳炎治療的關鍵。我們認為理想中的制劑應當滿足2個條件：①較好的緩釋性，能長期釋藥；②局部藥物濃度恒定，作用時間長，在鼓室內能夠長時間滯留。故我們結合當前藥劑學研究進展，將熱敏性凝膠應用于耳用局部藥物的制備。

大鼠聽泡的解剖及黏膜結構于人中耳鼓室結構非常相似，是研究中耳很好的動物模型。動物模型［4］的建立，為深入研究化膿性中耳炎的病理變化及治療方法提供了客觀依據(jù)。由于動物的愈合能力和抗感染能力亦較人類強，單次注射引發(fā)的中耳炎常可自愈，且痊愈期很短，影響了動物模型的建立。同時在閱讀大量文獻［5-8］的基礎上，以及結合臨床中化膿性中耳炎分泌物的細菌培養(yǎng)結果，顯示革蘭陰性桿菌的致病率最高。另外常見的菌種有：金黃色葡萄球菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌（綠膿桿菌）等。雖然致病菌具有一定的地區(qū)差異性，但金黃色葡萄球菌是化膿性中耳炎的常見致病菌。因此本實驗就通過反復注射金黃色葡萄球菌，造成局部感染遷延不愈，評估該方法建立的化膿性中耳炎模型，顯示出模型穩(wěn)定、成功率高、操作簡單等優(yōu)點。這為進一步研究化膿性中耳炎的治療方法奠定了基礎。

熱敏性凝膠是一種環(huán)境敏感性凝膠，選用其中的P407作為左氧氟沙星熱敏性耳用凝膠的基質，因其具有較好的表面活性及良好的安全性［9］。另外，相關研究［10-12］表明它還具有較好的控釋性、足夠的藥物攜帶量、良好的耐受性、易生物降解等優(yōu)點。前期我們的體外實驗研究也得出其具有較好的控釋性，在本次體內實驗中，與B組相比更加驗證了這一點，與體外實驗相吻合。另外，本次實驗中，在D組右側對照耳的基礎上，我們增加了P407對照組，即C組，結果不僅說明了制備的左氧氟沙星熱敏性凝膠具有一定的安全性，也進一步說明了P407具有一定的安全性，對局部的炎癥無影響。

本實驗中，我們成功制備了載藥量大和具有較好緩釋性的左氧氟沙星熱敏性凝膠，并將其用于SD大鼠化膿性中耳炎的治療。用藥后第3天時，B組和D組對局部化膿性炎癥的療效并無差別，但隨著局部藥物濃度的改變，從用藥后第7天開始，B組的炎癥程度沒有再下降，到第10天時，甚至有進一步加重的趨勢，與D組相比具有顯著的差異性。而D組實驗耳的炎癥程度沒有反復，一直是趨于好轉的狀態(tài)。所以，可以認為左氧氟沙星熱敏性凝膠的局部抗炎效果優(yōu)于傳統(tǒng)的左氧氟沙星溶液。由于實驗條件有限，實驗僅針對近期療效進行觀察評定，對于更長時間內，左氧氟沙星熱敏性凝膠用于控制SD大鼠局部炎癥是否會發(fā)生反復尚未知，還需在進一步研究中闡述。

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Preparation of levofloxacin thermosensitive gel and local treatment of suppurative otitismedia in rats

LICong，CHENGXue-feng，GU Jian，AO Hua-fei，WANGQin.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery，the Third People′s Hospital of Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 201900，China

WANG Qin，Email：cherry-cream＠hotmail.com

Objective To evaluate the therapeutic effects of levofloxacin thermosensitive gel on suppurative otitis media in rats.Methods Levofloxacin thermosensitive gel of poloxamer 407 as the matrix was prepared by the condensationmethod.Suppurative otitismedia model was established by injecting staphylococcus aureus into tympanic membrane.Thenmodels were randomly divided into four groups：the normal saline group（A），levofloxacin solution group（B），poloxamer 407 group（C）and levofloxacin thermosensitive gel group（D）.The tympanic membranes were observed under microscope after treatment for 3，7，10 and 14 days respectively.Results There was no significant difference in early treatment between group B and group D，but the degree of local inflammation of group D was significantly lighter than that of group B and had no repetition during the observation period.Conclusions Levofloxacin thermosensitive gel was effective for suppurative otitismedia suggesting that it can be used as a new form for treating suppurative otitismedia.（Chin JOphthalmol and Otorhinolaryngol，2013，13：372-375）

Levofloxacin；Thermosensitive gel；Suppurative otitismedia；Local treatment

2013-03-08）

（本文編輯 楊美琴）

上海交通大學醫(yī)學院附屬第三人民醫(yī)院院基金項目（syz2010-07）

上海交通大學醫(yī)學院附屬第三人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科 上海 201900

王勤（Email：cherry-cream＠hotmail.com）

試題6.答案：與PVR形成有密切關系的是過度冷凝、電凝、多發(fā)視網膜裂孔、巨大視網膜裂孔、眼內炎癥、多次眼內手術、眼外傷、長期孔源性視網膜脫離等。

試題7.答案：D。Behcet病好發(fā)于日本、中國、土耳其、伊朗、科威特等中東和地中海沿岸國家。