鈣結(jié)合蛋白在C57BL/6小鼠內(nèi)耳細胞發(fā)育過程中的表達特點△

田亮 馬銳 羅文偉 韓朝 李雯

·基礎(chǔ)研究·

鈣結(jié)合蛋白在C57BL/6小鼠內(nèi)耳細胞發(fā)育過程中的表達特點△

田亮 馬銳 羅文偉 韓朝 李雯＊

目的探討在小鼠內(nèi)耳發(fā)育過程中，鈣結(jié)合蛋白（CB）在內(nèi)耳耳蝸內(nèi)的表達是否存在時限性。方法獲取C57BL/6小鼠E8開始至出生后一直到成年的內(nèi)耳標本：E8，E9，E10，E12，E14，E15-E21，D1-D21，成年，進行冷凍切片，進行CB的熒光免疫組織化學染色并觀察其在內(nèi)耳表達的變化情況。結(jié)果在C57BL/6小鼠，除了在E16可辨認出螺旋神經(jīng)元有CB部分表達外，以后直到成年都沒有CB的染色表達，而在Scarpa神經(jīng)元則從E8開始就有表達，其從E19開始先在內(nèi)毛細胞開始有表達，逐漸在內(nèi)外毛細胞都有表達，直到成年時表達消失。結(jié)論CB在C57BL/6小鼠內(nèi)耳耳蝸的表達具有時限性，因而可推測出對CB行免疫組織化學染色觀察能有效鑒別C57BL/6小鼠及其他動物的再生毛細胞和原有毛細胞，但目前尚無法解釋CB一些表達特點的相應(yīng)機制。（中國眼耳鼻喉科雜志，2013，13：368-371）

鈣結(jié)合蛋白；C57BL/6鼠；內(nèi)耳；胚胎發(fā)育；免疫組織化學

目前的研究［1］顯示，人類耳蝸聽毛細胞和螺旋神經(jīng)元損害后不能再生，這點不同于低等哺乳動物和鳥類［2］。但是，研究者們［3］一直嘗試通過各種途徑實現(xiàn)毛細胞再生。目前發(fā)現(xiàn)：MATH1基因?qū)γ毎脑偕浅Ｖ匾?，過度表達MATH1可在體外誘導(dǎo)支持細胞轉(zhuǎn)化為毛細胞。但是由于尚沒有區(qū)分再生毛細胞和原有毛細胞的特異性標記物，使實驗結(jié)果缺乏說服力。鈣結(jié)合蛋白（calbindin，CB）是細胞內(nèi)鈣離子結(jié)合蛋白大家族中的一員。鈣離子結(jié)合蛋白可能有調(diào)節(jié)多種神經(jīng)元功能的作用，包括細胞的生長和分化、細胞骨架的組合、酶的活性、細胞膜的興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等重要作用［4］。已有研究［4］證實，在牛蛙中，可以用CB區(qū)分再生的毛細胞。本文通過觀察C57BL/6小鼠內(nèi)耳發(fā)育過程中CB的表達變化特點，旨在進一步了解CB在其中可能發(fā)揮的作用，探討其是否可用來鑒別C57BL/6小鼠的新生毛細胞。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)備和儀器 Leica DMR顯微鏡（熒光/白光），Leica DFC 300 FX圖像采集系統(tǒng)，Leica Qwin V3圖像處理系統(tǒng)，Leica DMIRE2共聚焦熒光顯微鏡，Leica CM3050S冷凍切片機（Leica Microsystems，瑞士）。抗Calbindin小鼠單克隆抗體（ab9481購于英國abcam公司）。Adobe Photoshop 7.0.1圖像處理軟件。

1.2 孕鼠和新生鼠天數(shù)的計算方法 所有動物實驗操作均遵守復(fù)旦大學動物管理委員會關(guān)于動物實驗的相關(guān)規(guī)定。選用C57BL/6種鼠60對（由復(fù)旦大學上海醫(yī)學院實驗動物科學部提供），將種鼠雌雄同窩，次日分開，當日下午2～3點記做E1，依次類推從第8天E8開始選取體重變化明顯的取胚胎。出生（一般都是晚間生）后第1天，postnatal day1簡稱PND1=D1，以后依次類推D2，D3......D16；斷奶后1天計為d22；成年鼠（孕鼠）記做Da。

1.3 胚胎和新生鼠耳蝸的處理方法 孕鼠經(jīng)腹腔注入過量的氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉后，剖腹迅速取出子宮，將胚囊剝離出，浸入冰冷的4％多聚甲醛溶液中，浸泡2 h后；在冰冷的4％多聚甲醛中將胚胎剝離出，復(fù)浸入4％多聚甲醛溶液中，4℃冰箱放置2 h后；浸入15％的蔗糖溶液中，在4℃冰箱放置1 h，更換30％的蔗糖溶液4℃過夜；然后浸入最佳切削溫度（optimal cutting temperature，OCT）包埋劑置4℃冰箱放置2 h。最后將胚胎按照垂直立位擺放在冷凍切片托盤上，用OCT固定。切成10μm薄的冷凍切片放入-20℃冰箱備用，多余的胚胎轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。對于E14，E15切取頭部進行上述處理，E16以后的胚胎將顳骨取出固定，并將耳蝸剝離出來作冷凍切片。新生鼠斷頭處死，迅速將顳骨取出，去掉腦組織和皮膚后浸入冰冷的4％多聚甲醛溶液中；然后在冰冷的4％多聚甲醛溶液中將耳蝸完整剝離出來，復(fù)浸入4％多聚甲醛中在4℃冰箱放置4 h后；根據(jù)天數(shù)的不同使用10％的EDTA脫鈣0～36 h，以后步驟同胚胎（取子宮后的孕鼠斷頭后同新生鼠處理）。

1.4 Cabindin免疫組織化學染色步驟 載有標本的冷凍切片常溫干燥2 h，磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）浸泡10 min；然后使用10％山羊血清孵育20 min，抗CB小鼠單克隆抗體（1∶500）37℃孵育1 h，PBS 5 min沖洗3次；二抗抗小鼠FITC（1∶200）37℃孵育1 h（以后步驟需要避光進行），PBS 5 min沖洗3次，最后用50％甘油和指甲油封片（4℃冰箱內(nèi)避光保存）。

2 結(jié)果

E8～E16沒有表達。E18螺旋器原基將發(fā)育為內(nèi)毛細胞的細胞有表達，螺旋器下小管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，沿管壁表達強（圖1）。Kollicker器從頂部到底部表達由強到弱的趨勢明顯，蝸軸有零星細胞表達，螺旋韌帶、血管紋都有表達。E19表達CB的內(nèi)毛細胞清晰可見，Kollicker器的細胞靠近螺旋緣處表達強烈，可以清楚地看出Kollicker器的輪廓。在小上皮嵴與螺旋器之間有一個細胞表達非常清楚。血管紋處外圍有零星細胞表達，蝸軸可見纖維絲（圖2）。E21表達與E19相似，但是原來在小上皮嵴與螺旋器間表達的細胞未再表達，而是在基底膜下方相對的位置出現(xiàn)了表達的細胞。

圖1. E18鼠耳蝸底圈冷凍切片后染色綠色熒光為CB陽性表達，可見螺旋器原基將發(fā)育為內(nèi)毛細胞的細胞有表達，螺旋器下小管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，沿管壁表達強

圖2. E19鼠耳蝸底圈冷凍切片染色綠色熒光為CB陽性表達，Kollicker器的細胞靠近螺旋緣處CB表達強烈，可以清楚地看出Kollicker器的輪廓

D1 Kolliker器細胞表達減弱，蓋膜表達增強。螺旋器外毛細胞下小管結(jié)構(gòu)表達強烈，此時3排外毛細胞也開始出現(xiàn)較明顯表達（圖3），Scarpa神經(jīng)元胞質(zhì)表達（圖4）。D2蓋膜表達消失，但蓋膜中1/3處下方有表達積聚現(xiàn)象。內(nèi)外毛細胞同等強度表達，外毛細胞輪廓清晰可見，螺旋器下小管結(jié)構(gòu)位于螺旋器隧道下方，腔隙邊緣表達，血管紋有小腔隙強烈表達。D3蓋膜無表達，但蓋膜中部下方區(qū)域表達強烈。血管紋和內(nèi)外毛細胞表達同前。螺旋器下小管結(jié)構(gòu)表達減弱。D4蓋膜無表達，Kollicker器中部表達強烈，范圍擴大到內(nèi)螺旋溝底部，并且出現(xiàn)內(nèi)螺旋溝開始形成的現(xiàn)象。內(nèi)外毛細胞表達強烈，螺旋器下小管結(jié)構(gòu)無表達，血管紋表達同前。螺旋神經(jīng)元無表達，Scarpa神經(jīng)元仍表達。D5蓋膜下表達范圍同前，但是Kollicker器組織進一步縮小，蓋膜開始抬起。螺旋器下小管結(jié)構(gòu)擴大，但沒有表達。內(nèi)外毛細胞表達清晰，血管紋同前，螺旋神經(jīng)元無表達。D6同前，但是螺旋器下小管結(jié)構(gòu)有表達。D7蓋膜結(jié)構(gòu)清晰可見，螺旋緣骨質(zhì)部分表達強烈，其余表達同前。D8蓋膜幾乎完全抬起，Kollicker器進一步萎縮，Scarpa神經(jīng)元有表達。蓋膜上表面開始有表達，前庭膜開始與蓋膜分離，余同前。D10蓋膜成熟，前庭膜接近與蓋膜完全脫離，余表達同前。

圖3. D1鼠耳蝸冷凍切片染色綠色熒光為CB陽性表達，較E19相比Kolliker器細胞表達CB減弱，蓋膜表達增強。外毛細胞下小管結(jié)構(gòu)表達強烈，外毛細胞表達也很明顯

圖4. D1鼠耳蝸冷凍切片染色綠色熒光為CB陽性表達，可見CB在Scarpa神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)有表達

D12螺旋器的各種結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)育成熟，螺旋器下小管結(jié)構(gòu)縮小，有表達，血管紋表達減少，內(nèi)外毛細胞強烈表達。前庭膜無表達，蓋膜無表達。螺旋神經(jīng)元間隙少量表達（圖5）。D14同D12，Scarpa仍表達，螺旋神經(jīng)元間隙少量表達。D16同D14，但內(nèi)外毛細胞表達開始減弱，螺旋器下小管結(jié)構(gòu)管腔消失、表達減弱，血管紋表達減弱。D22螺旋器下小管消失，遺留一小結(jié)節(jié)。余同D16，但都進一步表達減弱，外毛細胞減弱比內(nèi)毛細胞明顯，Scarpa神經(jīng)元仍有部分表達。Da內(nèi)外毛細胞無表達，僅血管紋有表達，骨螺旋板無表達（圖6）。

圖5. D12鼠耳蝸頂圈冷凍切片染色綠色熒光為CB陽性表達，此時螺旋器基本發(fā)育成熟，螺旋器下小管結(jié)構(gòu)縮小，有表達，內(nèi)外毛細胞強烈表達。前庭膜無表達，蓋膜無表達。螺旋神經(jīng)元間隙少量表達

圖6. Da鼠耳蝸頂圈冷凍切片染色綠色熒光為CB陽性表達，此時內(nèi)外毛細胞均無表達，僅血管紋有表達，骨螺旋板無表達

3 討論

CB是細胞內(nèi)Ca2+結(jié)合蛋白大家族中的一員。包含EF Ca2+結(jié)合域，與鈣調(diào)蛋白和肌鈣蛋白C有關(guān)［5］。CB首先在雞的小腸中檢測到［6］，后在哺乳動物中也發(fā)現(xiàn)其在小腸、腎、子宮、胎盤［7］以及內(nèi)耳細胞中有表達［8］。對哺乳動物的耳蝸進行的研究很多，有豚鼠、猴子、小鼠、大鼠、沙鼠、人、狗和鹿［9］，是耳蝸內(nèi)研究最多的CB之一［10］，但是各種動物之間表達存在明顯的差別。CB在絨猴中主要表達在II型神經(jīng)元中，而在人類的胚胎螺旋神經(jīng)元中CB在I型螺旋神經(jīng)元細胞表達［10］。在成年狗耳蝸，CB在內(nèi)外毛細胞的靜纖毛、表皮板和胞質(zhì)內(nèi)有表達［9］。在成年Wistar大鼠耳蝸中的螺旋神經(jīng)元沒有 CB的表達［11］。本研究發(fā)現(xiàn)在C57BL/6小鼠除了在E16可以辨認出螺旋神經(jīng)元有部分表達外，以后直到成年都沒有CB的染色表達，而在Scarpa神經(jīng)元則從開始就有表達。在豚鼠和沙鼠中CB的表達位于內(nèi)外毛細胞［12］。而在C57BL/6小鼠，從E19開始先在內(nèi)毛細胞有表達，逐漸在內(nèi)外細胞都有表達，到成年時表達消失。曾有研究者［13］發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移，鼠的聽覺中樞系統(tǒng)中CB的表達也會出現(xiàn)類似的急劇下降。這種表達的差異性，可能是由于在不同物種中所發(fā)揮的作用不同所造成的。CB蛋白的作用可能有：①作為Ca2+的緩沖，幫助細胞從各種原因?qū)е碌拟}離子過載中存活下來。神經(jīng)元對凋亡的敏感性似乎與CB的表達水平呈反比。CB的過表達抑制了培養(yǎng)中表達presenilin-1突變基因的神經(jīng)元細胞凋亡；②CB抑制凋亡的特性不只是Ca2+緩沖器的結(jié)果，還可能是這種蛋白有抑制caspase-3活性的能力，這種能力不同于CB結(jié)合鈣離子的特性，而是不依賴Ca2+的作用機制［5］，通過等溫滴定熱量測定分析的方法已發(fā)現(xiàn)在空間構(gòu)象上Calbindin-D28K可以與caspase-3緊密結(jié)合，也許是其抗凋亡的一種重要方式［14］；③CB可能有調(diào)節(jié)多種神經(jīng)元功能的作用，包括細胞的生長和分化、細胞骨架的組合、調(diào)節(jié)酶的活性、調(diào)節(jié)細胞膜的興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放［4］。上述3種可能的作用可以來解釋CB在C57BL/6小鼠中的表達，尤其對毛細胞內(nèi)表達更為完善。毛細胞從祖細胞分化而來，涉及細胞的分化，分化為毛細胞后開始進行細胞骨架的組合等變化。目前已發(fā)現(xiàn)通過外界給聲刺激可以在雞胚發(fā)現(xiàn)CB蛋白陽性表達明顯增加，提示其CB可能介入鳥類動物聲損傷后的毛細胞自我修復(fù)功能機制［15］。而CB在新生毛細胞或未成熟毛細胞中表達的特點同樣存在于牛蛙的前庭毛細胞中，且在牛蛙中可用來區(qū)分再生的毛細胞［4］。從本實驗中觀察到的CB在毛細胞中表達的特點，推測可在C57BL/6小鼠中用以鑒別再生的毛細胞與原有的毛細胞。但是在螺旋神經(jīng)元中為什么E16之后就沒有表達了，而在Scarpa神經(jīng)元中反而持續(xù)表達，需要進一步研究。

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Expression characteristics of Calbindin during the inner ear development of C57BL/6m ice

TIAN Liang，MARui，LUOWen-wei，HAN Zhao，LIWen＊.Department of Otolaryngology，Eye Ear Nose and Throat Hospital of Fudan University，Shanghai 200031，China

HAN Zhao，Email：sfhanzao＠yahoo.com.cn

Objective To explore the timeliness of Calbindin expression during the inner ear development of C57BL/6Jmice.Methods We obtained inner ear specimens from precise pregnancy C57BL/6Jmice（E8，E9，E10，E12，E14，E15～E21）and postnatal mice（D1～D22）.All of the specimens were cyro-sectioned and marked by the Calbindin antibody.The distribution of Calbindin was observed during the inner ear development under a fluorescence microscope.Results In the spiral ganglion neurons，the expression of Calbindin only existed at E16 and then disappeared，but the expression began at E8 and continued until adulthood in Scarpa ganglion neurons.The expression of Calbindin began at inner hair cells from E19，step by step diffused to both inner hair cells and outer hair cells over time.However，it disappeared after birth.Conclusions The timeliness of Calbindin expression during inner ear development of C57BL/6Jmice is confirmed。Calbindin is suggested to be useful for distinguishing regenerative hair cells from original hair cells in C57BL/6Jmice.However，we can not explain the mechanisms of some Calbindin expression characteristics during inner ear development of C57BL/6 mice.（Chin JOphthalmol and Otorhinolaryngol，2013，13：368-371）

Calbindin；C57BL/6 mice；Inner ear；Embryo development；Immunohistochemistry

2012-11-01）

（本文編輯 楊美琴）

國家自然科學基金項目（81271084）

復(fù)旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻咽喉科＊實驗中心 上海 200031

韓朝（Email：sfhanzao＠yahoo.com.cn）