原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者血清TNF-α和IL-6水平變化及其臨床意義

陳廣莉，徐又先，明芳

(柳州市人民醫(yī)院婦科,廣西柳州545006)

·檢驗與臨床·

原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者血清TNF-α和IL-6水平變化及其臨床意義

陳廣莉，徐又先，明芳

(柳州市人民醫(yī)院婦科,廣西柳州545006)

目的探討原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URA)患者血清TNF-α和IL-6水平變化及其臨床意義，闡明其在URA中的內(nèi)在分子機制。方法選擇在柳州市人民醫(yī)院確診妊娠7～11周難免流產(chǎn)URA患者30例患者進(jìn)行血清TNF-α和IL-6的檢測，與30例妊娠7～11周的正常早期妊娠行人工流產(chǎn)患者和30例健康未孕婦女進(jìn)行對照研究。結(jié)果URA流產(chǎn)患者血清TNF-α水平為(23.97±11.35)pg/ml，明顯高于對照組正常妊娠患者(11.57±6.82pg/ml)及健康未孕患者(8.97±4.39pg/ml)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01)。而URA流產(chǎn)患者血清IL-6水平為(28.45±20.38)pg/ml，明顯高于對照組(16.03±2.42pg/ml)及(13.87±5.32pg/ml)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論TNF-α和IL-6的異常表達(dá)可能是原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者流產(chǎn)的原因之一。

TNF-α；IL-6；原因不明；復(fù)發(fā)性流產(chǎn)

原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained repeated spontaneous abortion，URA)，是臨床上難治性的不育癥。自然流產(chǎn)發(fā)病原因非常復(fù)雜，涉及婦產(chǎn)科學(xué)、遺傳學(xué)、流行病學(xué)、職業(yè)醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、血液及內(nèi)分泌學(xué)等多個學(xué)科[1]。近年研究表明，超過半數(shù)以上的原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與免疫因素有關(guān)。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的、具有多種生物學(xué)效應(yīng)的一種重要的細(xì)胞因子，近年研究顯示，它在生殖調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。白細(xì)胞介素-6(IL-6)是由多種細(xì)胞分泌并具有多種免疫調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞因子，在妊娠免疫中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)就原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與TNF-α和IL-6水平的關(guān)系進(jìn)行探討，闡明其檢測的意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組隨機選擇2008年1月至2009年12月在柳州市人民醫(yī)院婦科門診就診婦女，其中30例為有多次自然流產(chǎn)史，現(xiàn)在確定妊娠(妊娠7～11周)并難免流產(chǎn)者，稱為URA難免流產(chǎn)組。30例為有正常生育史要求行人工流產(chǎn)終止妊娠的早孕健康婦女(正常早孕組)及30例有正常生育史健康未孕婦女(健康未孕組)。將URA難免流產(chǎn)組作為研究組；正常早孕組和健康未孕組作為對照組。對照組至少有1次生產(chǎn)正常且足月分娩史，無自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史。兩組婦女月經(jīng)規(guī)律，末次月經(jīng)明確，年齡、孕周、孕次、體重、體重指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。URA是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生2次或2次以上自然流產(chǎn)，其中不存在染色體、解剖、內(nèi)分泌、自身免疫異常和生殖道感染等常見病因。URA難免流產(chǎn)者停經(jīng)7～11周，B超檢查探及原始心管搏動確診為妊娠并經(jīng)B超動態(tài)監(jiān)測胎心搏動消失，確診為難免流產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集與處理所有入選者空腹8～12h后于清晨(難免流產(chǎn)組及正常早孕組均于治療前采血；健康未孕組在月經(jīng)周期的第10～14天取血)取肘靜脈血10ml，所有標(biāo)本均用無菌試管收集，分離血漿置-70℃保存待檢。

1.2.2 采用ELISA法檢測血清TNF-α和IL-6：(1)將試劑盒及樣本血漿平衡至室溫(20℃～25℃)再開始做實驗。(2)加待測血漿標(biāo)本：加入100μl標(biāo)準(zhǔn)品、100μl待測血漿于反應(yīng)孔中，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1400pg/ml、700pg/ml、350pg/ml、175pg/ml、70pg/ml、35 pg/ml共6個濃度。(3)每孔加入40μl Anti TNF-α Biotin和Anti TNF-αPOD 40μl輕輕混勻30s，封住板孔，置放于室溫溫育45min。(4)甩盡板內(nèi)液體，每孔加入350μl洗滌液，用洗滌液沖洗反應(yīng)板，吸水紙上拍干，這樣反復(fù)洗滌5次。(5)每孔加100μl TMB顯色液，輕輕混勻10s，置放于室溫溫育20min。(6)每孔加入底物工作液100μl，置放于室溫

溫育10min。(7)每孔加入100μl終止液，輕輕混勻30s，確定藍(lán)色變成黃色。于30min內(nèi)在450nm酶標(biāo)儀上讀出OD值。(8)以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)血漿樣品的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對應(yīng)的濃度。檢測血清IL-6水平的實驗步驟同TNF-α。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)處理用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行。計量資料數(shù)據(jù)以(x±s)表示。組間比較用t檢驗，兩變量之間的相關(guān)關(guān)系采用Spearsman相關(guān)分析，顯著性檢驗水平為0.05。

2 結(jié)果

URA流產(chǎn)患者血清TNF-α水平為(23.97± 11.35)pg/ml，明顯高于對照組正常妊娠患者(11.57± 6.82pg/ml)、健康未孕患者(8.97±4.39pg/ml)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01)。而URA流產(chǎn)患者血清IL-6水平為(28.45±20.38)pg/ml，明顯高于對照組(16.03±12.42pg/ml)及(13.87±5.32pg/ml)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組患者血清TNF-α和IL-6水平比較

表1 各組患者血清TNF-α和IL-6水平比較

注：與正常早孕組比較，△P＜0.05;與健康未孕組比較，*P＜0.01，**P＜0.05。

組別nTNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml) URA流產(chǎn)組正常早孕組健康未孕組30 30 30 23.97±11.35△*11.57±6.82 8.97±4.39 28.45±20.38△**16.03±12.42 13.87±5.32

3 討論

近年的生殖免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，50%～60%的原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)可能與免疫因素有關(guān)。研究表明，引起自然流產(chǎn)的免疫學(xué)機制主要表現(xiàn)為封閉抗體缺乏、自身免疫機制異常、有異常自身抗體產(chǎn)生和細(xì)胞免疫過強[2]。

3.1 TNF-α與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)TNF-α是一種多組織來源的多功能細(xì)胞因子，它主要由免疫系統(tǒng)中的單核-巨噬細(xì)胞、Th1細(xì)胞、NK細(xì)胞等表達(dá)。生理狀態(tài)下，適量分泌的TNF-α可調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的正常增殖、分化和凋亡，促進(jìn)婦女能量代謝及胚胎發(fā)育，提高孕激素及絨毛促性腺激素的合成，刺激細(xì)胞滋養(yǎng)層生成尿激酶型血漿素原激活劑(uPA)，有利于蛻膜細(xì)胞外基質(zhì)降解及胎盤植入，對妊娠的維持有重要作用[2]。高濃度的可能通過以下途徑導(dǎo)致流產(chǎn)：(1)促進(jìn)絨毛膜和蛻膜中前列腺素E2的合成和分解，并可刺激蛻膜及羊膜細(xì)胞分泌釋放PGE2，引起子宮平滑肌收縮；(2)對促凝血酶原激酶Fg12的表達(dá)有上調(diào)作用，可引起促凝血酶原的激活，使胎盤滋養(yǎng)血管素沉積、血栓形成；(3)對蛻膜、臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞有毒性損害并促進(jìn)分泌微粒子(MPS)，它通過活化組織因子VII而激活凝血過程促血栓形成，從而導(dǎo)致胎盤絨毛功能障礙，影響絨毛發(fā)育正常；(4)激發(fā)Th1型免疫反應(yīng)，排斥胚胎組織等[3]。本研究提示，不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組的TNF-α值明顯高于正常妊娠組及健康未孕組，對比有統(tǒng)計學(xué)差異，這與目前的大多研究報道一致[4]。因此，檢測血清TNF-α值可以預(yù)測患者流產(chǎn)的可能。

3.2 IL-6與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)IL-6是輔助T細(xì)胞2 (Th2)型細(xì)胞因子，通過介導(dǎo)體液免疫來參與同種異體免疫耐受。國內(nèi)外大多研究表明[5，6]，IL-6蛋白表達(dá)相對含量在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中明顯低于正常妊娠婦女，外周血中IL-6水平復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者亦明顯低于正常妊娠婦女[7]。IL-6能刺激機體B細(xì)胞產(chǎn)生抗體及CTL分化，增強GM-CSF活性，抑制母體的免疫排斥反應(yīng)，促進(jìn)粘附分子生成，參與調(diào)節(jié)血管生成因子的合成，促進(jìn)胚泡植入和胚胎生長發(fā)育，有利于妊娠的維持。另一方面，IL-6作為Th2型細(xì)胞因子，在自然狀態(tài)下具有抗炎作用，有利于妊娠。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血中IL-6水平明顯高于正常妊娠婦女及健康未孕婦女，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與以上大多的研究報道不一致。由此可見，IL-6介導(dǎo)體液免疫參與的同種異體免疫耐受是相當(dāng)復(fù)雜的，而患者反復(fù)流產(chǎn)原因的確切機制尚不明了。筆者認(rèn)為，或許有部分患者IL-6水平升高導(dǎo)致免疫耐受與抗炎作用的失衡，同樣可能導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)的發(fā)生。因目前的大多數(shù)研究的樣本例數(shù)較少，還有待于更大樣本的進(jìn)一步研究。

本次研究結(jié)果顯示，血清TNF-α和IL-6可以作為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的監(jiān)測指標(biāo)，對于今后尋找阻斷免疫因子作用的新療法提供理論支持。

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A

1674-1129(2013)02-0157-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.02.020

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳醫(yī)療衛(wèi)生科研課題基金項目(Z2011281),廣西柳州市科技攻關(guān)項目(2011J0302028)。