H7N9禽流感病毒感染及其實驗室診斷

董曉毅，孫長貴

(解放軍117醫(yī)院檢驗科南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)檢驗質(zhì)量控制中心，浙江杭州310013)

·述評·

H7N9禽流感病毒感染及其實驗室診斷

董曉毅，孫長貴

(解放軍117醫(yī)院檢驗科南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)檢驗質(zhì)量控制中心，浙江杭州310013)

至2013年4月23日，新型H7N9亞型的禽流感病毒已經(jīng)在中國感染了108人，并致22人死亡?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)甲型禽流感病毒H7N9源自3種病毒株的重配，并出現(xiàn)了實質(zhì)性的突變。H7N9病毒擁有幾個哺乳動物流感病毒的特征，從而形成了對人類的感染力，因此需重視其大規(guī)模流行的潛力。本文對該病毒的生物學(xué)特性、流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)和實驗室診斷進行了簡要綜述。

H7N9；禽流感病毒；感染

中國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會于3月31日首次通報，上海市和安徽省發(fā)現(xiàn)3例人感染H7N9禽流感病例。H7N9禽流感是由新亞型H7N9禽流感病毒引起，該病毒是全球首次發(fā)現(xiàn)，因其是一種新亞型，起病急、進展快、致死率高，受到廣泛關(guān)注。目前對H7N9禽流感病毒的研究仍處于起步階段，本文對近期國內(nèi)有關(guān)H7N9禽流感病毒的生物學(xué)特性、流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)和實驗室診斷等方面的研究進展作簡要綜述。

1 H7N9禽流感病毒的生物學(xué)特性

H7N9是禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)的一個亞型，AIV屬于正黏病毒科(orthomyxoviridae)甲型流感病毒屬，是引起禽流行性感冒的病原體。AIV表面有釘狀的血細(xì)胞凝集素(hemagglutinin，HA)和蘑菇狀的神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)兩種糖蛋白，根據(jù)HA和NA的抗原性差異，可將AIV分為16個H亞型(H1～H16)和9個N亞型(N1～N9)。H7N9就是其中一種，在2013年以前，H7N9僅感染禽類，并未發(fā)現(xiàn)過感染人的情況[1]。

禽流感病毒普遍對熱敏感，對低溫抵抗力較強，65℃加熱30min或煮沸(100℃)2min以上可滅活。病毒在較低溫度糞便中可存活1周，在4℃水中可存活1個月，對酸性環(huán)境有一定抵抗力，在pH4.0的條件下也具有一定的存活能力。在有甘油存在的情況下可保持活力1年以上[2]。

2 H7N9禽流感病毒的分子進化

AIV基因組由8個分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA組成，編碼8種結(jié)構(gòu)蛋白(HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA)和2種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)。有關(guān)新型H7N9病毒的起源、進化和感染途徑等大多數(shù)信息，均來自于對已發(fā)現(xiàn)的H7N9病毒基因組序列的分析、比對和推斷。

中國杭州疾病預(yù)防控制中心和WHO中國流感中心共采集和分析了4個新H7N9甲型禽流感病毒的基因組，并提交GISAID數(shù)據(jù)庫，分別為A/ Shanghai/1/2013、A/Shanghai/2/2013、A/Anhui/1/2013和A/Hongzhou/1/2013(數(shù)據(jù)不全，僅有HA、NA和M)，樣本均來源于人類患者[3-6]。

在核苷酸和氨基酸水平上，所有4個新H7N9甲型禽流感病毒的序列都高度相似，提示其來源

于同一個祖先。它們的HA基因?qū)儆谇萘鞲胁《镜臍W亞譜系，與1株2011年分離自浙江省鴨群的H7N3病毒的基因序列相似度最高，為95%。新病毒的NA基因則與1株2010年分離自捷克的野鴨的H11N9相似度最高，為96%，另外1株相似度最高的NA基因來源于韓國野鳥的H7N9病毒。其余6個基因則均與H9N2病毒基因高度相似(97%)[3-5]。H9N2亞型已在東亞地區(qū)循環(huán)了很多年，其跨種感染人的機制剛剛得到證實：H9N2亞型可感染人肺組織，主要的靶細(xì)胞為Ⅱ型肺泡細(xì)胞、呼吸細(xì)支氣管上皮細(xì)胞和細(xì)支氣管上皮細(xì)胞，并可在人肺上皮細(xì)胞中有效復(fù)制[7]。由此可以推斷，新型的H7N9病毒并非來源于舊有的H7N9病毒，而更可能是一種新型的三聯(lián)重配體，即由3種不同的禽流感病毒重配而成，而重配地點可能就在我國的東部長三角地區(qū)[4,5]。重配而成的H7N9擁有了感染人類的能力。

在核酸水平上，A/Shanghai/2/2013,A/Anhui/1/ 2013和A/Hangzhou/1/2013三者核苷酸序列高度相似(99%)，而A/Shanghai/1/2013與眾不同，它與A/Shanghai/2/2013的核苷酸序列相差達52個核苷酸，提示A/Shanghai/1/2013與其它新H7N9病毒來源不同[3-5]。

另外，HA受體結(jié)合位點的氨基酸序列決定了對人類或禽類的偏好性，對H7N9序列分析中發(fā)現(xiàn)的幾種突變，如A138S、Q226L、G186V等，都可增加H5、H7病毒與人類受體的結(jié)合能力。而位于150-loop的T160A突變，也可導(dǎo)致N-糖基化位點的缺失，最終造成病毒對人類受體結(jié)合能力的增加[5]。

在PB2蛋白627位的賴氨酸是禽流感病毒能在哺乳動物中有效復(fù)制的重要標(biāo)志，曾在高致病性H5N1和H7N7中檢測到，而在H9N2病毒中比較罕見，在4株新H7N9病毒中，均發(fā)現(xiàn)了該PB2-627K突變[3-5]。在NA蛋白的莖區(qū)，4種新H7N9病毒均觀察到了69～73位氨基酸的刪除，這種現(xiàn)象過去曾發(fā)生在病毒適應(yīng)陸生鳥類的案例中，提示H7N9病毒在感染人之前可能在陸生禽類中循環(huán)[5]。

總之，從生物進化的角度看，新發(fā)現(xiàn)的4種H7N9病毒已經(jīng)攜帶了若干哺乳動物流感病毒的特征，其潛在的流行能力需要引起關(guān)注[5,6]。

3 流行病學(xué)

H7亞型的AIVs可分為北美譜系和歐亞譜系，其感染人的第一次報道發(fā)生于1959年，美國一名男性肝炎患者血液中分離到了H7N7病毒。1996年，又從美國一名患結(jié)膜炎的女性體內(nèi)分離到禽源的H7N7。2003年以前，H7亞型感染人的報道很少，一般為實驗室感染[1]。在歐亞譜系，2003年春天，荷蘭發(fā)生了人群中大規(guī)模的H7N7亞型感染，導(dǎo)致86人感染。癥狀主要為結(jié)膜炎[1]。

最近暴發(fā)的H7N9禽流感病毒疫情，始于3月31日3例人感染H7N9的報道，患者均出現(xiàn)嚴(yán)重的肺炎和急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)[3,6]，至4月23日，全國共報告108例確診病例，分布于北京(1例)、上海(33例，死亡12例)、江蘇(24例，死亡3例)、浙江(42例，死亡6例)、安徽(4例，死亡1例)、山東(1例)、河南(3例)7省市。目前病例處于散發(fā)狀態(tài)，尚未發(fā)現(xiàn)人傳人的證據(jù)。

3.1 傳染源目前已經(jīng)在禽類及其分泌物或排泄物分離出H7N9禽流感病毒，與人感染H7N9禽流感病毒高度同源，傳染源可能為攜帶H7N9禽流感病毒的禽類。目前已發(fā)現(xiàn)2例家庭聚集性病例，一宗為首批報告確診感染H7N9的87歲患者家庭，另一宗是一對夫妻先后被確診為感染H7N9的家庭，但這些證據(jù)仍不足以代表H7N9病毒已經(jīng)具有了人傳人的能力。

3.2 傳播途徑經(jīng)呼吸道傳播，也可通過密切接觸感染的禽類分泌物或排泄物，或直接接觸病毒感染。

3.3 高危人群在發(fā)病前1周內(nèi)接觸過禽類者，例如從事禽類養(yǎng)殖、販運、銷售、宰殺、加工業(yè)等人員。

4 臨床表現(xiàn)

中國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會2013年4月3日印發(fā)人感染H7N9禽流感診療方案(2013年第1版)、防控方案及醫(yī)院感染預(yù)防與控制技術(shù)指南。并于2013年4月10日再次發(fā)布人感染H7N9禽流感診療方案(2013年第2版)，以指導(dǎo)禽流感的診斷和防治。根據(jù)該方案，流感的潛伏期及現(xiàn)有H7N9禽流感病毒感染病例的調(diào)查結(jié)果，潛伏期一般為7d以內(nèi)。

患者一般表現(xiàn)為流感樣癥狀，如發(fā)熱、咳嗽、少痰，可伴有頭痛、肌肉酸痛和全身不適。重癥患者病情發(fā)展迅速，多在5～7d天出現(xiàn)重癥肺炎，體溫大多持續(xù)在39℃以上，呼吸困難，可伴有咯血

痰；可快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥、感染性休克，甚至多器官功能障礙，部分患者可出現(xiàn)縱隔氣腫、胸腔積液等[2]。

5 實驗室檢查[2]

5.1 血常規(guī)白細(xì)胞總數(shù)一般不高或降低。重癥患者多有白細(xì)胞總數(shù)及淋巴細(xì)胞減少，可有血小板降低。

5.2 血生化檢查多有肌酸激酶、乳酸脫氫酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高，C反應(yīng)蛋白升高，肌紅蛋白可升高。

5.3 病原學(xué)及相關(guān)檢測對于H7N9病毒的檢測，目前主要是通過反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測病毒RNA。由于核酸檢測是直接檢測病原體RNA，具有高敏感，高特異和短檢測窗口期等優(yōu)點，為疾病早診斷、早治療、降低病死率以及控制疫情爭取時間。相關(guān)試劑盒研制難度較低，目前已有文獻報道使用實時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse-transcription polymerase chain reaction，real time RT-PCR)檢測H7N9病毒[8]。

診療方案要求，抗病毒治療之前必須采集呼吸道標(biāo)本送檢(如鼻咽分泌物、口腔含漱液、氣管吸出物或呼吸道上皮細(xì)胞)。有病原學(xué)檢測條件的醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)盡快檢測，無病原學(xué)檢測條件的醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)留取標(biāo)本送指定機構(gòu)檢測。

5.3.1 甲型流感病毒抗原篩查呼吸道標(biāo)本甲型流感病毒抗原快速檢測陽性。但僅可作為初篩實驗。

5.3.2 核酸檢測對患者呼吸道標(biāo)本采用real time RT-PCR檢測H7N9禽流感病毒核酸。real time RT-PCR檢測H7N9禽流感病毒和甲型流感病毒通用引物和探針見表1[9]。

表1 real time RT-PCR檢測H7N9禽流感病毒和甲型流感病毒通用引物和探針

5.3.3 病毒分離從患者呼吸道標(biāo)本中分離H7N9禽流感病毒。

5.3.4 動態(tài)檢測雙份血清H7N9禽流感病毒特異性抗體水平呈4倍或以上升高[2]。

6 診斷與鑒別診斷[2]

6.1 診斷根據(jù)流行病學(xué)接觸史、臨床表現(xiàn)及實驗室檢查結(jié)果，可作出人感染H7N9禽流感的診斷。在流行病學(xué)史不詳?shù)那闆r下，根據(jù)臨床表現(xiàn)、輔助檢查和實驗室檢測結(jié)果，特別是從患者呼吸道分泌物標(biāo)本中分離出H7N9禽流感病毒，或H7N9禽流感病毒核酸檢測陽性，或動態(tài)檢測雙份血清H7N9禽流感病毒特異性抗體水平呈4倍或以上升高，可作出人感染H7N9禽流感的診斷[2]。

6.1.1 流行病學(xué)史發(fā)病前1周內(nèi)與禽類及其分泌物、排泄物等有接觸史。

6.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

6.1.2.1 疑似病例符合上述臨床表現(xiàn)，甲型流感病毒抗原陽性，或有流行病學(xué)接觸史。

6.1.2.2 確診病例符合上述臨床表現(xiàn)，或流行病學(xué)接觸史，并且呼吸道分泌物標(biāo)本中分離出H7N9禽流感病毒或H7N9禽流感病毒核酸檢測陽性或動態(tài)檢測雙份血清H7N9禽流行病毒特異性抗體水平呈4倍或以上升高。

6.2 鑒別診斷應(yīng)注意與人感染高致病性H5N1禽流感、季節(jié)性流行感(含甲型H1N1流感)、細(xì)菌性肺炎、傳染性非典型肺炎(SARS)、新型冠狀病毒肺炎、腺病毒肺炎、衣原體肺炎、支原體肺炎等疾病進行鑒別診斷。鑒別診斷主要依靠病原學(xué)檢查。

7 結(jié)束語

目前，針對H7N9禽流感病毒的研究已經(jīng)獲得了一定的成果，為下一步更有效地防控流感大流行提供了大量信息，但對于其病毒進化、傳播途徑、致病機制和流行規(guī)律等方面還了解不多和不深，需要進一步地深入研究。

[1]朱聞斐,高榮保,王大燕,等.H7亞型禽流感病毒概述[J].病毒學(xué)報, 2013,29(3):245-249.

[2]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.人感染H7N9禽流感診療方案[S].第2版.2013.

[3]Gao R,Cao B,Hu Y,et al.Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A(H7N9)Virus[J].N Engl J Med,2013,[Epub ahead of print].

[4]He J,Ning L,Tong Y.Origins and evolutionary genomics of the novel 2013 avian-origin H7N9 influenza A virus in China:Early findings[EB/OL].arXiv:1304.1985v2[2013-04-09].

[5]Kageyama T,Fujisaki S,Takashita E,et al.Genetic analysis of novel avian A(H7N9)influenza viruses isolated from patients in China, February to April 2013.[J].Euro Surveill.2013,18(15):pii=20453.

[6]Wen YM,Klenk HD.H7N9 avian influenza virus-search and research[J].Emerging Microbes and Infections,2013,2(4):e18.

[7]張增峰,樊曉暉,陳曉燕,等.禽流感病毒H9N2在人肺組織的復(fù)制[J].病毒學(xué)報.2013,29(2):206-210

[8]Corman VM,Eickmann M,Landt O,et al.Specific detection by real-time reverse-transcription PCR assays of a novel avian influenza A(H7N9)strain associated with human spillover infections in China[J].Euro Surveill.2013,18(16):pii=20461.

[9]WHO.Real-time RT-PCR Protocol for the Detection of Avian Influenza A(H7N9)Virus Real-time RT-PCR Protocol for the Detection of Avian Influenza A(H7N9)Virus[S].http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/cnic_realtime_rt_pcr_protocol_a_h7n9.pdf.

Infections and laboratory diagnosis of H7N9 avian influenza

DONG Xiaoyi,SUN Changgui.Department of Clinical Laboratory, 117th Hospital of PLA，Hangzhou 310013,China

Novel avian influenza virus of the H7N9 subtype has infected 108 and killed 21 people in China as of April 23, 2013.Scientists have found that the influenza A(H7N9)virus was derived from a reassortment of 3 strains of AIV,and substantial mutations have been detected.These influenza A(H7N9)virus possess several characteristic features of mammalian influenza viruses,which are likely to contribute to their ability to infect humans and raise concerns regarding their pandemic potential.This paper briefly reviews recent progress in the biological characterization,epidemiology,clinical manifestation and laboratory diagnosis of this highly virulent virus.

H7N9;Avian influenza virus;Infection

R511.7,R373.1+3

A

1674-1129(2013)02-0105-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.02.001

董曉毅，男，1974年生，主管技師，博士，從事臨床微生物學(xué)檢驗。

孫長貴,碩士研究生導(dǎo)師，主任技師，教授,suncgui@163. com