ZNF300基因在肝癌耐藥細(xì)胞HepG2/VCR中的表達(dá)及功能初探

李 靜，王 濤

(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心、2.病理生理學(xué)教研室，安徽合肥 230032)

目前原發(fā)性肝癌在世界范圍內(nèi)發(fā)病率居各種惡性腫瘤的第6位，致死率居第3位。由于肝癌早期診斷率較低，系統(tǒng)化療仍是進(jìn)展期肝癌病人的主要臨床治療手段［1-2］。但是肝癌病人對(duì)化療藥物的多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)成為臨床治療的一大障礙［3-4］。MDR產(chǎn)生的一大重要機(jī)制是腫瘤細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了耐藥基因MDR-1的高表達(dá)。MDR-1基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物為P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，它發(fā)揮的主要功能是將進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外，降低藥物的作用效率，并可以抑制 caspase的活性，減少腫瘤細(xì)胞的凋亡率［3-4］。目前許多研究組致力于P-gp抑制劑的研究工作［5-6］。然而這些研究并不能解決肝癌臨床治療的根本問題，因?yàn)樵S多促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的基因，如NF-κB、ERK和HIF-1等，一方面促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖或抑制其凋亡，另一方面可以上調(diào)P-gp的表達(dá)促進(jìn)肝癌的多藥耐藥性［7-9］。因此單一用藥無法完全逆轉(zhuǎn)肝癌的MDR，尋找新的藥物作用靶點(diǎn)成為目前研究的熱點(diǎn)。

ZNF300基因是一種與人胚胎發(fā)育相關(guān)的KRAB類鋅指蛋白基因［10］，本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)ZNF300基因在肝癌和其他腫瘤，如結(jié)腸癌和肺癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，而在癌旁組織中無明顯表達(dá);進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ZNF300基因的過表達(dá)可以通過上調(diào)NF-κB的活性，促進(jìn)ERK的磷酸化，抑制p21、p27的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移;通過反義cDNA的轉(zhuǎn)染抑制ZNF300的表達(dá)則出現(xiàn)相反的效果［11-12］。由于NF-κB和ERK都可以通過上調(diào) P-gp的高表達(dá)促進(jìn)肝癌的 MDR，為觀察ZNF300基因能否作為逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥的候選藥物作用靶點(diǎn)，在本項(xiàng)目中，我們擬通過體外低濃度梯度遞增法構(gòu)建 HepG2/VCR耐藥細(xì)胞株，檢測(cè)HepG2/VCR與普通HepG2細(xì)胞中的ZNF300基因與P-gp的表達(dá)差異，分析ZNF300基因與肝癌MDR的相關(guān)性;并在HepG2/VCR細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ZNF300正向或反義cDNA質(zhì)粒，觀察ZNF300表達(dá)上調(diào)或下調(diào)后，HepG2/VCR細(xì)胞中 P-gp的表達(dá)變化，及HepG2/VCR細(xì)胞IC50值的變化，初步分析ZNF300基因在肝癌MDR中的相關(guān)功能。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體人肝癌細(xì)胞株HepG2購自中科院上海細(xì)胞庫;DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司;胎牛血清(fatal bovine serum，F(xiàn)BS)購自杭州四季青公司;長春新堿(vincristine，VCR)購自合肥華澤生物有限公司;四甲基偶氮唑鹽〔3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3， 5-di-phenytetrazo liumromide，MTT〕購自Sigma公司;小鼠抗人P-gp單克隆抗體購自Cell Signaling公司;小鼠抗人GAPDH抗體購自上?？党晒?兔抗人ZNF300多克隆抗體為武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李文鑫教授饋贈(zèng);辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠第二抗體購自合肥華澤生物有限公司;ECL顯影試劑盒購自Pierce公司;預(yù)染蛋白分子量Marker購自Fermentas公司;PVDF膜購自GE公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及 HepG2/VCR的構(gòu)建 HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)于含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每周傳代2-3次，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。肝癌多藥耐藥細(xì)胞株HepG2/VCR的建立采用長春新堿(VCR)低濃度梯度遞增誘導(dǎo)法［13］，直至HepG2/VCR細(xì)胞能在含VCR 1 mg·L-1的培養(yǎng)液中維持生長，并利用MTT法檢測(cè)其耐藥性。

1.2.2 HepG2/VCR耐藥性的鑒定 為鑒定HepG2/VCR的耐藥性，將 HepG2/VCR和普通HepG2細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長期后，按5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度VCR(0.01、0.1、1、10 和100 mg·L-1)處理24 h，進(jìn)行MTT檢測(cè)，繪制生長曲線。

1.2.3 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 正向和反向ZNF300基因cDNA克隆入IRES-GFP真核表達(dá)質(zhì)粒中，分別命名為 IRES-ZNF300-GFP和 IRES-ASZNF300-GFP，克隆方法見參考文獻(xiàn)［12］。用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將IRES-ZNF300-GFP和IRES-ASZNF300-GFP及其對(duì)照質(zhì)粒IRES-GFP轉(zhuǎn)染入HepG2/VCR細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染方法為:將HepG2/VCR細(xì)胞按5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，在含5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度達(dá)到80% ～90%;按轉(zhuǎn)染試劑說明書配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物(Lipofectamine 2000):在250 μl Opti-MEM 中加入10 μl轉(zhuǎn)染試劑;質(zhì)粒復(fù)合物:在250 μl Opti-MEM中加入4 μg質(zhì)粒;室溫靜置5 min后將質(zhì)粒復(fù)合物加入轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物中，使之形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，室溫靜置20 min，每孔細(xì)胞中加入1.5 ml無血清無雙抗DMEM培養(yǎng)液，將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物輕輕混勻加入細(xì)胞中，在含5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h后;將每孔細(xì)胞更換成2 ml有血清的DMEM培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Western blot檢測(cè) Western blot方法用于檢測(cè)HepG2/VCR和普通HepG2細(xì)胞中ZNF300和P-gp蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，及HepG2/VCR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后ZNF300和P-gp蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。收取經(jīng)上述細(xì)胞，用含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、氟化鈉和釩酸鈉的加樣緩沖液冰上靜置裂解細(xì)胞10 min，再100℃變性10 min即為全細(xì)胞裂解液，SDS-PAGE凝膠電泳后冰浴濕式轉(zhuǎn)印至PVDF膜，參數(shù)為恒壓80V ×3 h.用含 0.5 g·L-1脫脂奶粉和 0.5 ml吐溫20的PBST封閉30 min后，按抗體廠家建議稀釋一抗后4℃敷膜結(jié)合過夜，待檢測(cè)抗體為ZNF300多克隆抗體和P-gp單克隆抗體，以GAPDH抗體為內(nèi)參。一抗結(jié)合后PBS-T洗膜10 min×3次，加入適當(dāng)稀釋度的二抗，室溫?fù)e床結(jié)合2 h，再次PBS-T洗膜10 min×3次，暗室內(nèi)ECL顯色，柯達(dá)膠片感光顯影并掃描。

1.2.5 MTT檢測(cè)及IC50值計(jì)算 HepG2/VCR細(xì)胞按5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，進(jìn)行ZNF300相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h，用0.25%胰酶消化重懸，按5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，24 h后加入不同濃度VCR(0.125、0.25、0.5、1和2mg·L-1)干預(yù) 24 h，在終止培養(yǎng)前4 h加MTT溶液(0.5 mg·L-1)。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，每孔加入100 μl DMSO，置于搖床上15 min，使結(jié)晶物充分溶解;置酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔吸光度值(A570nm)，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。根據(jù)MTT結(jié)果繪制生長曲線，并采用中效分析軟件(Logit法)計(jì)算質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，HepG2/VCR細(xì)胞對(duì)VCR的半數(shù)抑制濃度值(50%inhibitory concent ration，IC50)變化，按以下公式計(jì)算耐藥指數(shù)(resistance index，RI)。RI=IC50質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞/IC50親本細(xì)胞。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間數(shù)據(jù)的顯著性檢驗(yàn)采用ANOVA法分析。

2 結(jié)果

2.1 肝癌耐藥細(xì)胞株HepG2/VCR耐藥性的鑒定篩選出的HepG2/VCR細(xì)胞和HepG2細(xì)胞在其指數(shù)生長期時(shí)，分別加入不同濃度 VCR(0.01、0.1、1、10和100 mg·L-1)處理24 h，經(jīng)MTT檢測(cè)后繪制生長曲線后發(fā)現(xiàn)，HepG2/VCR細(xì)胞對(duì)VCR的耐藥性相對(duì)于 HepG2細(xì)胞明顯增高(P＜0.05，ANVOA)(Fig 1)，說明肝癌耐藥細(xì)胞株HepG2/VCR構(gòu)建成功。

Fig 1 MTT analysis of HepG2/VCR and HepG2 treated with different concentrations of VCR

2.2 Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HepG2/VCR細(xì)胞中ZNF300和P-gp表達(dá)增高HepG2/VCR細(xì)胞和HepG2細(xì)胞在其指數(shù)生長期時(shí)收取蛋白質(zhì)，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，樣品各點(diǎn)兩道，用兔抗人ZNF300多克隆抗體和鼠抗人P-gp單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，以GAPDH作為內(nèi)參，結(jié)果如Fig 2所示，可見在GAPDH表達(dá)基本一致的情況下，HepG2/VCR細(xì)胞中ZNF300和P-gp的表達(dá)明顯高于HepG2細(xì)胞，提示ZNF300基因與HepG2/VCR細(xì)胞的耐藥性和P-gp的表達(dá)有相關(guān)性。

2.3 ZNF300基因表達(dá)變化對(duì)HepG2/VCR細(xì)胞中P-gp表達(dá)及耐藥性的影響在HepG2/VCR細(xì)胞中轉(zhuǎn)染，將IRES-ZNF300-GFP和IRES-ASZNF300-GFP及其對(duì)照質(zhì)粒IRES-GFP，轉(zhuǎn)染后48 h，收取蛋白質(zhì)，用兔抗人ZNF300多克隆抗體和鼠抗人P-gp單克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，以GAPDH作為內(nèi)參，結(jié)果如Fig 3所示，可見在GAPDH表達(dá)基本一致的情況下，IRES-ZNF300-GFP組細(xì)胞中ZNF300和P-gp表達(dá)明顯高于空載體組和親本細(xì)胞組，IRES-ASZNF300-GFP組細(xì)胞中結(jié)果相反，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后可有效促進(jìn)ZNF300在細(xì)胞中的高表達(dá)或Knockdown，ZNF300高表達(dá)可上調(diào) P-gp的表達(dá)，ZNF300基因knockdown則可抑制P-gp的表達(dá)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，加入不同濃度 VCR(0.125、0.25、0.5、1和2 mg·L-1)干預(yù)24 h行MTT檢測(cè)繪制生長曲線(Fig 4)，并計(jì)算 IC50值和 RI值變化(Tab 1)，可見ZNF300基因高表達(dá)可促進(jìn)HepG2/VCR的耐藥性，而ZNF300基因Knockdown則有相反的結(jié)果(P＜0.05)。說明ZNF300基因可以通過上調(diào)P-gp的表達(dá)促進(jìn)HepG2/VCR的耐藥性。

Tab 1 Drug resistance of HepG2/VCR improved by ZNF300 overexpression

Fig 4 Drug resistance of HepG2/VCR cells promoted by ZNF300 overexpression

3 討論

對(duì)于原發(fā)性肝癌，有效的臨床治療手段在于早期診斷和手術(shù)切除原發(fā)病灶，但是目前臨床上確診的大多數(shù)肝癌病人已處于進(jìn)展期，所以系統(tǒng)化療仍是目前肝癌臨床治療的主要手段［1-2］。然而肝癌病人對(duì)傳統(tǒng)化療藥物均會(huì)出現(xiàn)多藥耐藥(MDR)現(xiàn)象，所以肝癌病人的預(yù)后往往極為不好［3-4］。近年來隨著分子靶向藥物的研究進(jìn)展，以Sorafenib為代表的一些藥物被批準(zhǔn)上市，給肝癌的臨床治療帶來新的希望，然而現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)病人同樣會(huì)對(duì)Sorafenib產(chǎn)生耐藥性［3］。所以對(duì)于肝癌MDR逆轉(zhuǎn)藥物或藥物作用靶點(diǎn)的研究成為目前的研究熱點(diǎn)。

現(xiàn)在認(rèn)為肝癌MDR產(chǎn)生的一個(gè)最主要的機(jī)制在于 MDR-1基因產(chǎn)物 P-糖蛋白(P-gp)的高表達(dá)［4］。P-gp是一個(gè)170 ku大小的蛋白質(zhì)成分，表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜，屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter)家族成員，主要功能在于將進(jìn)入細(xì)胞的藥物泵出細(xì)胞外以達(dá)到減少藥物對(duì)細(xì)胞毒性的目的［4］。在本項(xiàng)目中，我們采用長春新堿(VCR)低濃度梯度遞增誘導(dǎo)法建立HepG2/VCR耐藥細(xì)胞株，通過MTT檢測(cè)確定其構(gòu)建成功，經(jīng)Western blot檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，HepG2/VCR細(xì)胞中的P-gp表達(dá)水平明顯高于HepG2細(xì)胞，這與前期研究報(bào)道相符［13］。

然而目前許多抑制P-gp表達(dá)的藥物并不能根本解決肝癌MDR的實(shí)際問題，因?yàn)楦伟㎝DR的產(chǎn)生是一個(gè)多因素參與的過程，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)許多促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的基因，如NF-κB和ERK，一方面可以抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，另一方面亦可上調(diào)P-gp的表達(dá)，在肝癌 MDR的產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要的作用［4，7-8］。所以尋找新的藥物作用靶點(diǎn)與P-gp抑制劑共同作用來逆轉(zhuǎn)MDR成為一種新的策略。

ZNF300基因最初是從人胚胎cDNA文庫中篩選出來的一種KRAB類鋅指蛋白基因，前期研究發(fā)現(xiàn)其KRAB區(qū)可以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用，其鋅指區(qū)可以結(jié)合CG富含的啟動(dòng)子區(qū)域［10-12］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ZNF300基因可以通過調(diào)控TRAF2基因的表達(dá)，同時(shí)結(jié)合IKKβ蛋白質(zhì)來促進(jìn)NF-κB通路的活性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ZNF300高表達(dá)可以促進(jìn)ERK的磷酸化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，而NF-κB和ERK都可上調(diào) P-gp的表達(dá)［12］。利用免疫組織化學(xué)檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)ZNF300基因在肝癌等多種腫瘤組織細(xì)胞中高表達(dá)，而在癌旁組織中表達(dá)較低［12］。綜合上述研究基礎(chǔ)，在本項(xiàng)目中，我們利用Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HepG2/VCR細(xì)胞中ZNF300的表達(dá)明顯高于HepG2細(xì)胞，并與P-gp的表達(dá)有相關(guān)性，提示ZNF300基因可能參與肝癌MDR的形成過程。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，我們將正向和反向ZNF300基因cDNA轉(zhuǎn)染入HepG2/VCR細(xì)胞中，經(jīng)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)正向cDNA的轉(zhuǎn)染可以明顯促進(jìn)ZNF300的表達(dá)，并上調(diào)P-gp在HepG2/VCR中的表達(dá)，MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ZNF300基因高表達(dá)可以促進(jìn)HepG2/VCR的耐藥性。而反向ZNF300基因cDNA則有完全相反的結(jié)果。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明ZNF300基因在肝癌耐藥細(xì)胞株中高表達(dá)，并可以通過上調(diào)耐藥基因P-gp的表達(dá)促進(jìn)肝癌的多藥耐藥性，初步證明ZNF300可以作為逆轉(zhuǎn)肝癌MDR的潛在藥物作用靶點(diǎn)。而ZNF300基因在肝癌MDR發(fā)生發(fā)展過程中的發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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