雷帕霉素對哮喘小鼠氣道重塑的影響

延光海，金光玉，樸紅梅，鄭明昱，李良昌，李光昭

(延邊大學1.醫(yī)學院解剖學教研部、2.附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科、3.中醫(yī)學院內(nèi)科學教研室，吉林 延吉 133002)

氣道重塑(airway remodeling)是支氣管哮喘的重要特征之一，表現(xiàn)為氣道平滑肌增厚、杯狀細胞增生、上皮下纖維化、肌成纖維細胞增生、炎癥細胞浸潤、細胞外基質(zhì)沉積等［1］。mTOR屬于磷酸肌醇激酶3相關激酶(PIKKs)家族的一員，是PI3K/Akt的下游底物，可通過改變翻譯調(diào)節(jié)因子p70s6k和4E-BPI的磷酸化狀態(tài)啟動翻譯過程。近年來研究表明mTOR與人體炎癥、損傷、增生、組織修復、纖維化以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等一系列重要的病理生理過程密切相關［2－3］。在本研究中，我們給予 mTOR抑制劑雷帕霉素(rapamycin)觀察肺泡灌洗液和肺組織中各種炎性因子的變化，探討雷帕霉素有無選擇性抑制氣道炎癥，而進一步闡明其阻止氣道重塑的發(fā)生機制。

1 材料

1.1 動物♂BALB/c小鼠30只，體質(zhì)量(18±5)g，由延邊大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，合格證號，SCXK(吉)2011-0007。按隨機數(shù)字表法分為3組，即正常對照組、哮喘模型組、雷帕霉素治療組，每組10只。

1.2 藥品與試劑卵蛋白(OVA，Sigma);氫氧化鋁粉(分析純，Sigma);細胞因子 IL-4、IL-5、IL-13 檢測試劑盒(北京晶美生物工程有限公司)。mTOR抗體為美國Santa Cruz產(chǎn)品。

1.3 儀器設備霧化器(大連醫(yī)療器械廠U219，歐姆龍);酶聯(lián)免疫檢測儀(RT-2100C，美國);電泳儀及電泳槽(E-C Apparatus Corporation，美國);Western blot轉(zhuǎn)膜儀(BioRad公司)。

2 方法

2.1 動物模型的復制模型制備參照延光海等［4］報道的方法:哮喘組和雷帕霉素治療組均用0.5 ml致敏混懸液〔含OVA 8 μg和AL(OH)3干粉4 mg〕腹腔內(nèi)共注射2次，注射間隔時間為5 d(d 1及d 6)，對照組用生理鹽水0.5 ml代替。自d 18開始激發(fā)，哮喘組和雷帕霉素治療組予以1%OVA生理鹽水5 ml霧化吸入，每日1次，每次30 min，分別持續(xù)7 d。對照組用生理鹽水5 ml代替OVA處理。激發(fā)之前正常對照組和哮喘模型組氣道內(nèi)給予生理鹽水0.5 ml;雷帕霉素治療組分別在激發(fā)1 d前開始氣道內(nèi)給予稀釋于生理鹽水中的4 mg·kg－1的雷帕霉素，每天1次，給予4 d。末次激發(fā)24 h后處死小鼠，剪開頸部皮膚，并于氣管正中處剪一小口，插入氣管套管。以磷酸鹽緩沖液1 ml行支氣管肺泡灌洗，來回沖洗3次，收集BALF。混勻BALF，3 000 r·min－1離心10 min，取上清液，－80℃低溫保存，待測細胞因子。

2.2 BALF 中細胞因子 IL-4、IL-5、IL-13 含量的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定，具體操作按試劑盒說明書進行，結果以ng·L－1表示。

2.3 組織學檢查肺組織經(jīng)甲醛固定后，常規(guī)脫水包埋，并做蘇木精-伊紅(HE)染色和PAS染色。每只小鼠隨機選3張肺組織切片，每張切片以單盲法隨機選取橫斷面較圓、直徑100 μm的細支氣管5支觀察。

2.4 免疫組化流程及半定量測定使用鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶連結法(streptavidin perosidase，SP法)進行檢測。組織切片脫蠟后置于0.01 mol·L－1檸檬酸緩沖液(pH值6.0)微波15 min抗原修復，冷卻后用3 g·L－1H2O2處理30 min(37℃)，滅活內(nèi)源性過氧化物酶;1∶10正常馬血清封閉30 min(37℃);棄上清液后直接加抗鼠mTOR(1∶400稀釋)一抗，4℃過夜;依次加羊抗鼠抗體與辣根過氧化酶室溫下各孵育30 min(37℃);滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，室溫顯色。結果判定為陽性細胞呈棕色，陽性信號為胞質(zhì)/胞核內(nèi)棕黃色顆粒。采用Image-pro Plus6.0圖像分析軟件測定mTOR含量，以校正后的平均光密度表示。平均光密度為累積光密度(IOD SUM)除以選定區(qū)域的面積(area SUM)。

2.5 肺組織mTOR蛋白表達檢測取200 mg肺組織置入分別加入蛋白裂解液0.5 ml勻漿，4℃12 000×g離心2 min，取上清液測蛋白濃度。取25 g蛋白煮沸5 min后，經(jīng)15%SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，在5%脫脂奶粉－PBST溶液室溫下封閉2 h，加入mTOR抗體4℃孵育過夜，洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，稀釋度為1∶200，37℃，1 h。洗膜后在暗室中加 ECL發(fā)光試劑，X線膠片曝光1～2 min后顯影、定影。雜交信號在圖像分析系統(tǒng)中進行光密度掃描。應用β-actin作為蛋白上樣量對照，其余組與其相比得到相對量，取均值。

2.6 氣道高反應的檢測所有動物于OVA吸入后24 h行支氣管激發(fā)實驗。給予4%戊巴比妥，按60 mg·kg－1BW劑量行腹腔注射麻醉，待其疼痛反射消失后，將小鼠仰臥位置于實驗動物肺功能檢測分析系統(tǒng)(AniRes2005，北京貝蘭博科技有限公司)的體積描記箱內(nèi)，切開皮膚分離皮下組織，暴露氣管連接動物呼吸機，插入氣管插管。游離頸外靜脈并穿刺，固定針柄，封閉體描箱。按濃度倍增法依次靜脈注射甲乙酰膽堿(methacholine 2.5、5.0、10、25、50 g·L－1)，頸外靜脈每次注射0.2 ml。待氣道阻力降至正常后開始下一劑量，記錄波形及數(shù)據(jù)。

2.7 統(tǒng)計學處理數(shù)值用±s表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，各組計量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法。

3 結果

3.1 BALF 中細胞因子 IL-4、IL-5、IL-3 的變化從Tab 1中可見，哮喘模型組小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-3水平升高，與正常對照組比較，差異有顯著性(P＜0.05);雷帕霉素干預組大鼠BALF中細胞因子IL-4、IL-5、IL-3水平降低，與哮喘模型組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。

Tab 1 Changes of IL-4，IL-5，IL-3 level in BALF(±s，n=10)

Tab 1 Changes of IL-4，IL-5，IL-3 level in BALF(±s，n=10)

##P＜0.01 vs saline group;*P＜0.05 vs OVA group

Group IL-4/ng·L－1 IL-5/ng·L－1 IL-3/ng·L －1Saline 14.9 ±1.3 19.8 ±4.3 21.2 ±11.5 OVA 56.5 ±4.2## 62.7 ±8.6## 86.4 ±14.7##Rapamycin 47.9 ±3.4* 50.2 ±6.3* 60.1 ±11.3*

3.2 肺組織的病理學改變光鏡下觀察HE染色、PAS染色結果顯示，F(xiàn)ig 1的A、D為正常對照組氣道無明顯改變。Fig 1的B、E為哮喘模型組氣道壁及氣道平滑肌明顯增厚，杯狀細胞化生，炎癥細胞(尤其嗜酸性粒細胞)明顯增多，黏膜下層增寬，黏膜上皮增生，管腔被黏液所堵塞與正常對照組比較差異有顯著性(P＜0.01):Fig 1的C、F雷帕霉素治療組上述改變較哮喘組明顯減輕，與模型組比較差異有顯著性(P＜0.01)。

Fig 1 Effect of Rapamycin on infiltration of inflammatory cells(×200)

3.3 免疫組織化學染色檢測肺組織mTOR蛋白表達免疫組織化學染色結果顯示正常對照組(Fig 2A)小鼠支氣管mTOR蛋白呈淡棕黃色弱免疫反應表達。哮喘模型組(Fig 2B)小鼠氣道平滑肌、嗜酸性粒細胞，杯狀細胞mTOR蛋白呈強棕黃色強免疫反應表達，與正常對照組比較差異有顯著性(P＜0.01)。雷帕霉素治療組Fig 2C與哮喘模型組相比較，氣道平滑肌、嗜酸性粒細胞，杯狀細胞mTOR蛋白表達明顯減弱，與模型組比較差異有顯著性(P＜0.01)。

3.4 肺組織mTOR蛋白表達水平哮喘模型組肺組織的mTOR蛋白表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);哮喘組肺組織的mTOR蛋白表達高于雷帕霉素治療組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見Fig 3。

3.5 雷帕霉素對氣道高反應的影響隨著甲乙酰膽堿濃度的成倍遞增，模型組與對照組的吸氣阻力均有增加，當濃度到達10 g·L－1以上時，模型組與對照組比較差異有顯著性(P＜0.01)，見Fig 4。

4 討論

支氣管哮喘是由多種炎癥細胞和多種炎癥介質(zhì)參與的慢性氣道炎癥。Th2細胞亞群主要產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-3等細胞因子，可誘導嗜酸性粒細胞的產(chǎn)生、聚集、活化、脫顆粒，輔助B細胞產(chǎn)生IgE等，介導體液免疫應答及Ⅰ型變態(tài)反應［5］。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)雷帕霉素干預組與哮喘模型組比較BALF中炎癥細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞計數(shù)以及IL-4、IL-5、IL-3水平降低。

Fig 2 Immunohistochemistry staining of mTOR protein in lung(×200)

Fig 3 Effect of mTOR protein expression in lung tissues and of OVA-sensitized and-challenged mice

Fig 4 Effect of Rapamycin on airway hyperresponsivness(AHR)to methacholine

雷帕霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，能抑制許多細胞的增生，包括T細胞分化、氣道平滑肌細胞、血管內(nèi)皮細胞等［6］。雷帕霉素在哺乳動物細胞內(nèi)的靶點是mTOR，進入細胞與FKBP12形成RPM/FKBP12復合物，復合物結合mTOR并以滅其功能，從而阻斷了mTOR介導的信號通路。近期研究表明，T細胞缺乏mTOR時不能轉(zhuǎn)變?yōu)門h1、Th2或Th17效應細胞［7］。這些研究指出mTOR在T細胞分化過程中扮演著極其重要的角色。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)在哮喘模型組嗜酸性粒細胞過度表達mTOR蛋白，說明嗜酸性粒細胞的活化、聚集與mTOR蛋白的激活密切相關。IL-4是誘導Th2淋巴細胞分化的關鍵細胞因子，IL-4誘導B細胞分化為漿細胞，進而產(chǎn)生IgE，最終形成以IgE依賴為特征的速發(fā)型變態(tài)反應及以嗜酸性粒細胞浸潤為主的慢性氣道炎癥［8］;IL-5通過調(diào)節(jié)嗜酸性粒細胞的活化、聚集、脫顆粒等參與哮喘的發(fā)生和發(fā)展［9］;研究表明IL-3產(chǎn)于Th2細胞、嗜酸性粒細胞，是支氣管哮喘的中樞調(diào)點，氣道內(nèi)IL-3水平增加、其表達與氣道內(nèi)嗜酸性粒細胞增加數(shù)量產(chǎn)生有關［10］。以上研究表明mTOR的激活可促進嗜酸性粒細胞活化與聚集，并進一步誘導釋放和激活 IL-4、IL-5、IL-3等炎癥細胞因子的釋放。

研究證明mTOR/p70S6K信號通路在氣道平滑肌的生長和增殖中起著關鍵作用，可能是防止哮喘中平滑肌重塑的選擇性靶點［11］。本實驗中我們研究發(fā)現(xiàn)哮喘模型組增生的氣道平滑肌過度表達mTOR蛋白，說明mTOR激活可誘導氣道平滑肌增生、肥大。氣道高反應性(AHR)是哮喘的特征性表現(xiàn)之一，它的出現(xiàn)表示氣道平滑肌收縮閾值降低。研究證實AHR和氣道平滑肌增生、肥大密切相關［12］，而氣道炎癥可誘導氣道平滑肌增生與肥大［13］。通過實驗我們發(fā)現(xiàn)雷帕霉素通過抑制mTOR信號通路降低Th2類細胞因子的產(chǎn)生，近而減輕了氣道炎癥，同時減輕了由于炎癥本身引起的氣道阻力增加。對于雷帕霉素如何調(diào)節(jié)平滑肌細胞的收縮有待進一步探討。

綜上所述，我們推測雷帕霉素對氣道平滑肌增殖和氣道杯狀細胞過度活化的抑制作用是通過阻斷mTOR信號途徑而實現(xiàn)的。

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