江蘇草莓灰霉病菌對5 種殺菌劑的抗藥性

潘以樓， 朱桂梅， 郭 建

(江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇 句容212400)

灰霉病是由葡萄孢屬真菌引起的一種世界性的重要病害［1-2］。草莓灰霉病是草莓上為害最普遍、最嚴重的病害之一，一般減產(chǎn)10.0% ～30.0%，重者達50%以上［3］。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)對草莓灰霉病具有抗性的品種［4］。目前生產(chǎn)上主要應(yīng)用多菌靈、腐霉利、乙霉威、異菌脲、嘧霉胺等殺菌劑控制草莓灰霉?。?-6］?；颐共【蚓哂屑闹鞣秶鷱V、繁殖快和遺傳變異頻繁等特點，使其極易對殺菌劑產(chǎn)生抗性［4］。據(jù)報道，草莓灰霉病菌對多菌靈［7］、腐霉利［8］、異菌脲［9］、乙霉威［10］均已產(chǎn)生抗藥性，其中對多菌靈抗藥性較強。嘧霉胺在蔬菜上應(yīng)用的時間不長，但番茄等茄科蔬菜灰霉病菌對其也產(chǎn)生了抗藥性［11-12］;本世紀初，嘧霉胺開始在江蘇草莓種植區(qū)使用，2007 年浙江省2 個地區(qū)草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性為24%［13］，到目前為止江蘇地區(qū)草莓灰霉病菌對嘧霉胺抗藥性發(fā)生狀況還未見報道。

雖然已有研究報道草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲、菌核凈、乙霉威存在抗藥性［7-9］，其中對多菌靈抗性菌株的分布有比較詳細的研究［7］，而對腐霉利、異菌脲、菌核凈、乙霉威抗性菌株的分布還未見詳細報道。

為了明確江蘇草莓灰霉病菌對殺菌劑抗藥性的現(xiàn)狀，筆者在2011 ～2012 年在江蘇草莓主產(chǎn)區(qū)采集、分離草莓灰霉病菌菌株，在室內(nèi)測定這些菌株對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利、異菌脲、乙霉威的敏感性，為草莓灰霉病的防治提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2011 年和2012 年5 月，在江蘇草莓主產(chǎn)區(qū)句容市天王鎮(zhèn)、句容市白兔鎮(zhèn)、宜興市宜城鎮(zhèn)、盱眙縣三河鎮(zhèn)和東海縣黃川鎮(zhèn)采集草莓灰霉病病果，用滅菌的木質(zhì)牙簽輕觸病果上灰霉病菌霉層，迅速放入馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)斜面上帶回實驗室。一個病果作為一個菌株，用PSA 培養(yǎng)基進行單孢純化后轉(zhuǎn)至PSA 斜面上，保存于4 ℃冰箱中供試。

1.2 培養(yǎng)基

PSA 培養(yǎng)基［14］用于草莓灰霉病菌分離、菌株保存及草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的敏感性測定。

Chapeland 培養(yǎng)基［11，15］用于草莓灰霉病菌對嘧霉胺的敏感性測定。

1.3 供試藥劑

95.0 %嘧霉胺(Pyrimethanil)原藥，由江蘇豐登農(nóng)藥有限公司生產(chǎn);96.0%多菌靈(Carbendazim)原藥，由上海升聯(lián)化工有限公司生產(chǎn);98.0%腐霉利(Procymidone)原藥，由江西禾益化工有限公司生產(chǎn);96.2%異菌脲(Iprodione)原藥，由江蘇快達農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn);95.0%乙霉威(Diethofencarb)原藥，由江蘇蘇化集團新沂農(nóng)化有限公司生產(chǎn)。

多菌靈原藥用0.1 mol/L HCl 溶液溶解成1 000 μg/ml母液。其他原藥均用少量丙酮溶解原藥配制成1 000 μg/ml 的母液，并在母液中加入2.0%Tween-80 作為乳化劑。

1.4 草莓灰霉病菌對嘧霉胺的敏感性測定

采用菌絲生長速率法測定草莓灰霉病菌對嘧霉胺的敏感性［16］。用滅菌蒸餾水稀釋嘧霉胺母液制成系列濃度的藥液，并加入45 ℃Chapeland 培養(yǎng)基中制成最終含藥量為0 μg/ml、0.003 2 μg/ml、0.016 0 μg/ml、0.080 0 μg/ml、0.400 0 μg/ml、2.000 0 μg/ml、10.000 0 μg/ml的含藥平皿。從PSA 平板上培養(yǎng)3 d 的草莓灰霉病菌菌落邊緣，取直徑為5 mm的菌碟，并把其菌絲面向下接種于含藥平板上，每皿1 個菌碟，每處理3 次重復。于25 ℃培養(yǎng)4 d 后，用十字交叉法量取菌落直徑(mm)，取平均值后再減去原菌碟直徑(5 mm)后，計算抑制率，抑制率=［(未加藥處理的菌落直徑－加藥處理的菌落直徑)/未加藥處理的菌落直徑］×100%。

采用幾率值法，通過濃度對數(shù)值(x)和抑制率機率值(Y)之間的線性回歸關(guān)系，計算嘧霉胺對草莓灰霉病菌各菌株的抑制中濃度(EC50)。

1.5 草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的抗性檢測

采用最低抑制濃度法(MIC)檢測草霉灰霉病菌對各藥劑的抗藥性［7］。多菌靈的鑒別濃度設(shè)置為5.000 0 μg/ml［7］，異菌脲的鑒別濃度設(shè)置為5.000 0 μg/ml［9］，乙 霉 威 的 鑒 別 濃 度 設(shè) 置 為0.500 0 μg/ml［10］，腐 霉 利 的 鑒 別 濃 度 設(shè) 置 為10.000 0 μg/ml［10］。PSA 培養(yǎng)基在55 ℃時加入各藥劑，分別制成含多菌靈5.000 0 μg/ml、異菌脲5.000 0 μg/ml、乙霉威0.500 0 μg/ml、腐霉利10.000 0 μg/ml的含藥平皿。將待檢測的灰霉病菌各菌株在PSA 平皿上培養(yǎng)3 d 后取直徑為5 mm 的菌片移至各含藥平皿上，在25 ℃下培養(yǎng)3 d，不能或幾乎不能在該鑒別濃度上正常生長的為敏感菌株，能正常生長的為抗性菌株。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有計算均用DPS 軟件進行，并用Excel 進行數(shù)據(jù)相關(guān)性分析和制圖。

2 結(jié)果

2.1 草莓灰霉病菌對嘧霉胺的敏感性分布

2011 年采集的草莓灰霉病菌133 個菌株對嘧霉胺的敏感性差異較大，嘧霉胺抑制灰霉病菌菌絲生 長 的EC50值 最 低 為0.015 9 μg/ml，最 高 為14.134 9 μg/ml。嘧霉胺對2012 年采集的草莓灰霉病菌206 個菌株抑制菌絲生長的EC50值為0.012 5 ～20.195 5μg/ml。2011 和2012 年采集的草莓灰霉病菌菌株對嘧霉胺的敏感性(EC50值)分布表現(xiàn)為敏感菌株比例和高抗菌株比例較高，而中間的低抗菌株較少。

2.2 草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性

2011 年和2012 年在江蘇5 個草莓產(chǎn)區(qū)分別采集133 個菌株和206 個菌株，檢測這些菌株對嘧霉胺的敏感性，按照嘧霉胺抑制菌絲生長的抑制中濃度(EC50值)大小區(qū)分菌株對嘧霉胺的抗性程度。菌株對嘧霉胺抗性程度依據(jù)紀明山等［17］所報道的灰霉病菌對嘧霉胺的敏感基線值(0.0911 0 μg/ml)進行判別，當菌株EC50值小于敏感基線值5 倍，即EC50值小于0.455 5 μg/ml 為敏感菌株;當菌株的EC50值處于敏感基線值5 ～10 倍，即EC50值在0.455 5 ～0.911 0 μg/ml 為 低 抗 菌 株;當 菌 株 的EC50值 處 于 敏 感 基 線 值10 ～40 倍，即EC50在0.911 0 ～3.644 0 μg/ml為中抗菌株;當某菌株的EC50值大于敏感基線值40 倍，即EC50高于3.644 0 μg/ml為高抗菌株［18］。結(jié)果(表1)顯示，2011 年133 個菌株中，對嘧霉胺敏感菌株占22.6%，對嘧霉胺低抗菌株、中抗菌株和高抗菌株分別占15.8%、39.1%和23.3%;2012 年206 個菌株中，對嘧霉胺敏感菌株占34.0%，對嘧霉胺低抗菌株、中抗菌株和高抗菌株分別占1.0%、5.8%和59.2%。檢測結(jié)果表明，在江蘇草莓主產(chǎn)區(qū)，草莓灰霉病菌對嘧霉胺已產(chǎn)生較高的抗藥性，抗性菌株比例在2011 年和2012 年分別達到77.4%和66.0%。

表1 江蘇5 個草莓產(chǎn)區(qū)草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性Table 1 Resistances of B. cinerea from strawberry in 5 regions of Jiangsu to pyrimethanil

從5 個地點采集的草莓灰霉病菌菌株來看，宜興市宜城區(qū)草莓灰霉病菌對嘧霉胺抗藥性菌株所占比例最高，2011 年和2012 年抗性菌株所占比例分別為100%(9.1% +39.4% +51.5%)和90.2%(0 +2.0%+88.2%)，且絕大多數(shù)菌株為中抗和高抗菌株;東海縣黃川鎮(zhèn)草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗性株比例最小，2011 年和2012 年抗性菌株所占比例分別為55.5%(14.8% +37.0% +3.7%)和43.4% (0 +3.8% +39.6%)(表1)。2 年的檢測結(jié)果表明，草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性有明顯的地域差異，這可能與各地嘧霉胺的使用年限和施藥量有一定的相關(guān)性。

2.3 草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的抗藥性

2012 年從江蘇5 個草莓主產(chǎn)區(qū)采集的206 個灰霉病菌菌株，采用最低抑制濃度法(MIC)檢測這些菌株對多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的抗藥性。結(jié)果(表2)顯示，在206 個菌株中，抗多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的菌株分別占67.5%、11.2%、63.6%和59.7%，其中灰霉病菌對腐霉利的抗藥性菌株所占比例最小。表明，在江蘇草霉產(chǎn)區(qū)，應(yīng)用異菌脲、多菌靈、乙霉威防治灰霉病的防病效果較低，已無實用價值。

表2 草莓灰霉病菌對5 種殺菌劑的抗藥性Table 2 Resistance of B. cinerea from strawberry to five fungicides

2.4 草莓灰霉病菌對5 種殺菌劑抗藥性的表現(xiàn)型

2012 年采集的206 個草莓灰霉病菌菌株，根據(jù)它們對多菌靈、腐霉利、異菌脲、乙霉威和嘧霉胺這5 種殺菌劑的抗、感性程度，可以分為17 種表現(xiàn)型(表3)。對多菌靈、異菌脲、嘧霉胺表現(xiàn)抗藥性及對腐霉利、乙霉威表現(xiàn)敏感的菌株有63 個，所占比例為30.6%;對多菌靈、異菌脲、嘧霉胺、乙霉威表現(xiàn)抗藥性及僅對腐霉利表現(xiàn)敏感的菌株有45 個，所占比例為21.8%;對乙霉威表現(xiàn)抗藥性及對多菌靈、異菌脲、腐霉利和嘧霉胺表現(xiàn)敏感的菌株有20 個，占9.7%;對多菌靈、腐霉利、異菌脲表現(xiàn)敏感及對乙霉威和嘧霉胺表現(xiàn)抗性的菌株有17 個，占8.3%;對多菌靈、乙霉威、嘧霉胺表現(xiàn)抗藥性及對腐霉利和異菌脲表現(xiàn)敏感的菌株13 個，占6.3%;其他表現(xiàn)型的菌株數(shù)均在10 個以下，所占比例較低。

表3 草莓灰霉病菌對5 種殺菌劑抗藥性的表現(xiàn)型Table 3 Resistance types of B. cinerea from strawberry to five fungicides

3 討論

3.1 草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性

嘧霉胺在蔬菜和草莓上用于防治灰霉病已有十多年，在蔬菜灰霉病菌，特別是番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性已有許多報道［11-12，17-18］，而草莓灰霉病菌對嘧霉胺抗藥性研究卻鮮有報道。我們2011 ～2012 年的研究結(jié)果表明，在江蘇草莓主產(chǎn)區(qū)，草莓灰霉病菌對嘧霉胺也產(chǎn)生了較高的抗藥性，2011 年和2012 年抗性菌株的比例分別達到77.4% 和66.0%。表明，生產(chǎn)上應(yīng)用嘧霉胺防治草莓灰霉病的防治效果較低，應(yīng)篩選新的殺菌劑用于草莓灰霉病的防治。

3.2 草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲、乙霉威的抗藥性

2012 年我們應(yīng)用MIC 法測定了206 個草莓灰霉病菌菌株對多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉胺的抗藥性，結(jié)果表明抗多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的菌株分別占67.5%、11.2%、63.6% 和59.7%。表明，在江蘇草莓主產(chǎn)區(qū)，草莓灰霉病菌對多菌靈、異菌脲、乙霉威均產(chǎn)生了較高的抗藥性，應(yīng)用這3 種藥劑防治草莓灰霉病意義不大。

3.3 殺菌劑的交互抗藥性

據(jù)報道，乙霉威與多菌靈存在負交互抗性［19］。本檢測結(jié)果表明，在166 個抗多菌靈的菌株中，74個菌株對乙霉威仍表現(xiàn)抗性，92 個對乙霉威表現(xiàn)敏感。這可能與灰霉病菌對多菌靈抗性的突變位點不同有關(guān)［20］。異菌脲和腐霉利同屬于二甲酰亞胺類殺菌劑，其作用機理可能是通過滲透壓傳導途徑發(fā)揮抑菌作用，這2 種殺菌劑間存在交互抗性［13］。在本試驗檢測的206 個菌株中，對異菌脲和腐霉利均表現(xiàn)敏感的有71 個菌株;對這2 種殺菌劑均表現(xiàn)抗性的有20 個菌株;而對異菌脲表現(xiàn)抗性及對腐霉利表現(xiàn)敏感的有112 個菌株;對異菌脲表現(xiàn)敏感及對腐霉利表現(xiàn)抗性的有3 個菌株。表明，草莓灰霉病菌對同屬二甲酰亞胺類的殺菌劑并不完全表現(xiàn)交互抗藥性，其機理還有待進一步研究。

3.4 草莓灰霉病菌對殺菌劑的多重抗藥性

草莓灰霉病菌對多菌靈、乙霉威、腐霉利、異菌脲的室內(nèi)誘變抗性菌株和田間抗性菌株報道較多［7-10］，對多菌靈和乙霉威［10］、多菌靈和異菌脲［21］、多菌靈和腐霉利［22］的雙抗菌株也有報道，而對多種殺菌劑的多重抗性菌株的報道還較少。我們2012年測定206 個草莓灰霉病菌菌株對多菌靈、乙霉威、腐霉利、異菌脲和嘧霉胺抗藥性，沒有檢測到對這5種殺菌劑均敏感的野生菌株;對這5 種殺菌劑均表現(xiàn)抗性的多重抗性菌株6 個，占2.9%;4 重抗性菌株61 個，占29.6%;3 重抗性菌株77 個，占37.4%;雙重抗性菌株34 個，占16.5%;單抗菌株28 個，占13.6%。原因可能是草莓灰霉病防治中，所使用殺菌劑種類較多，田間出現(xiàn)多重抗性的菌株比例上升。

3.5 防治草莓灰霉病新殺菌劑的篩選

本研究結(jié)果表明草莓灰霉病菌對目前生產(chǎn)應(yīng)用的5 種殺菌劑均產(chǎn)生了抗藥性，這是近年來這些藥劑對草莓灰霉病防治效果下降的主要原因。許多研究者也在篩選新殺菌劑用于草莓灰霉病的防治，如啶酰菌胺(Boscalid)、咯菌腈(Fludioxonil)對草莓灰霉病菌具有較高的毒力和較好的田間防病效果［23-25］;嘧菌環(huán)胺(Cyprodinil)對葡萄灰霉病菌具有較高抑菌活性和田間防病效果［26］，嘧菌環(huán)胺抑制123 個草莓灰霉病菌菌株菌絲生長的平均EC50值為(0.028 3 ±0.005 3)μg/ml。這些新殺菌劑在草莓灰霉病防治中的應(yīng)用，首先要考慮這些新殺菌劑與目前生產(chǎn)上應(yīng)用的殺菌劑是否存在交互抗性，以及這些新藥劑的抗藥性風險。

植物病原菌對殺菌劑的抗性風險是由藥劑和病菌共同決定的，如藥劑的選擇壓力和作用機制、病菌自身的抗藥性頻率、抗藥性突變體的適合度和交互抗性等［27］。在沒有明確草莓灰霉病菌對這些新殺菌劑抗性風險情況下，在應(yīng)用中應(yīng)該遵循殺菌劑使用準則，與其他不同作用機制的殺菌劑輪換使用或交替使用，以延緩病菌抗藥性的產(chǎn)生。

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