20-羥基蛻皮甾酮對異色瓢蟲幼蟲的活力和保護(hù)酶活性的影響

龐海玉， 宇 佳， 遲德富， 李曉燦， 錢晶晶， 張超群

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040)

為了尋找更為理想的殺蟲劑以便在害蟲綜合管理(IPM)中應(yīng)用，自20 世紀(jì)世界各國均致力于無公害的“第三代殺蟲劑”研究。結(jié)果表明，某些植物可以產(chǎn)生阻礙昆蟲正常生長發(fā)育等生命活動的物質(zhì)［1-5］，昆蟲蛻皮激素類似物就是其中重要的一類。蛻皮激素又稱為蛻皮甾酮，其主要作用是啟動昆蟲蛻皮［6-7］。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)外源20-羥基蛻皮甾酮(20-羥基蛻皮激素，20E)也能夠影響昆蟲的蛻皮，甚至使蛻皮提前。遲德富等［8］于2002 年發(fā)現(xiàn)，筋骨草中植物源蛻皮激素對楊干象2 齡幼蟲具有殺蟲作用。對于不同昆蟲，外源蛻皮甾酮的有效濃度顯著不同［9］。蛻皮激素類似物作為一種昆蟲激素類化合物，在殺滅昆蟲過程中很可能沒有專一選擇性，導(dǎo)致益蟲死亡。針對這一問題，研究20E對分布范圍廣泛、種群數(shù)量大、控制力強的瓢蟲的安全性及安全劑量就顯得十分必要。

異色瓢蟲［Harmonia axyridis (Pallas)］在俄羅斯、蒙古等國及中國各地均有分布，它對蚜蟲、葉螨等重要害蟲有很強的捕食能力，是重要的益蟲［10-11］。本試驗擬研究20E 對異色瓢蟲幼蟲的存活情況和捕食量及體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性的影響，旨在確定田間施用植物源20E 對異色瓢蟲的安全劑量。

1 材料與方法

1.1 試蟲與飼養(yǎng)

供試異色瓢蟲蟲源由北京市農(nóng)林科學(xué)院植保所提供，成蟲飼養(yǎng)于塑料養(yǎng)蟲盒(15.0 cm×10.0 cm×5.5 cm)中，每盒20 ～30 頭，每12 h 或24 h 更換帶有足量豌豆修尾蚜［Megoura japonica(Matsumura)］的豌豆苗1 次。成蟲產(chǎn)卵后，將卵取出置于養(yǎng)蟲籠中(不銹鋼框架+120 目尼龍網(wǎng)，60 cm×40 cm×40 cm)，籠中放有接過蚜蟲的蠶豆苗，異色瓢蟲卵在籠內(nèi)孵化，幼蟲捕食籠內(nèi)的蚜蟲，完成幼蟲階段的發(fā)育，待羽化后轉(zhuǎn)移到養(yǎng)蟲盒中繼續(xù)飼養(yǎng)第2 代，在實驗室飼養(yǎng)3 代后選擇同日齡異色瓢蟲幼蟲進(jìn)行試驗。

1.2 供試藥劑

20E 采用陜西森弗生物技術(shù)有限公司的露水草提取物，為含98% 20E 的粉末，生產(chǎn)批號為RMLSCE111110-2。稱取5 mg 20E，加250 μl 無水乙醇充分溶解，再加去離子水至5 ml 配制成母液。用去離子水稀釋成工作液，稀釋濃度分別為0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L和10.0 mg/L。

考馬斯亮藍(lán)G-250、VB2、Met 均購自Amresco公司;SDS、PVP、PTU 購自Sigma 公司;愈創(chuàng)木酚和鄰苯二酚購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;H2O2購自國藥集團;其他藥品均為分析純。

1.3 毒力測定

采用噴霧法，選取同一天蛻皮的4 齡異色瓢蟲幼蟲以及帶有足量蚜蟲的蠶豆苗放入養(yǎng)蟲籠中，用稀釋后的20E 進(jìn)行噴霧處理，每株蠶豆苗噴灑5 ml，以噴灑同劑量不添加20E 的5%乙醇作為對照。處理后每12 h，更換未經(jīng)處理的攜帶有足量蚜蟲的蠶豆苗飼喂幼蟲。飼喂72 h，分別于處理后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 時檢查死亡數(shù)。蟲體變黑，用毛筆輕觸無反應(yīng)或不能活動的視為死亡。數(shù)據(jù)用SPSS 軟件處理，計算致死中濃度(LC50)及其95%置信區(qū)間。分別于處理后4 h、8 h、12 h、24 h、48 h 取樣。每濃度處理100 頭4 齡瓢蟲幼蟲，重復(fù)3 次。試驗在溫度為(25 ±1)℃、相對濕度為(70 ±1)%、光照/黑暗為16/8條件的人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行。

1.4 20E 對異色瓢蟲幼蟲生長發(fā)育的影響

1.4.1 存活量 選取同一天蛻皮、長勢一致的4 齡幼蟲以及帶有足量蚜蟲的蠶豆苗放入養(yǎng)蟲籠中，用稀釋后的20E 進(jìn)行噴霧處理，每株噴灑5 ml，處理后每12 h 更換未經(jīng)處理的攜帶有足量蚜蟲的蠶豆苗飼喂幼蟲。分別在處理后第6 h、12 h、24 h、48 h和72 h 觀察記錄其死亡數(shù)。每濃度處理15 頭幼蟲，重復(fù)3 次。試驗條件及對照組試驗同1.3方法。

1.4.2 捕食量 在培養(yǎng)皿底墊一張濾紙，將帶有1頭蛻皮后6 h 的異色瓢蟲4 齡幼蟲和50 頭成蚜的蠶豆苗放入培養(yǎng)皿內(nèi)，用稀釋后的20E 進(jìn)行噴霧處理，每株噴灑5 ml，每處理重復(fù)6 次。處理后每隔12 h 清點剩余的成蚜數(shù)量。處理后每12 h 更換未噴施20E并攜帶有50 頭成蚜的蠶豆苗飼喂瓢蟲幼蟲。共飼養(yǎng)72 h，然后統(tǒng)計每12h 內(nèi)每頭4 齡瓢蟲幼蟲取食的成蚜數(shù)量。試驗條件及對照組試驗同方法1.3。

1.5 植物源蛻皮激素類似物對異色瓢蟲幼蟲酶活性的影響

1.5.1 樣品處理 采用噴霧法，選取同一天蛻皮、個體長勢一致的4 齡幼蟲以及帶有足量蚜蟲的蠶豆苗放入養(yǎng)蟲籠中，用稀釋后的20E 進(jìn)行噴霧處理，每株噴灑5 ml，每處理12 h，更換未經(jīng)處理的攜帶有足量蚜蟲的蠶豆苗飼喂幼蟲。飼喂48 h，于處理后4 h、8 h、12 h、24 h、48 h 取樣，并于－80 ℃冰箱中保存。每濃度處理15頭幼蟲，重復(fù)3 次。試驗條件同方法1.3。

1.5.2 POD 活性 酶液制備:從－80 ℃超低溫冰箱中取出不同處理濃度及處理時間的4 齡試蟲各3頭，解凍，每頭加1 ml 0.05 mol/L(pH 7.0)預(yù)冷的磷酸緩沖液(含1% PVP、0.04% 苯基硫脲和10 mmol/L EDTA)，冰浴上研磨至勻漿2 ～3 min，4 ℃、10 000 r/min離心15 min 后取上清為待測酶液。

活性測定:酶活性測定參考Simon 等［12］方法并略作修改。在試管中分別加入0.1 mol/L(pH 6.1)磷酸緩沖液1.8 ml、0.1%愈創(chuàng)木酚1.0 ml、待測酶液0.3 ml 和0.08% H2O21.0 ml，混勻后，室溫反應(yīng)20 min，以蒸餾水為對照，于470 nm 處測定OD 值。每個處理重復(fù)測定3 次。

1.5.3 SOD 活性 酶液制備方法同方法1.5.2。

活力測定:酶活測定參考Beauchamp 等［13］方法并略作修改。取3 ml 反應(yīng)液［含50 mmol/L (pH 6.7)的磷酸緩沖液、13 mmol/L甲硫氨酸、10 mmol/L EDTA 和75 μmol/L硝基氮藍(lán)四唑］，加0.07 ml 原酶液，再加0.6 ml 0.4 μmol/L的核黃素，4 000 lx 下光照15 min 后，立即避光迅速測定OD560值，以未光照的相同反應(yīng)管為對照管，重復(fù)測定3 次，計算SOD酶活性，以達(dá)到50%抑制率所需的酶量為1 個酶活性單位(U)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 軟件和Microsoft excel 進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 20E 對異色瓢蟲幼蟲毒力的測定

20E 對異色瓢蟲4 齡幼蟲的致死中濃度(LC50)及其95%置信區(qū)間見表1。可以看出:20E 對異色瓢蟲4 齡幼蟲表現(xiàn)出較高的毒性，4 齡幼蟲對20E敏感，隨著處理時間的延長，LC50逐漸降低。參照6 h 的LC50作為試驗設(shè)計的第二大濃度，48 h LC50作為試驗設(shè)計的中間濃度，72 h 的LC50作為試驗設(shè)計的第二小濃度，設(shè)計了0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L等5 個20E 濃度處理異色瓢蟲4 齡幼蟲，來測定20E 對其生長發(fā)育和體內(nèi)酶活性的影響。

表1 20E 對異色瓢蟲4 齡幼蟲的毒性Table 1 Toxicity of 20E to the 4th instar larvae of Harmonia axyridis Pallas

2.2 20E 對異色瓢蟲幼蟲生長發(fā)育的影響

2.2.1 幼蟲存活量 由圖1 可以看出，0.1 mg/L 20E 噴灑蠶豆苗后，處理組與對照組的異色瓢蟲4齡幼蟲存活量在所有時間內(nèi)均沒有顯著差異。0.5 mg/L處理后6 h，幼蟲平均存活量與對照組差異不顯著(P ＞0.05)，但從處理后12 h 開始，幼蟲死亡數(shù)增加，到第72 h 時幼蟲存活量與對照組呈極顯著差異(P ＜0.01)。用1.0 ～10.0 mg/L的20E 處理后超過6 h 幼蟲存活量均極顯著低于對照組。特別是用5.0 mg/L和10.0 mg/L的20E 處理后72 h，幼蟲全部死亡。說明20E 濃度超過0.5 mg/L時對異色瓢蟲4 齡幼蟲具有顯著的殺傷作用，且濃度越高殺傷作用越大。

2.2.2 幼蟲捕食量 如圖2 所示，0. 1 mg/L 20E 噴灑蠶豆苗后24 h 以內(nèi)，處理組異色瓢蟲4齡幼蟲的捕食量顯著低于對照組(P ＜0. 05)，之后沒有顯著差異。說明該濃度處理對異色瓢蟲4齡幼蟲的捕食量影響時間短，且很快恢復(fù)到對照水平。

0.5 mg/L 20E 處理后36 h 以內(nèi)捕食量顯著低于對照組，之后捕食量明顯回升，48 ～60 h 捕食量恢復(fù)到對照組水平，到第72 h，捕食量又有所下降。說明該濃度處理對異色瓢蟲4 齡幼蟲的捕食量產(chǎn)生了一定程度的影響。

當(dāng)20E 處理濃度為1.0 mg/L時，幼蟲捕食量在試驗時間段始終是顯著(P ＜0.05)或極顯著(P ＜0.01)低于對照組。說明該濃度處理對異色瓢蟲4齡幼蟲的捕食量產(chǎn)生了顯著影響。

20E 處理濃度為5.0 mg/L和10.0 mg/L時，絕大多數(shù)時間段內(nèi)，捕食量都極顯著低于同期對照組(P ＜0.01)，而且60 h 后瓢蟲幼蟲出現(xiàn)了死亡情況。說明這兩種高濃度處理對異色瓢蟲的4 齡幼蟲捕食量產(chǎn)生了極大影響。

另外，從圖2 可明顯看出，在處理后同一時間內(nèi)，隨著20E 濃度的增加，異色瓢蟲捕食量呈顯著降低趨勢。

圖1 20E 處理后異色瓢蟲4 齡幼蟲存活量的變化Fig.1 The survival of 4th instar larvae of Harmonia axyridis Pallas treated by 20E

圖2 20E 處理后異色瓢蟲4 齡幼蟲捕食量的變化Fig.2 The predation of 4th instar larvae of Harmonia axyridis Pallas treated by 20E

2.3 20E 對異色瓢蟲幼蟲酶活性的影響

2.3.1 超氧化物歧化酶( SOD) 活性 由圖3 可以看出，不同濃度20E 處理異色瓢蟲后短時間內(nèi)，SOD的活性均受到抑制。但是0.1 mg/L 和0.5 mg/L 20E 的抑制時間較短，酶活力在24 ～48 h 內(nèi)完全恢復(fù)到正常水平，說明這兩種濃度對異色瓢蟲4 齡幼蟲比較安全。

1.0 mg/L 20E 噴灑蠶豆苗后8 h 時SOD 活力達(dá)到最低，極顯著低于對照組(P ＜0.01);此后SOD 活力有所上升，至48 h 時可恢復(fù)部分活性，但仍極顯著低于對照組(P ＜0.01)。這說明1.0 mg/L 20E 處理對異色瓢蟲4 齡幼蟲體內(nèi)SOD 的活性有比較大的影響。

當(dāng)20E 施用濃度達(dá)到5.0 mg/L或10.0 mg/L時，異色瓢蟲4 齡幼蟲體內(nèi)的SOD 活性始終受到抑制，產(chǎn)生嚴(yán)重影響。

2.3.2 過氧化物酶( POD) 活性 由圖4 可以看出，當(dāng)20E 處理濃度為0.1 mg/L和0.5 mg/L 時，異色瓢蟲4 齡幼蟲POD 活性先受到抑制再逐漸恢復(fù)正常。處理后4 h，POD 活性即受到強烈抑制，與對照差異極顯著(P ＜0.01)，僅為對照組的1/4 左右。這說明異色瓢蟲幼蟲體內(nèi)POD 的活力水平對20E敏感，較低濃度的20E 在短時間內(nèi)就能顯著抑制POD 活力。但是隨著時間的延長，POD 逐漸恢復(fù)，24 ～48 h 后基本恢復(fù)至對照水平。說明0.1 mg/L和0.5 mg/L 20E 對異色瓢蟲幼蟲的影響時間不長。

1.0 mg/L 20E 處理后12 h 以內(nèi)，異色瓢蟲4 齡幼蟲POD 活力一直顯著(P ＜0.05)或極顯著低于對照(P ＜0.01)。此后，酶活力有一定程度的升高，但僅為低水平回復(fù)，低于同期對照組水平。說明1.0 mg/L 20E 對異色瓢蟲4 齡幼蟲存在很大安全隱患。

當(dāng)20E 處理濃度為5.0 mg/L和10.0 mg/L時，異色瓢蟲4 齡幼蟲POD 活力始終保持在很低的水平，酶活力被極顯著抑制(P ＜0.01)，認(rèn)為這兩種濃度對異色瓢蟲4 齡幼蟲不安全。

圖3 20E 處理后異色瓢蟲4 齡幼蟲SOD 活性的變化Fig.3 Activity of SOD in the 4th instar larvae of Harmonia axyridis Pallas treated by 20E

圖4 20E 處理后異色瓢蟲4 齡幼蟲POD 活性的變化Fig.4 Activity of POD in the 4th instar larvae of Harmonia axyridis Pallas treated by 20E

3 討論

蛻皮激素是由前胸腺分泌的能調(diào)節(jié)節(jié)肢動物昆蟲綱、甲殼綱等動物蛻皮的激素。其作用不僅觸發(fā)蛻皮過程的開始，而且能確保整個蛻皮過程的持續(xù)進(jìn)行，并促進(jìn)新的表皮鞣化。司樹鼎等［14］使用蛻皮甾酮類似物——蟲酰肼及其衍生物0593 以0.05 mg/L 處理2、3 和4 齡家蠶和以0.01 mg/L處理2 齡家蠶均發(fā)生提前入眠、提前蛻皮現(xiàn)象，平均歷期均比對照縮短0.5 ～1.0 d，本研究結(jié)果與之一致。另有大量研究證明，生物體在逆境條件下，細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生與清除平衡受到破壞，這些自由基有很強的氧化能力，對許多生物功能分子具有破壞作用［15］。SOD 和POD 是生物體內(nèi)普遍存在的防御氧化損傷的重要酶類，能夠防止自由基的毒害［16-17］。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)在逆境狀態(tài)下SOD 和POD 等酶活性協(xié)調(diào)一致，呈現(xiàn)先抑制后激活再抑制的現(xiàn)象。本試驗中，異色瓢蟲幼蟲在受到低劑量外源20-羥基蛻皮甾酮處理的逆境下，蟲體試圖將2 種保護(hù)酶的綜合活力水平保持在與正常情況下相近的一種活力狀態(tài)，以維持蟲體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除之間的基本平衡，減輕自由基對蟲體的毒害，這與鄢杰明等［18］和廖月枝等［19］關(guān)于研究蛻皮激素類對昆蟲體內(nèi)酶的影響結(jié)論類似。

綜合幼蟲存活率、捕食量和酶活性等指標(biāo)變化認(rèn)為，20E 濃度為0.1 mg/L對異色瓢蟲4 齡幼蟲安全;濃度為0.5 mg/L時比較安全，但存在一定的安全隱患;濃度為1.0 mg/L或更高時對幼蟲不安全。

致謝: 北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境研究所張帆和王斌老師對試驗提供了幫助，在此特致謝意!

［1］ 苗建才.無公害殺蟲劑及應(yīng)用技術(shù)［M］. 哈爾濱:黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，1990.

［2］ 趙善歡，仇序佳.昆蟲保幼激素類似物及其他生長調(diào)解劑對農(nóng)林害蟲防治試驗研究的進(jìn)展［M］//趙善歡. 殺蟲劑與昆蟲毒理進(jìn)展.2 版.北京:科學(xué)出版社，1983.

［3］ 黃自然. 昆蟲蛻皮激素的新進(jìn)展［J］. 昆蟲激素，1978 (1):67-72.

［4］ 王宏虬，繆?？。?彪，等. 核桃青皮提取物對馬鈴薯蚜蟲與瓢蟲的殺蟲活性［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(7):112-114.

［5］ 喬淑芬，孫 杰，顧地周. 北烏頭不同部位乙醇提取液對玉米蚜的生物活性［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(6):217-218，250.

［6］ 聶瑞麟，邱明華. 露水草工業(yè)生產(chǎn)蛻皮激素棄渣內(nèi)的蛻皮甾酮［J］. 云南植物研究，1987，9(1):119-128.

［7］ ROBBINS W E. Ecdysones and analages:effects on development and reproduction of insects ［J］. Sciences，1991，161:1158-1160.

［8］ CHI D F，SUN M X，XIA W F. Pesticidal character of phytoecdysteroids from Ajuga multiflora Bunge (Labiatae)on larvae of Cryptorrhynchus lapathi L. (Coleoptera:Curculionidae)［J］. Journal of Forestry Research，2002，13(3):177-182.

［9］ 劉敬澤，張惠戀，趙秀穎. 蛻皮激素對長角血蜱若蟲發(fā)育的影響［J］. 河北師范大學(xué)學(xué)報，1999，23(3):402-404.

［10］ 王小藝，沈佐銳. 異色瓢蟲的應(yīng)用研究概況［J］. 昆蟲知識，2002，39(4):255-261.

［11］ KOCH R L. The multicolored Asian lady beetle，Harmonia axyridis:A review of its biology，uses in biological control，and nontarget impacts［J］. Journal of Insect Science，2003，3:1-16.

［12］ SIMON L M，F(xiàn)ATRAI Z，JONAS D E. Study of peroxide metabolism enzymes during the development of Phaseolus vulgris［J］. Biochemistry Physiology，1974，166:387-392.

［13］ BEAUCHAMP C，F(xiàn)RIDOVICH I. Superoxide dismutase:improved assays and an assay applicable to acrylamide gels［J］. Analytical Biochemistry，1971，44(1):276-287.

［14］ 司樹鼎，王開運，張文成，等. 蟲酰肼及其衍生物0593 對家蠶的毒性及作用機理［J］. 昆蟲學(xué)報，2008，51(11):1157-1163.

［15］ 李 慧，嚴(yán)善春，曹傳旺. 呋喃蟲酰肼對舞毒蛾生長發(fā)育和保護(hù)酶活性的影響［J］. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，34(2):96-102.

［16］ 劉碧英，潘遠(yuǎn)智，趙楊迪，等. 藿香薊(Ageratum conyzoides)對土壤鉛脅迫的生理響應(yīng)［J］. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2011，17(5):651-655.

［17］ LIU W T，ZHOU Q X，ZHANG Z N，et al. Antioxidant defense system and cadmium uptake in Chinese cabbage cultivars under Cadmium stress［J］. Proceedings of Conference on Environmental Pollution and Public Health，2010，9:447-451.

［18］ 鄢杰明，廖月枝，嚴(yán)善春. 甲氧蟲酰肼對舞毒蛾解毒酶和保護(hù)酶活性的影響［J］. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，38(11):112-114.

［19］ 廖月枝，嚴(yán)善春，李小平. 甲氧蟲酰肼對舞毒蛾幼蟲保護(hù)酶活性的影響［J］. 林業(yè)科學(xué)，2011，47(9):93-99.