枯草芽孢桿菌發(fā)酵菌糠制備飼料微生物添加劑的研究

■張麗美 王秀玲 韓梅琳 孫曉紅 李 杰

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所，黑龍江哈爾濱 150030；2.北京市大興區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京 102611；3.北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097)

菌糠是利用木屑、秸稈等為培養(yǎng)料栽培食用菌后的剩余物。菌糠中約含有粗蛋白9%～13%、粗纖維10%～30%、粗脂肪0.12%～6.2%[1-2]。因其本身適口性差、粗纖維含量較高，影響動(dòng)物的消化吸收，通常不直接用來制備畜禽飼料,但經(jīng)某些微生物發(fā)酵后，可用于制備微生物飼料添加劑，進(jìn)而改善飼料品質(zhì)?？莶菅挎邨U菌具有很高的蛋白酶、淀粉酶的活性，并能明顯提高動(dòng)物生長速度和飼料利用率，其芽孢的營養(yǎng)體細(xì)胞易保存，存活率高，因此通常選用枯草芽孢桿菌作為微生物飼料添加劑發(fā)酵菌種[3-4]。目前，國內(nèi)的研究主要采用液體發(fā)酵法，國外的研究主要集中在固體發(fā)酵法[5-7]。很多研究表明，固體發(fā)酵穩(wěn)定性好[8-9]，且設(shè)備比較簡單；同時(shí)固體發(fā)酵有利于提高產(chǎn)酶活力。在國內(nèi)，利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵菌糠的研究報(bào)道甚少。本試驗(yàn)用枯草芽孢桿菌發(fā)酵金針菇菌糠生產(chǎn)微生物飼料添加劑，以期為菌糠再利用提供技術(shù)參數(shù)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

試驗(yàn)所用枯草芽孢桿菌菌種由國家糧食局動(dòng)物營養(yǎng)研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、蒸餾水1 000 ml，pH值為7.0。

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基，pH值為7.4。

1.1.3 菌糠

試驗(yàn)所用金針菇菌糠由北京市房山區(qū)格瑞拓?fù)渖锟萍加邢薰咎峁?/p>

1.2 發(fā)酵方法

1.2.1 菌種活化及菌糠成分測(cè)定

將活化培養(yǎng)基分裝于500 ml錐形瓶中，每瓶裝100 ml，用封口膜封好，0.1 MPa、121 ℃高壓滅菌20 min；將2環(huán)斜面菌種接入活化培養(yǎng)基中，然后置于37℃、200 r/min恒溫、恒濕搖床中培養(yǎng)72 h，作為種子備用。

試驗(yàn)前期對(duì)菌糠營養(yǎng)成分進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表1。由表1可知，菌糠中的C/N為34.6∶1，較微生物生長的最適C/N（25∶1）偏高，本試驗(yàn)擬以添加一定量的氮源對(duì)C/N進(jìn)行調(diào)整。

表1 發(fā)酵所用菌糠各成分含量

1.2.2 外源氮水平的選取

選取尿素、硫酸銨、棉粕、麥麩4種常用氮源，分別進(jìn)行氮源添加量對(duì)菌糠發(fā)酵物中芽孢數(shù)的影響試驗(yàn)，來確定5因素4水平L16（45）正交試驗(yàn)（試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2）不同氮源的適宜添加量。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.3 菌糠固體發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用5因素4水平正交設(shè)計(jì)，優(yōu)化金針菇菌糠的發(fā)酵條件[10-11]。取40 g菌糠和一定量的氮源（依據(jù)1.2.2所得外源氮水平）裝入三角瓶中混勻，于121℃高壓蒸汽滅菌20 min,出鍋冷卻至35℃左右加入60 ml蒸餾水及一定量的枯草芽孢桿菌菌液（依據(jù)表2中規(guī)定的接種量，菌數(shù)為9×106cfu/ml），在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[12-14]。

1.2.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

芽孢數(shù)測(cè)定采用普通平板計(jì)數(shù)法;粗蛋白測(cè)定采用GB/T 6432—1994中方法；粗纖維測(cè)定采用GB/T 6433—2006中方法；粗脂肪測(cè)定采用GB/T 6434—2006中方法；還原糖測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸比色法。游離棉酚測(cè)定采用GB13086—91中方法。

2 結(jié)果

2.1 外源氮水平選取

2.1.1 尿素水平選取

設(shè)定尿素的添加量分別為0.25%、0.50%、0.75%、1.00%和1.25%，不同添加量時(shí)菌糠發(fā)酵產(chǎn)物中枯草芽孢桿菌的芽孢數(shù)變化見圖1。由圖1可知，尿素水平在0.25%到0.50%之間，活菌數(shù)量隨著尿素水平的增加而提高；尿素添加量為0.50%時(shí)芽孢數(shù)最多，尿素水平超過0.50%，芽孢數(shù)隨著尿素水平的增加而降低。由此選0.50%尿素為5因素4水平L16（45）正交試驗(yàn)中外源氮尿素的水平。

2.1.2 硫酸銨水平選取

設(shè)定硫酸銨的添加量分別為1.00%、1.50%、2.00%、2.50%和3.00%，不同添加量時(shí)菌糠發(fā)酵產(chǎn)物中枯草芽孢桿菌的芽孢數(shù)變化見圖2。由圖2可知，硫酸銨水平在1.00%到1.50%之間，芽孢數(shù)量隨著硫酸銨水平的增加而提高，硫酸銨添加量為1.50%時(shí)，芽孢數(shù)最多；硫酸銨水平超過1.50%，活菌數(shù)量隨著硫酸銨水平的增加而降低。由此選1.50%硫酸銨為5因素4水平L16（45）正交試驗(yàn)中外源氮硫酸銨的水平。

圖1 添加不同水平的尿素對(duì)菌糠發(fā)酵物中芽孢數(shù)的影響

圖2 添加不同水平的硫酸銨對(duì)菌糠發(fā)酵物中芽孢數(shù)的影響

2.1.3 棉粕水平選取

設(shè)定棉粕的添加量分別為1.00%、2.00%、3.00%、4.00%和5.00%，不同添加量時(shí)菌糠發(fā)酵產(chǎn)物中枯草芽孢桿菌的芽孢數(shù)變化見圖3。由圖3可知，棉粕水平在1.00%到3.00%之間，活菌數(shù)量隨著棉粕水平的增加而提高；棉粕水平超過3.00%，活菌數(shù)量隨著棉粕水平的增加而降低。棉粕添加量為3%時(shí)芽孢數(shù)最多，由此選3%棉粕為5因素4水平L16（45）正交試驗(yàn)中外源氮棉粕的水平。

2.1.4 麥麩水平選取

設(shè)定麥麩的添加量分別為2.00%、3.00%、4.00%、5.00%和6.00%，不同添加量的菌糠發(fā)酵產(chǎn)物中枯草芽孢桿菌的芽孢數(shù)變化見圖4。由圖4可知，麥麩水平在2.0%～4.0%之間，活菌數(shù)量隨著麥麩水平的增加而提高，麥麩添加量為4.0%時(shí)芽孢數(shù)最多；麥麩水平超過4.0%，活菌數(shù)量隨著麥麩水平的增加而降低。由此選4.0%麥麩添加量為5因素4水平L16(45)正交試驗(yàn)中外源氮麥麩的水平。

圖3 添加不同水平棉粕對(duì)菌糠發(fā)酵物中芽孢數(shù)的影響

圖4 添加不同水平麥麩對(duì)菌糠發(fā)酵物中芽孢數(shù)的影響

2.2 固體發(fā)酵最適宜條件的研究

本試驗(yàn)依據(jù)圖1～圖4所選定的氮源水平，采用L16（45）的正交試驗(yàn)表(見表2)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵[15-17]，分析培養(yǎng)溫度、外源氮水平、初始pH值、發(fā)酵時(shí)間和菌液接種量等因素對(duì)芽孢數(shù)的影響，從而確定固體發(fā)酵的最佳條件，結(jié)果見表3。在最適條件下發(fā)酵金針菇菌糠,對(duì)發(fā)酵前、后菌糠中游離棉酚的含量以及發(fā)酵后的菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表4。

由表3固體發(fā)酵的正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,可知RB＞RC＞RD＞RE＞RA，即外源氮的影響最大，為主要因素，其次是初始pH值和發(fā)酵時(shí)間，培養(yǎng)溫度影響較小，此正交試驗(yàn)的最優(yōu)條件為B3C4D2E4A3，即外源氮棉粕3%的添加量，初始pH值為7.5，發(fā)酵終止時(shí)間48 h，菌液接種量10%，培養(yǎng)溫度35℃。

由表4可得，在此最適條件下發(fā)酵金針菇菌糠，測(cè)得發(fā)酵后產(chǎn)品中芽孢數(shù)為8×109cfu/g（干重），達(dá)到國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求（NY/T1461—2007）；游離棉酚含量由發(fā)酵前的76.78 mg/kg降至發(fā)酵后30.68 mg/kg,降解率達(dá)到60.04%。

表3 正交試驗(yàn)不同條件下測(cè)得的芽孢數(shù)

表4 最適條件下發(fā)酵產(chǎn)物中芽孢數(shù)和游離棉酚降解程度

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物的衛(wèi)生指標(biāo)及營養(yǎng)成分的測(cè)定

對(duì)其發(fā)酵后產(chǎn)品在45℃下烘干制得微生物制劑。最后，對(duì)此制劑中的黃曲霉毒素B1、砷、鉛、汞、鎘等成分進(jìn)行測(cè)定,具體結(jié)果見表5。

表5 發(fā)酵產(chǎn)物的衛(wèi)生指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)國家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 13078—2001）的規(guī)定，菌糠發(fā)酵物中黃曲霉毒素B1以及重金屬鎘、砷、鉛、汞的成分均符合國家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，并含有少量粗蛋白、粗脂肪等營養(yǎng)成分。

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵金針菇菌糠的最適條件

枯草芽孢桿菌發(fā)酵金針菇菌糠的最適條件為B3C4D2E4A3，即棉粕添加量3%，初始pH值7.5,發(fā)酵時(shí)間48 h，菌液接種量10%,發(fā)酵溫度35℃。在此最適條件下利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵金針菇菌糠，測(cè)得發(fā)酵后產(chǎn)品中芽孢數(shù)為8×109cfu/g（干重），達(dá)到國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求（NY/T1461—2007）。

3.2 發(fā)酵過程中游離棉酚含量變化

與發(fā)酵前相比，游離棉酚的降解率達(dá)到60.04%；游離棉酚含量的下降說明微生物同樣具有降解游離棉酚的能力，作為發(fā)酵原料的菌糠來源廣、成本低廉，用來制備飼料微生物添加劑，可降低飼料成本[18]。

3.3 菌種特異性對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

在枯草芽孢桿菌的固體發(fā)酵過程中，初始pH值、菌液接種量、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時(shí)間、氮源種類及其水平都會(huì)影響發(fā)酵產(chǎn)物中的芽孢數(shù)[19]。本試驗(yàn)結(jié)果的最適pH值和最適溫度分別為7.5和35℃，與報(bào)道的研究結(jié)果（pH值8和32℃）[20-21]有一定差異，其原因可能是pH值和溫度存在菌株特異性。試驗(yàn)結(jié)果表明，利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵菌糠制備飼料添加劑是可行的，不僅對(duì)延長生態(tài)鏈、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義，而且利用菌糠替代其他發(fā)酵原料可以降低飼料成本，緩解飼料不足的壓力，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。

4 結(jié)論

①枯草芽孢桿菌的最適發(fā)酵條件為B3C4D2E4A3，即棉粕添加量3%，初始pH值7.5，發(fā)酵時(shí)間48 h，菌液接種量10%,發(fā)酵溫度35℃。

②在此最優(yōu)條件下發(fā)酵金針菇菌糠,測(cè)得其發(fā)酵后芽孢數(shù)為8×109cfu/g（干重）。

③游離棉酚含量由發(fā)酵前的76.78 mg/kg降至發(fā)酵后30.68 mg/kg,降解率達(dá)到60.04%。

④發(fā)酵后的產(chǎn)物經(jīng)烘干后，其黃曲霉毒素B1以及重金屬鎘、砷、鉛、汞的含量均符合國家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 13078—2001）。