好食脈孢霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的研究

■ 鄧永平 劉曉蘭 艾瑞波 鄭喜群 任 憑

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省普通高校齊齊哈爾農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾 161006；3.黑龍江省齊齊哈爾市北方華安工業(yè)集團技術(shù)中心，黑龍江齊齊哈爾 161006)

木聚糖酶是可將木聚糖降解成木糖和低聚糖的一類木糖苷鍵水解酶，在造紙、食品、飼料、能源轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域都有重要應(yīng)用[1-5]，因此，國際上對木聚糖酶的研究十分重視。

Sorensen(1955)首先對動物瘤胃和土壤中的木聚糖酶進行了研究，目前已經(jīng)可以通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶，例如在Bacillus subtilis、Bacillus subtilis ASH、Aspergillus nige、Paecilomyces ther?mophil等發(fā)酵產(chǎn)物中都得到了木聚糖酶[6-9]。木聚糖酶的研究應(yīng)用中存在單位產(chǎn)量低、穩(wěn)定性較差等問題，限制了木聚糖酶在某些領(lǐng)域的應(yīng)用，因此，從工業(yè)化角度看，木聚糖酶的可開發(fā)空間很大。

本試驗利用從南方小酒藥中分離的微生物好食脈孢霉為生產(chǎn)菌種，以麩皮和豆渣這兩種食品加工下腳料為主要培養(yǎng)基質(zhì)，利用液態(tài)發(fā)酵的方法生產(chǎn)木聚糖酶，研究不同培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度和接種量對酶活力的影響，確定最適產(chǎn)酶條件，從而為來源安全、高活力、低成本的木聚糖酶的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種為好食脈孢霉（保藏號為CGMCC No.1836）。

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；液體種子培養(yǎng)基：3%麩皮水、1.5%蛋白胨，pH值5.0；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：3%麩皮水為碳源，氮源種類及濃度根據(jù)試驗而定。

1.2 試驗方法

1.2.1 斜面培養(yǎng)

取好食脈孢霉菌種保藏斜面1支，用接種環(huán)轉(zhuǎn)接入PDA斜面，28℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 液體發(fā)酵種子制備

制備好食脈孢霉孢子懸液，將適量孢子懸液接入裝有50 ml液體種子培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，在28～30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)2 d，作為液體種子。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將適量液體種子接入裝有50 ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，28～30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.4 粗酶液的制備

將發(fā)酵液用冷凍離心機在6 000 r/min、4℃條件下離心10 min，取上層清液即為粗酶液。

1.2.5 木聚糖酶活性的測定方法

采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法。底物為0.4%木聚糖溶液（pH值4.4），取0.5 ml適當(dāng)稀釋的酶液于比色管中，加入1.5 ml底物溶液，45℃水浴反應(yīng)30 min，加入1.5 ml DNS溶液后在沸水浴中煮沸5 min。迅速用冷水冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25 ml，540 nm測定吸光值，木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

酶活力定義為：在45℃、pH值4.4條件下，每分鐘分解木聚糖生成1 μg木糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.2.6 測定種子生長曲線

采用稱干重法測量種子生長曲線。

2 結(jié)果和討論

2.1 種子生長曲線

將好食脈孢霉菌種接入種子培養(yǎng)液，在28℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)48 h，每4 h取樣1次，烘干至恒重，測干重，平行試驗3次。以菌體干重為縱坐標(biāo)，發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)繪制種子生長曲線（見圖2）。

由圖2可知，在12 h時菌體進入快速生長期，到達40 h時進入衰退期，故接種最適時期為12～24 h。

圖2 種子生長曲線

2.2 培養(yǎng)基組成成分對好食脈孢霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

大多數(shù)真菌產(chǎn)生的木聚糖酶都是復(fù)合酶，也是誘導(dǎo)酶，通常半纖維素底物及類似物都是木聚糖酶的良好誘導(dǎo)物。試驗中選用麩皮作為碳源，除了價格低廉的原因外，麩皮對木聚糖酶有著較好的誘導(dǎo)作用。豆渣和豆粕含有豐富的營養(yǎng)，既可以作為培養(yǎng)好食脈孢霉的氮源，又可以作為產(chǎn)酶誘導(dǎo)物。

試驗以3%麩皮水為碳源，氮源種類及濃度見表1，培養(yǎng)基初始pH值自然。以l%接種量將種子分別接入裝有50 ml不同發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，在150 r/min、28℃條件下振蕩培養(yǎng)72 h，測定木聚糖酶活力,不同培養(yǎng)基組成對木聚糖酶活力的影響見圖3。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基氮源種類及濃度（%）

圖3 培養(yǎng)基組成對好食脈孢霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

由圖3可以看出，采用單一氮源，產(chǎn)酶效果較差，而采用蛋白胨和豆渣(即4號培養(yǎng)基)作為復(fù)合氮源，效果很好，使用4號培養(yǎng)基發(fā)酵后產(chǎn)酶活力最高。

豆渣是豆制品加工下腳料，價格低廉，來源廣泛，很適合作為生產(chǎn)原料，因此，改變培養(yǎng)基中豆渣的含量，即豆腐渣含量分別為6%、10%、15%、20%及25%，以3%麩皮水為碳源，蛋白胨含量均為0.5%，以期進一步提高酶活力。

以豆渣含量為橫坐標(biāo)，木聚糖酶活力為縱坐標(biāo)作圖，試驗結(jié)果見圖4。

圖4 不同豆渣含量對好食脈孢霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

如圖4所示，豆渣的含量對產(chǎn)酶影響較大，豆渣濃度為10%時，酶的活力最高，豆渣濃度高于10%時，木聚糖酶活力開始下降，豆渣濃度越高，酶活力越低，在試驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)豆渣濃度高于10%后，培養(yǎng)液變得黏稠，不利于溶氧，不利于菌體生長和產(chǎn)酶。所以，選擇培養(yǎng)基為3%麩皮水、0.5%蛋白胨、10%豆渣，pH值自然。

2.3 培養(yǎng)基初始pH值對好食脈孢霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

培養(yǎng)基初始pH值影響微生物原生質(zhì)膜所帶的電荷以及某些營養(yǎng)物質(zhì)的分解和電離程度，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。發(fā)酵過程中pH值會隨著培養(yǎng)時間不同而發(fā)生改變，從而影響產(chǎn)酶。因此，試驗采用檸檬酸緩沖液將培養(yǎng)基調(diào)至特定的初始pH值，在菌株生長過程中不再加以控制。

將發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值分別調(diào)整為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，接種量1%，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h后測定木聚糖酶活力（見圖5）。

圖5 培養(yǎng)基初始pH值對好食脈孢霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

試驗結(jié)果如圖5所示，隨著培養(yǎng)基初始pH值的不同，產(chǎn)木聚糖酶活力也有明顯差別。這是由于細(xì)胞內(nèi)的H+或OH-離子能夠影響酶蛋白的解離度和電荷狀況，改變酶的結(jié)構(gòu)和功能，引起酶活性的改變。但培養(yǎng)基中的H+或OH-離子并不是直接作用在胞內(nèi)酶蛋白上，而是首先作用在胞外的弱酸（或弱堿）上，使之成為易于透過細(xì)胞膜的分子狀態(tài)的弱酸（或弱堿），它們進入細(xì)胞后，再進行解離，產(chǎn)生H+或OH-，改變胞內(nèi)原先存在的中性狀態(tài)，進而影響酶的結(jié)構(gòu)和活性。當(dāng)pH值為5.0時，產(chǎn)木聚糖酶活力達到最高，故選擇該pH值作為最適宜的初始培養(yǎng)基pH值。

2.4 接種量對好食脈孢霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

接種量是指接入發(fā)酵培養(yǎng)液中的種子培養(yǎng)液體積和發(fā)酵液體積之比。通常，較高的接種量可縮短發(fā)酵周期。但是，接種量過高會導(dǎo)致溶氧量不夠，抑制菌體生長；接種量過低會使菌體生長緩慢，發(fā)酵延遲，導(dǎo)致產(chǎn)酶量降低。

發(fā)酵溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min、初始pH值自然條件下，分別選擇接種量為0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、7.0%進行試驗，每組3個平行，發(fā)酵72 h后測定酶活。如圖6所示，接種量以1.0%最佳，此時產(chǎn)生的木聚糖酶活力最高。

圖6 接種量對好食脈孢霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

2.5 培養(yǎng)時間對好食脈孢霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

將液體種子以1%接種量接入裝有50 ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，在28℃、150 r/min培養(yǎng)24、48、60、72、84、96、108、120 h，測定木聚糖酶活力(見圖 7)。

由圖7可以看出，培養(yǎng)時間對該菌木聚糖酶的產(chǎn)生有顯著影響。培養(yǎng)時間在72～84 h之內(nèi)產(chǎn)酶活力較高，繼續(xù)培養(yǎng)，酶活力逐漸下降，原因可能是培養(yǎng)液中可供好食脈孢霉利用的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸耗盡，微生物生長進入衰退期，故選擇72 h為最佳發(fā)酵時間。

2.6 發(fā)酵溫度對好食脈孢霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

溫度對好食脈孢霉生長代謝影響較大，低溫會抑制其生長代謝，隨著溫度升高代謝速度加快，但是溫度超過一定范圍會引起菌體內(nèi)酶的不可逆失活，從而引起菌體死亡。試驗分別考察了菌株在20、25、28、32、36 ℃條件下產(chǎn)酶的情況(見圖8)。

圖7 培養(yǎng)時間對好食脈孢霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

圖8 發(fā)酵溫度對好食脈孢霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

如圖8所示，溫度對該菌木聚糖酶的生成有較大影響。培養(yǎng)溫度為25～28℃時，有利于木聚糖酶的合成，此時木聚糖酶活力較高。低于25℃時溫度偏低，菌體生長較慢，產(chǎn)酶活力較低；高于28℃時，菌體生長過于迅速，導(dǎo)致酶活力不高，所以選擇在28℃下發(fā)酵。

2.7 搖床轉(zhuǎn)速對好食脈孢霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

好食脈孢霉為好氧微生物，其生長和產(chǎn)酶與氧氣傳遞關(guān)系很大。搖瓶培養(yǎng)時，搖床的轉(zhuǎn)速不僅決定了通氣量，而且還會影響底物與菌體的接觸。試驗中對比了4種搖床轉(zhuǎn)速(120、150、170、190 r/min)對菌體產(chǎn)酶的影響（見圖9）。

圖9 搖床轉(zhuǎn)速對好食脈孢霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

由圖9可以看出，裝液量相同的情況下，隨著轉(zhuǎn)速的增加，產(chǎn)酶活力發(fā)生先增大后減小的變化，這是由于轉(zhuǎn)速對發(fā)酵液中溶解氧濃度、菌體與氧接觸率兩者有很大影響，需氧發(fā)酵并不是溶氧濃度越高越好，適當(dāng)高的溶氧水平有利于菌體生長和產(chǎn)物合成。另外，轉(zhuǎn)速過高產(chǎn)生的強剪切力作用不僅會使菌絲體受到損傷，不利于其生長，還會引起酶蛋白變性失活。當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min時，產(chǎn)木聚糖酶活力最高，達到476 U/ml，故選擇150 r/min作為最佳轉(zhuǎn)速。

3 結(jié)論

本文以豆渣和麩皮為主要原料，研究了好食脈孢霉菌株產(chǎn)木聚糖酶的液態(tài)發(fā)酵條件。以木聚糖酶的催化活力為指標(biāo)，通過單因素試驗法確定液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由3%麩皮水、10%豆渣和0.5%蛋白胨組成，用檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值為5.0，在28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)72 h后木聚糖酶活力可達到476 U/ml。