不同精粗比底物下不同添加劑對(duì)綿羊瘤胃體外發(fā)酵的影響

■楊平平 甄玉國 王曉磊 趙 巍 于中英

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118）

目前，如何有效調(diào)控瘤胃發(fā)酵，促使瘤胃微生物生長和瘤胃發(fā)酵達(dá)到最佳狀態(tài)是反芻動(dòng)物學(xué)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)?？股氐氖褂媚軌蛴行У亟档土鑫赴l(fā)酵所引起的蛋白質(zhì)和能量的損失。然而，抗生素存在藥物殘留和致病菌產(chǎn)生耐藥性等種種弊端而被禁止使用[1]。因此，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)家開始研究能夠替代抗生素并能有效調(diào)控瘤胃發(fā)酵的“天然”功能性添加劑。

酵母培養(yǎng)物（Yeast culture，YC)主要是通過向瘤胃微生物提供額外的營養(yǎng)底物刺激反芻動(dòng)物特定瘤胃微生物區(qū)系生長和某些微生物活性的提高，從而提高M(jìn)CP和VFA的含量[2]。

米曲霉提取物(Aspergillus oryzae extract，AO)能快速有效地促進(jìn)瘤胃內(nèi)厭氧真菌和纖維分解菌的生長，使更多的纖維分解菌能與粗纖維接觸，從而提高飼料中纖維的消化率[3]。

植物精油（Essential Oils，EO）能夠抑制甲烷的產(chǎn)生[4]，并通過抑制脫氨基作用，降低NH3-N濃度，從而提高能量和MCP的含量[5]。

綜上所述，YC、AO和EO均有獨(dú)特的調(diào)控瘤胃發(fā)酵機(jī)制，能夠促使瘤胃微生物生長和瘤胃發(fā)酵達(dá)到最佳狀態(tài)，然而，不同的精粗比對(duì)瘤胃發(fā)酵以及營養(yǎng)物質(zhì)代謝的影響存在很大不同，這些添加劑對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響均受日糧精粗比底物的影響。因此，為了更加清楚全面地了解這些添加劑調(diào)控瘤胃發(fā)酵的作用機(jī)制，并將其作用發(fā)揮至最大，尋求這些添加劑最適宜的精粗比底物成為必需。

1 材料與方法

1.1 瘤胃液采集

在晨飼前2 h用硬質(zhì)PVC管從3只體況良好，體重相近（約60 kg）、安裝有永久性瘤胃瘺管的綿羊瘤胃不同位點(diǎn)內(nèi)采集瘤胃液，加入到預(yù)熱39℃并通有CO2的保溫瓶中，采集后立即蓋上瓶蓋，迅速返回試驗(yàn)室，經(jīng)四層紗布過濾（期間應(yīng)將溫度保持在39℃左右并且盡可能少與空氣接觸），濾液等量混合后為瘤胃液的接種液。

1.2 試驗(yàn)日糧與功能性添加劑來源

試驗(yàn)日糧參照綿羊NRC飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（1985），并結(jié)合中國肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，主要原料為玉米、豆粕、DDGS、羊草，根據(jù)不同的精粗比確定試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平（見表1）。

功能性添加劑：YC由達(dá)農(nóng)威公司購買的益康XP產(chǎn)品；AO由諾偉司公司購買的艾美福產(chǎn)品；EO由宜客福貿(mào)易（上海）有限公司購買的恩益300產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用兩因素交叉分組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素一有4個(gè)水平，分別為無添加劑、添加YC、添加AO、添加EO；因素二有3個(gè)水平，分別為精粗比3∶7、5∶5、7∶3；每個(gè)水平有3個(gè)重復(fù)；底物量均為0.3 g。在培養(yǎng)前，將底物和添加劑裝入發(fā)酵瓶中，再將60 ml瘤胃混合發(fā)酵液（瘤胃液∶緩沖液=1∶2）裝入發(fā)酵瓶進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)24 h進(jìn)行采樣，并測定培養(yǎng)液pH值、NH3-N、VFA的濃度。

表1 試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 體外批次培養(yǎng)

1.4.1 體外培養(yǎng)裝置

培養(yǎng)裝置自行設(shè)計(jì)，主體恒溫水浴搖床，用絲扣瓶（容積為250 ml）作為培養(yǎng)瓶；同時(shí)，瓶蓋中安裝硅膠墊，并用封口膜封住瓶口保證發(fā)酵的厭氧環(huán)境。

1.4.2 緩沖液配制

緩沖液采用Menke和Steingass(1988)[6]的方法配制：緩沖液于培養(yǎng)前1 h準(zhǔn)確量取988 ml A液，10 ml B液，2 ml C液，充分混合，通CO2至無色然后將其分裝于培養(yǎng)瓶內(nèi)（每個(gè)培養(yǎng)瓶加40 ml），持續(xù)通入CO2氣體10 min，蓋上瓶蓋，置于39℃恒溫水浴中預(yù)熱至待用。

1.5 測定指標(biāo)

在培養(yǎng)24 h時(shí)進(jìn)行采樣，測定培養(yǎng)液pH值、NH3-N、VFA濃度。

1.6 測定方法

pH值采用便攜式pH計(jì)測定；NH3-N測定采用馮宗慈[7]比色法紫外分光光度計(jì)Uvmini_1240測定；VFA采用Agilent Technologies 7890A氣相色譜儀進(jìn)行測定(檢測器：FID；色譜柱：DB-FFAP；柱箱溫度：程序升溫過程由65℃升至190℃，每分鐘升20 ℃；分流比：50∶1；進(jìn)樣量：1 μl)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel整理與統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS17.0軟件進(jìn)行比較，其中均值的多重比較用Duncan氏法進(jìn)行并用單因素ANOVA分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同精粗比底物下不同添加劑對(duì)培養(yǎng)液pH值的影響（見表3）

表3 不同精粗比底物下不同添加劑對(duì)培養(yǎng)液pH值的影響

由表3可知，隨著精粗比的增加，對(duì)照組培養(yǎng)液pH值逐漸降低；精粗比3∶7組培養(yǎng)液pH值極顯著高于7∶3組(P＜0.01)，5∶5組顯著高于7：3組(P＜0.05)，而 3∶7組與 5∶5組差異不顯著（P＞0.05）。YC組在各精粗比底物下，與其他處理組相比，極顯著降低培養(yǎng)液pH值(P＜0.01)；在精粗比3∶7組與7∶3組達(dá)到差異顯著水平(P＜0.05)。AO組和EO組在各精粗比底物下，與對(duì)照組相比均有增加培養(yǎng)液pH值趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。且AO組精粗比3∶7組與5∶5組差異顯著(P＜0.05)，與7∶3組達(dá)到差異極顯著水平(P＜0.01)；EO組精粗3∶7組極顯著高于5∶5組和7∶3組(P＜0.01)。AO組和EO組相比，在各精粗比底物下，培養(yǎng)液pH值無顯著性變化（P＞0.05）。

2.2 不同精粗比底物下不同添加劑對(duì)培養(yǎng)液NH3-N濃度的影響（見表4）

表4 不同精粗比底物下不同添加劑對(duì)培養(yǎng)液NH3-N濃度的影響(mg/100 ml)

由表4可知，隨著精粗比的增加，培養(yǎng)液NH3-N濃度逐漸降低，精粗比3∶7組顯著高于5∶5組(P＜0.05)，極顯著高于7∶3組（P＜0.01）。。

YC組在精粗比3∶7和5∶5底物下，與其他處理組相比，極顯著降低培養(yǎng)液NH3-N濃度（P＜0.01）；在精粗比7∶3底物下，與對(duì)照組相比，有降低培養(yǎng)液NH3-N濃度趨勢(P＞0.05)，與AO組和EO組相比，顯著降低培養(yǎng)液NH3-N濃度(P＜0.05)。YC組在各精粗比間相比差異均不顯著（P＞0.05）。

AO組在精粗比3∶7底物下，與對(duì)照組相比有降低NH3-N濃度趨勢（P＞0.05），在精粗比5∶5、7∶3底物下，與對(duì)照組相比有增加NH3-N濃度趨勢，但差異均不顯著（P＞0.05）。AO組在各精粗比間相比差異均不顯著（P＞0.05）。

EO組在各精粗比底物下，與對(duì)照組相比，均增加培養(yǎng)液NH3-N濃度，但差異不顯著（P＞0.05）。EO組在精粗3∶7組顯著高于5∶5組和7∶3組(P＜0.05)。AO組和EO組相比，在各精粗比底物下，培養(yǎng)液NH3-N濃度無顯著性變化(P＞0.05)。

2.3 不同精粗比底物下不同添加劑對(duì)培養(yǎng)液VFA的影響（見表5）

表5 不同精粗比底物下不同添加劑對(duì)培養(yǎng)液VFA濃度的影響(mmol/l)

由表5可知，隨著精粗比的增加，培養(yǎng)液乙酸、丙酸、丁酸和TVFA濃度逐漸增加，不同精粗比組乙酸、丙酸濃度差異不顯著（P＞0.05），精粗比7∶3、5∶5組丁酸顯著高于3∶7組(P＜0.05)，精粗比7∶3組TVFA濃度顯著高于3∶7組(P＜0.05)。

YC組除在精粗比5∶5底物下，與AO組相比，乙酸濃度有增加趨勢（P＞0.05），在精粗比7∶3底物下，與EO組相比，顯著降低乙酸濃度(P＜0.05)，TVFA濃度有降低趨勢（P＞0.05）外，在各精粗比底物下，與其他處理組相比，極顯著增加VFA濃度（P＜0.01）。乙酸濃度精粗比7∶3組顯著高于5∶5組(P＜0.05)，丙酸濃度各精粗比間差異不顯著，丁酸濃度精粗比7∶3組顯著高于3∶7、5∶5組(P＜0.05)，TVFA濃度精粗比7∶3組顯著高于3∶7組(P＜0.05)，極顯著高于5∶5組(P＜0.01)。

AO組在精粗比3∶7底物下，與對(duì)照組相比，培養(yǎng)液中乙酸、丙酸、TVFA濃度有增加趨勢，丁酸濃度有降低趨勢，但差異均不顯著（P＞0.05）。在精粗比5∶5底物下，與對(duì)照組、EO組相比，極顯著增加乙酸、TVFA濃度（P＜0.01）。在精粗比7∶3底物下，與對(duì)照組相比，顯著增加乙酸(P＜0.05)，極顯著增加TVFA濃度(P＜0.01)，丙酸、丁酸濃度有增加趨勢，但差異不顯著(P＞0.05)。乙酸精粗比5∶5、7∶3組極顯著高于3∶7組(P＜0.01)；丙酸各精粗比間差異不顯著；丁酸精粗比7∶3組極顯著高于3∶7組(P＜0.01)，顯著高于5∶5組(P＜0.05)；TVFA精粗比5∶5、7∶3組極顯著高于3∶7組(P＜0.01)。

EO組在精粗比3∶7底物下，與對(duì)照組相比，增加乙酸、丙酸、TVFA濃度，降低丁酸濃度趨勢，但差異均不顯著（P＞0.05）。在精粗比5∶5底物下，與對(duì)照組相比，增加乙酸濃度，降低丙酸、丁酸和TVFA濃度，但差異均不顯著（P＞0.05）。在精粗比7∶3底物下，與其他處理組相比，極顯著增加乙酸濃度（P＜0.01）；與對(duì)照組和AO組相比，極顯著增加丙酸和TVFA濃度(P＜0.01)，顯著增加丁酸濃度(P＜0.05)。精粗比7∶3組乙酸、丙酸、丁酸、TVFA濃度極顯著高于3∶7、5∶5組(P＜0.01)。

3 討論

3.1 不同精粗比底物下不同添加劑對(duì)培養(yǎng)液pH值的影響

本試驗(yàn)中，隨著精粗比的增加，培養(yǎng)液pH值逐漸降低，表明隨著精料比例的提高，瘤胃微生物可發(fā)酵非結(jié)構(gòu)性碳水化合物提高，產(chǎn)生VFA增加，pH值下降，這一結(jié)果與周為琴[8]和朱素華[9]的研究結(jié)果一致。

YC組在各精粗比底物下均能極顯著降低培養(yǎng)液pH值，說明YC在各精粗比底物下均能有效刺激特定瘤胃微生物生長及其活性的提高[2]，產(chǎn)生大量VFA，降低NH3-N濃度，從而降低培養(yǎng)液pH值。這與唐海翠[10]研究結(jié)果相一致。

AO組在精粗比3∶7底物下，能夠提高培養(yǎng)液pH值，這與孫安權(quán)[3]提出AO能夠競爭性地保護(hù)飼料中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的快速發(fā)酵，使瘤胃微生物對(duì)纖維的活動(dòng)高峰提前到來，從而穩(wěn)定培養(yǎng)液pH值相一致。而在精粗比7∶3底物下，AO降低培養(yǎng)液pH值，原因可能在于AO顯著增加乙酸和TVFA濃度，因此，培養(yǎng)液pH值下降。

EO組在各精粗比底物下均能夠提高培養(yǎng)液pH值，原因可能是在各精粗比底物下EO均提高培養(yǎng)液NH3-N濃度，因此培養(yǎng)液pH值提高。

3.2 不同精粗比底物下不同添加劑對(duì)培養(yǎng)液NH3-N濃度的影響

本試驗(yàn)中，隨著精粗比的增加，培養(yǎng)液NH3-N濃度逐漸降低，原因在于隨著精料比例的提高，瘤胃微生物可發(fā)酵有機(jī)物增加，為瘤胃微生物生長提供能量增加，瘤胃微生物氮合成效率提高，NH3-N濃度降低，這一結(jié)果與唐海翠[10]和朱素華[9]的研究結(jié)果一致。

YC組在精粗比底物下均能降低培養(yǎng)液NH3-N濃度，但隨著精粗比的增加，培養(yǎng)液NH3-N濃度降低幅度逐漸降低，原因可能是蛋白質(zhì)合成菌為酸性敏感菌[11]，隨著精粗比增加，培養(yǎng)液pH值不斷下降，YC在高精料下對(duì)蛋白質(zhì)合成菌的影響較小，MCP合成效率相對(duì)較低，因此培養(yǎng)液NH3-N濃度降低幅度較小。

AO組在精粗比3∶7底物下能夠降低培養(yǎng)液NH3-N濃度，可能由兩個(gè)原因所導(dǎo)致：一是AO降低蛋白質(zhì)降解速度；二是提高M(jìn)CP數(shù)量[3]。而AO在精粗比5∶5和7∶3底物下能夠增加培養(yǎng)液NH3-N濃度，原因可能與上述相反，這一結(jié)果說明AO對(duì)微生物蛋白質(zhì)體系受碳水化合物日糧結(jié)構(gòu)的影響。

EO組在各精粗比底物下均提高培養(yǎng)液NH3-N濃度，這與Busquet(2005)[12]報(bào)道肉桂醛(31.2 mg/l)對(duì)氮代謝沒有顯著影響結(jié)果相一致，而Busquet(2006)[13]提出高劑量（3 000 mg/l）肉桂醛能夠降低NH3-N濃度，抑制瘤胃細(xì)菌的脫氨基作用。本試驗(yàn)EO的主要成分為肉桂醛和大蒜素，添加劑量為75 mg/l，因此結(jié)果不一致可能與EO添加量有關(guān)。

3.3 不同精粗比底物下不同添加劑對(duì)培養(yǎng)液VFA濃度的影響

VFA的含量是評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)酵能力的重要指標(biāo)，受日糧碳水化合物結(jié)構(gòu)比例的影響。本試驗(yàn)中，隨著精粗比的增加，培養(yǎng)液VFA濃度逐漸增加，這與朱素華[9]的研究結(jié)果一致。

YC在各精粗比底物下均能極顯著提高VFA濃度，在精粗比3∶7底物下乙酸增加幅度較大，在精粗比7∶3底物下丙酸和丁酸增加幅度較大，這一結(jié)果說明YC在各精粗比底物下均能有效刺激瘤胃微生物的生長及其活性的提高，在高粗料底物下對(duì)纖維分解菌的影響較大，在高精料底物下對(duì)淀粉分解菌的影響較大。

AO組在精粗比5∶5和7∶3底物下顯著或極顯著增加乙酸和TVFA濃度，原因可能在于AO促進(jìn)瘤胃厭氧真菌和纖維分解菌的生長，瘤胃真菌能夠打破木質(zhì)素和半纖維素連接，為纖維分解菌提供更多與粗飼料接觸面積，提高纖維消化率[3]。這與Martin(1990)[14]表明AO在不同的濃度均能刺激瘤胃微生物的發(fā)酵，提高乙酸、丙酸、TVFA濃度的結(jié)果相一致。而在精粗比3∶7底物下，AO提高VFA濃度的幅度較小，原因可能在于AO在精粗比3∶7底物下降低培養(yǎng)液NH3-N濃度，此時(shí)瘤胃微生物利用一部分VFA提供碳架合成MCP，因此，VFA增加的幅度較小。

EO在精粗比7∶3底物下能夠顯著或極顯著提高VFA濃度，而在其他精粗比底物下EO對(duì)VFA無顯著性影響，說明EO在高精料條件下對(duì)纖維分解菌的生長促進(jìn)作用較強(qiáng)，這與Spanghero(2008)[11]提出日糧類型和pH值均會(huì)影響EO對(duì)瘤胃發(fā)酵的效果，最初pH值為5.5時(shí)EO對(duì)VFA的影響較大的結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

①從整體趨勢看，隨著精粗比的增加，培養(yǎng)液VFA濃度逐漸增加，pH值、NH3-N濃度逐漸降低。

②YC組在各精粗比底物下與對(duì)照組相比，極顯著提高培養(yǎng)液VFA濃度，極顯著降低pH值（P＜0.01），對(duì)NH3-N濃度的影響僅在精粗比3∶7和5∶5組達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。

③AO組在精粗比5∶5底物下，與對(duì)照組相比，極顯著增加乙酸、TVFA濃度（P＜0.01）；在精粗比7∶3底物下，與對(duì)照組相比，顯著增加乙酸（P＜0.05），極顯著增加TVFA濃度（P＜0.01）。

④EO組在精粗比7∶3底物下，與對(duì)照組相比，極顯著增加乙酸、丙酸和TVFA濃度（P＜0.01），顯著增加丁酸濃度(P＜0.05)。

5 應(yīng)用指導(dǎo)

YC、AO、EO在特定的精粗比底物下均能有效地調(diào)控瘤胃發(fā)酵，YC在不同精粗比底物下添加均有較好的瘤胃發(fā)酵效果，而AO和EO在高精料條件下添加調(diào)控的效果較好。