高效液相色譜法測定飼料添加劑L-賴氨酸硫酸鹽的含量

■盧 琳

(新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，新疆烏魯木齊 830063)

L-賴氨酸硫酸鹽（L-Lysine sulphate），其化學(xué)名稱為左旋-2，6-二氨基己酸單硫酸鹽，是一種白色或近白色自由流動的結(jié)晶性粉末，幾乎無臭，易溶于水和甲酸，難溶于乙醇和乙醚。其用途主要用作飼料添加劑、食品強(qiáng)化劑和制藥。

賴氨酸是蛋白質(zhì)的重要組分之一，是人體8種必需氨基酸之一，是一種優(yōu)良的食品強(qiáng)化劑。因食物中缺乏賴氨酸，所以又稱“第一必需氨基酸”。將賴氨酸添加到飲品、大米、面粉、罐頭等食品中可以提高蛋白質(zhì)的利用率，從而大大強(qiáng)化食品的營養(yǎng)，起到促進(jìn)生長發(fā)育、增加食欲、減少疾病、增強(qiáng)體質(zhì)的作用，用于罐頭中起除臭保鮮的作用。

L-賴氨酸硫酸鹽除含有51%的賴氨酸（相當(dāng)于65%的飼料級L-賴氨酸硫酸鹽）外，還含有不少于15%的其它氨基酸，可為動物提供更為全面、均衡的營養(yǎng)，同時這些氨基酸共同作用還可以提高斷奶仔豬的消化性能，從而使其消化率提高。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent1200）、METTLER AE240型電子天平（梅特勒公司）。

1.2 試藥與試劑

硼酸鹽緩沖液（borate buffer）（Agilent公司）、鄰苯二甲醛（OPA）（Agilent公司）、9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC）（Agilent公司）、正纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）、L-賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）、L-賴氨酸硫酸鹽樣品（由新疆梅花氨基酸有限責(zé)任公司提供）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Hypersil AA-ODS 200 mm×2.1 mm，5 μm(Agilent公司)；以流動相A{（1.36±0.025）g三水合乙酸鈉+500 ml水+90 μl三乙胺[1%～2%乙酸調(diào)節(jié)pH值至(7.20±0.05)]+1.5 ml四氫呋喃}和流動相 B{（1.36±0.025）g三水合乙酸鈉+100 ml水[1%～2%乙酸調(diào)節(jié)pH值至(7.20±0.05)]+200 ml甲醇+200 ml乙腈}按表1中的洗脫程序進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.45 ml/min；進(jìn)樣按表2中的進(jìn)樣程序進(jìn)樣；采用紫外檢測器，檢測波長在0～16 min為338 nm、在16～25 min為262 nm；柱溫40 ℃。

表1 洗脫程序

表2 進(jìn)樣程序

2.2 試液制備

2.2.1 樣品溶液制備

稱取250 mg樣品放入100 ml容量瓶中，加1 N鹽酸使之溶解后,放入60～70℃水浴或者超聲波浴中攪拌30 min，變成懸濁液之后常溫冷卻，再用1 N鹽酸定容至100 ml，搖勻。取5 ml此溶液放入50 ml容量瓶中，準(zhǔn)確加入0.1%正纈氨酸溶液5 ml，用檸檬酸鈉緩沖液定容至50 ml，搖勻，用0.22 μm微過濾膜過濾之后檢測。

2.2.2 對照品標(biāo)準(zhǔn)工作液制備

準(zhǔn)確稱量250 mg L-賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品放入100 ml容量瓶中，加1 N鹽酸，溶解后定容至刻度。分別取1、2、3、4、5 ml此溶液放入50 ml容量瓶中，準(zhǔn)確加入0.1%正纈氨酸溶液5 ml，用檸檬酸鈉緩沖液定容至50 ml，充分搖勻，用0.22 μm微過濾膜過濾之后上機(jī)檢測。

2.3 線性關(guān)系考察

取對照品標(biāo)準(zhǔn)工作液，按2.1項下色譜條件測定，以含量（x，mg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，得回歸方程：y=5 058.057 14x+15.242 857,r=0.999 6。L-賴氨酸硫酸鹽在0～0.25 mg/ml范圍內(nèi)，其含量與峰面積呈良好的線性關(guān)系(見圖1)。

圖1 對照品標(biāo)準(zhǔn)液校正曲線

2.4 對照品與樣品的色譜圖

分別取對照品溶液與樣品溶液按2.1項下色譜條件測定。對照品與樣品的色譜圖見圖2。圖2中樣品的色譜圖表明，樣品的保留時間與對照品的保留時間一致，樣品峰的峰形清晰，由此，該方法能夠較好地測定飼料添加劑L-賴氨酸硫酸鹽的含量。

圖2 HPLC色譜圖

2.5 回收率試驗

2.5.1 對照品溶液制備

準(zhǔn)確稱量250 mg L-賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品置于100 ml容量瓶中，加1 N鹽酸，溶解后定容至刻度。精確量取5 ml此溶液置于50 ml容量瓶中，準(zhǔn)確加入0.1%正纈氨酸溶液5 ml，用檸檬酸鈉緩沖液定容至50 ml，充分搖勻。

2.5.2 添加樣品溶液制備

分別精密稱取樣品200、250、300 mg置100 ml量瓶中，加1 N鹽酸使之溶解后,放入60～70℃水浴或者超聲波浴中攪拌30 min，變成懸濁液之后常溫冷卻，再用1 N鹽酸定容至100 ml，搖勻。取5 ml此溶液放入50 ml容量瓶中，準(zhǔn)確加入0.1%正纈氨酸溶液5 ml，用檸檬酸鈉緩沖液定容至50 ml，搖勻(結(jié)果見表3)。由表3的回收率測定結(jié)果可見，該方法回收率較高，可以有效地控制飼料添加劑L-賴氨酸硫酸鹽的質(zhì)量。

表3 回收率測定結(jié)果(%)

3 結(jié)論

本文采用高效液相色譜法，對飼料添加劑L-賴氨酸硫酸鹽的含量進(jìn)行定量測定，樣品前處理方法簡單；同時，該方法使用正纈氨酸作為內(nèi)標(biāo)物用以校正,可完全排除被測樣品中其他組分的干擾。該方法的重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可有效地檢測飼料中飼料添加劑L-賴氨酸硫酸鹽的含量，從而更好地控制市場上流通的飼料添加劑L-賴氨酸硫酸鹽的質(zhì)量。