沙蔥多糖對綿羊外周血淋巴細胞的調(diào)節(jié)作用研究

■包美艷 敖長金 趙飛艷 薩茹麗

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

沙蔥（Allium mongolicum regel）屬被子植物門（Angiospermae）、百合科（Liliaceae），蔥屬（Allium），學(xué)名蒙古韭，蒙古語稱為“胡穆利”，是一種生命力頑強的植物[1]。沙蔥有抑菌、抗氧化、提高免疫機能等生物活性。沙蔥多糖是沙蔥的主要活性成分之一，沙蔥多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、體外抑菌及調(diào)控瘤胃發(fā)酵等作用。扈瑞平等[2]研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥多糖通過促進免疫器官的生長發(fā)育和小鼠免疫細胞分泌IL-2、TNF-α而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能和抗腫瘤作用。宋巴達瑪[3]研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥多糖能提高肉羊血清中IL-2、IL-6含量，從而增強機體的免疫機能。淋巴細胞增殖是反映機體細胞免疫水平的一個重要指標，而NO是新發(fā)現(xiàn)的一種重要的信使分子。NO具有免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)傳遞作用。因此,研究沙蔥多糖對綿羊外周血淋巴細胞增殖、NO與iNOS分泌的影響，為進一步揭示沙蔥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用機理提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

沙蔥多糖由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)與免疫實驗室提供，使其終濃度分別為50、100、150、200、250 μg/ml，0.22 μm濾器過濾除菌。MTT（四甲基偶氮唑鹽,Amresco公司）用pH值7.2 PBS配成5 mg/ml，0.22 μm濾器過濾除菌，4 ℃避光保存。二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)；綿羊外周血淋巴細胞分離液（TBD天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）；PBS磷酸緩沖液[HyClone,賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司]；胎牛血清(Gibco公司)；無酚紅RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；一氧化氮及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶測定試劑盒(南京建成科技有限公司)；生物安全柜(Thermo)；CO2培養(yǎng)箱(Heal Force)；全自動多功能酶標儀(Biotek Synergy H4,美國)；垂直離心機(Eppendorf,德國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 綿羊外周血淋巴細胞的分離與培養(yǎng)

在綿羊頸靜脈用含肝素鈉的無菌采血管采集40 ml血液，2 500 r/min、離心10 min，棄掉上層血漿，下面的血用等體積PBS液稀釋，將稀釋的5 ml血輕輕疊加在4 ml淋巴細胞分離液層上，經(jīng)密度梯度離心(22℃、800×g垂直離心30 min)，收集中間層白色云霧狀的單個核細胞層，得到的細胞用5倍體積的PBS液(4℃)洗滌細胞2次(2 500 r/min離心10 min)，最后用完全RPMI1640培養(yǎng)液洗細胞1次（2 500 r/min離心10 min）。將細胞重懸在4 ml含10%胎牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液中。用血細胞計數(shù)板計數(shù)并調(diào)整細胞濃度至5×106個細胞/ml，于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，除去貼壁細胞,收集懸浮細胞。用PBS緩沖液洗細胞2次(1 500 r/min,離心10 min)，再用完全 RPMI1640 培養(yǎng)液重懸細胞，即得到綿羊外周血淋巴細胞。

1.2.2 綿羊外周血淋巴細胞增殖反應(yīng)的測定

將上述淋巴細胞用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為5×106個細胞/ml，并分為空白對照組（PBS）和不同濃度的試驗組接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔總體積100 μl，每組設(shè)6個重復(fù)孔。試驗組添加沙蔥多糖的終濃度分別為50、100、150、200、250 μg/ml。置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24、48、72 h。每次試驗結(jié)束前4 h，每孔加5 mg/ml的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。在每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100 μl，振蕩15 min，充分溶解結(jié)晶。在酶標儀570 nm波長下測各孔吸光度（OD570），作為淋巴細胞增殖的指標。試驗重復(fù)3次。

1.2.3 綿羊外周血淋巴細胞NO含量的測定

將上述的淋巴細胞用含10%胎牛血清的無酚紅RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為8×106個細胞/ml，以無酚紅RPMI1640培養(yǎng)液作空白對照組，試驗組添加沙蔥多糖的終濃度分別為50、100、150、200、250 μg/ml。接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1.0 ml，每組設(shè)6個重復(fù)孔。于37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h后取100 μl細胞培養(yǎng)液測定NO含量，用酶標儀在550 nm處測定吸光度（OD值）。計算公式：NO含量（μmol/l）=（OD1-OD3）/(OD2-OD3)×C×稀釋倍數(shù)（其中OD1為測定孔吸光度值；OD2為標準孔吸光度值；OD3為空白孔吸光度值；C是標準孔濃度20 μmol/l；稀釋倍數(shù)為4）。

1.2.4 綿羊外周血淋巴細胞iNOS活性的測定

以硝酸還原酶法測定iNOS活性。測定方法根據(jù)試劑盒說明書進行。計算公式：iNOS活性(U/ml)=（OD1-OD2）/38.3×10-6×2.51+A/A×1/1×15/1 000(其中OD1為測定孔吸光度值；OD2為空白孔吸光度值；A為細胞培養(yǎng)上清液)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果用“平均值±標準差（X±S.D.）”表示,采用SAS（9.0）統(tǒng)計軟件作單因素ANOVA方差分析；多重比較采用Duncan's法。

2 結(jié)果

2.1 沙蔥多糖對綿羊外周血淋巴細胞增殖的影響（見表1）

表1 沙蔥多糖對綿羊外周血淋巴細胞增殖的影響

從表1可見，各作用時間段內(nèi)沙蔥多糖濃度為50～100 μg/ml時抑制淋巴細胞的增殖，與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。沙蔥多糖濃度為150～250 μg/ml時促進淋巴細胞的增殖。隨著沙蔥多糖濃度的加大，對淋巴細胞增殖作用也增強。沙蔥多糖作用24、48、72 h后，淋巴細胞增殖作用依次顯著減弱（P＜0.05），各濃度組在3個作用時間點之間均差異顯著，呈現(xiàn)時效關(guān)系，其中沙蔥多糖24 h、250 μg/ml組對淋巴細胞增殖作用最強，與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）；而72 h、50 μg/ml組對淋巴細胞增殖作用最弱，與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 沙蔥多糖對綿羊外周血淋巴細胞NO含量及iNOS活性的影響（見表2）

表2 沙蔥多糖對綿羊外周血淋巴細胞NO及iNOS含量的影響(n=6)

由表2可見，沙蔥多糖濃度為50～100 μg/ml抑制NO的分泌，隨著濃度的加大，150～250 μg/ml淋巴細胞內(nèi)NO的含量有增加趨勢，其中濃度為250 μg/ml淋巴細胞內(nèi)NO的含量最高，與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，其他各組差異均不顯著(P＞0.05)。沙蔥多糖各個濃度組與對照組相比，對iNOS的影響差異不顯著(P＞0.05)，250 μg/ml沙蔥多糖組iNOS活性最高。

3 討論

3.1 沙蔥多糖對綿羊外周血淋巴細胞增殖的影響

細胞增殖試驗是測定免疫細胞功能的方法之一。淋巴細胞受到各種因子刺激時會發(fā)生細胞增殖。在細胞增殖過程中，細胞的代謝處于旺盛狀態(tài)。細胞增殖需要大量的能量，以供合成各種大分子物質(zhì)和完成分裂過程。因此，細胞能量代謝的水平往往可以間接反映細胞增殖情況。Mosmann根據(jù)這一原理首創(chuàng)了MTT比色分析方法[4]。

趙現(xiàn)敏等[5]報道，將4種中藥多糖(板藍根多糖、牛膝多糖、山藥多糖和黃芪多糖)用MTT比色法比較對豬脾淋巴細胞增殖的影響，結(jié)果表明，4種多糖均能顯著刺激用ConA或LPS誘導(dǎo)的豬脾淋巴細胞增殖。聶小華等[6]報道,黃芪多糖對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾臟T淋巴細胞增殖具有顯著的促進作用。王德云等[7]研究了4種濃度(150、300、600和1 200 μg/ml)的黃芪多糖對培養(yǎng)的雞脾臟淋巴細胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn)黃芪多糖在150 μg/ml時協(xié)同ConA或LPS刺激淋巴細胞增殖的作用最強,并提出中藥成分對體外淋巴細胞的增殖作用具有一定的量效關(guān)系。邱妍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，牛膝多糖能促進雛雞外周血T淋巴細胞增殖,并有一定的量效和時效關(guān)系。本試驗研究結(jié)果表明，沙蔥多糖濃度為50～100 μg/ml時抑制淋巴細胞增殖，高濃度組（150～250 μg/ml）促進淋巴細胞增殖，并且各濃度組在3個作用時間點之間差異顯著(P＜0.05)，呈現(xiàn)有一定的量效和時效關(guān)系。這表明沙蔥多糖在體外對淋巴細胞增殖有調(diào)節(jié)作用。

3.2 沙蔥多糖對綿羊外周血淋巴細胞一氧化氮、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶含量的影響

一氧化氮是一氧化氮合成酶催化L-精氨酸末端胍基中的一個氮原子氧化而生成的產(chǎn)物,參與體內(nèi)多種生理病理過程。一氧化氮的體內(nèi)作用具有雙重性，既有保護作用，又有損傷作用。研究表明，巨噬細胞可受TNF、IFN2-γ等細胞因子和內(nèi)毒素脂多糖誘導(dǎo)活化，合成和釋放大量NO[9]。另據(jù)文獻報道，D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠皮層NO含量明顯增高，提示衰老與NO有關(guān)[10]。蘆薈多糖刺激體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細胞24 h，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞NO生成量增加[11]。香菇多糖或香菇多糖協(xié)同干擾素對小鼠巨噬細胞NO的產(chǎn)生具有明顯的促進作用，香菇多糖也可以升高脾細胞內(nèi)的Ca2＋濃度、cAMP、cGMP，促進脾淋巴細胞產(chǎn)生NO[12]。NO具有殺傷腫瘤細胞活性，并且可通過增加表面分子誘導(dǎo)細胞免疫[13]。另據(jù)研究表明，NO介導(dǎo)廣泛的腫瘤毒性[14]，并在腫瘤血管形成、腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[15]。NOS信使核糖核酸廣泛分布于心血管系統(tǒng),它在相當短的時間即可被Ca2+激活,并產(chǎn)生少量的NO[16]。Kim等[13]報道，桔梗多糖激活巨噬細胞產(chǎn)生NO而表現(xiàn)出殺傷腫瘤細胞的活性。Currie(1978)提出，激活的巨噬細胞可產(chǎn)生精氨酸酶，使L-精氨酸轉(zhuǎn)變成鳥氨酸和尿素。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，精氨酸酶抑制NO合成酶，從而抑制巨噬細胞利用L-精氨酸合成NO[17]。陳炅然等[18]研究表明，蕨麻多糖能明顯促進體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細胞增殖和一氧化氮的分泌。丁航等[19]研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖能刺激小鼠腹腔巨噬細胞提高iNOS活性和NO的生成。本試驗研究結(jié)果表明，沙蔥多糖濃度為50～100 μg/ml抑制NO的分泌，隨著濃度的加大，濃度為150～250 μg/ml淋巴細胞內(nèi)NO的含量有增加趨勢。但沙蔥多糖對淋巴細胞內(nèi)iNOS活性沒有顯著的作用，沙蔥多糖對綿羊外周血淋巴細胞內(nèi)iNOS活性的影響尚待進一步研究。

4 結(jié)論

沙蔥多糖在體外通過促進淋巴細胞增殖及NO的釋放，表明其對綿羊外周血淋巴細胞具有免疫調(diào)節(jié)作用。