垂花百合鱗片離體培養(yǎng)研究

雷家軍，徐 瑩

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，沈陽(yáng) 110866）

垂花百合（Lilium cernuum Komar.）是百合科百合屬多年生球根花卉，植株低矮，是百合屬中少有的紫色種類，且有香味，是一種珍貴的野生百合資源。目前垂花百合自然分布的群體正在迅速減少[1]。由于垂花百合種子繁殖周期較長(zhǎng)，鱗片扦插又很難在短期內(nèi)獲得大量植株。因此，有必要應(yīng)用離體培養(yǎng)技術(shù)建立一套高效快繁體系，以利垂花百合資源的保存、研究和利用。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)百合離體培養(yǎng)進(jìn)行了較多研究，從不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)[2]、不同激素濃度[3]、蔗糖和活性炭[4-5]對(duì)不定芽的影響及雜種胚培養(yǎng)[6]等方面都有較多研究，但對(duì)垂花百合離體培養(yǎng)的研究卻很少[7-9]。本試驗(yàn)以垂花百合鱗片為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)、增殖、生根和扦插試驗(yàn)，旨在為垂花百合離體快繁提供一套切實(shí)可行的技術(shù)措施，為其資源保護(hù)、快速繁殖及利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)于2010年5月～2011年7月進(jìn)行。供試材料垂花百合（Lilium cernuum Komar.）取自遼寧省開原市，采集健壯的地下鱗莖，除去鱗莖表面泥土，去掉受損或發(fā)黃的鱗片，取中、外層鱗片為外植體。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒

將鱗片于流水下沖洗30 min，在超凈工作臺(tái)上用70%的酒精處理30 s后，用0.1%升汞分別浸泡8、10、12、14 min，然后用無(wú)菌水沖洗5遍，接種在培養(yǎng)基MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1上，統(tǒng)計(jì)外植體污染率和成活率，采用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，下同。污染率（%）=污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；成活率（%）=誘導(dǎo)不定芽外植體數(shù)/未污染外植體數(shù)×100%。

1.2.2 初代培養(yǎng)

垂花百合鱗片細(xì)長(zhǎng)，將鱗片分為上、中、下三個(gè)部分，接種在MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1培養(yǎng)基上，30d后調(diào)查外植體誘導(dǎo)不定芽情況。誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)不定芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

選中、下部鱗片為外植體，接種在6種培養(yǎng)基上：① MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1；② MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1；③ MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1；④ MS+BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1；⑤ MS+BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1；⑥ MS+BA 1.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1。30 d后調(diào)查外植體誘導(dǎo)不定芽情況。離體培養(yǎng)條件為溫度25℃，光照強(qiáng)度1 500 lx，光照時(shí)數(shù)12 h·d-1，下同。

1.2.3 繼代培養(yǎng)

將初代培養(yǎng)誘導(dǎo)出的芽叢分成單株，轉(zhuǎn)接在上述6種培養(yǎng)基上，30 d后調(diào)查不定芽增殖和生長(zhǎng)情況。

1.2.4 生根培養(yǎng)

將繼代增殖培養(yǎng)出的小苗分為單株，轉(zhuǎn)接到3種培養(yǎng)基上：①1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1；②1/2MS+IBA0.5mg·L-1+0.5g·L-1AC；③1/2MS+IBA1.0mg·L-1+0.5 g·L-1AC。20 d后調(diào)查組培苗生根情況。

1.2.5 煉苗移栽

在生根培養(yǎng)基中，待組培苗根系長(zhǎng)至2～4 cm時(shí)，開瓶煉苗5～7 d后扦插于4種基質(zhì)中：①草炭∶蛭石=1∶1；②草炭∶蛭石=2∶1；③河沙；④草炭，溫室內(nèi)正常管理。30 d后調(diào)查組培苗成活和生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)鱗片消毒效果的影響

試驗(yàn)比較了70%酒精處理30 s后，再用0.1%升汞消毒不同時(shí)間對(duì)鱗片消毒效果的影響（見表1）。結(jié)果表明，用0.1%升汞浸泡12 min效果最好，污染率低（13.3%），且成活率高（92.6%）；用0.1%升汞浸泡8 min，雖然外植體的成活率最高（100%），但其污染率（43.3%）極顯著高于前者；用0.1%升汞浸泡14 min時(shí)，雖然污染率（8.3%）最低，但外植體成活率（65.6%）極顯著低于其他各處理，因此消毒時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

2.2 鱗片不同部位對(duì)誘導(dǎo)不定芽的影響

鱗片接種7 d后逐漸由白色轉(zhuǎn)為綠色，且部分鱗片表面呈現(xiàn)紫紅色，20 d后鱗片邊緣或表面出現(xiàn)白色或淡綠色粒狀小突起，25 d后這些小突起相繼長(zhǎng)出淺綠色不定芽（見圖1A）。鱗片不同部位的誘導(dǎo)率和再生芽數(shù)有較大差異（見表2）。下部鱗片誘導(dǎo)率最高（75.0%），且平均每個(gè)外植體可誘導(dǎo)出2.7個(gè)不定芽，極顯著高于中部鱗片和上部鱗片。因此，下部鱗片是最佳的接種材料；其次為中部鱗片，誘導(dǎo)率為68.3%，平均每個(gè)外植體可誘導(dǎo)不定芽2.3個(gè)；而上部鱗片誘導(dǎo)率最低（38.3%），平均每個(gè)外植體誘導(dǎo)不定芽數(shù)極顯著低于下部和中部鱗片，僅為1.5個(gè)。

表1 不同消毒時(shí)間對(duì)垂花百合鱗片消毒效果的影響Table 1 Effect of different methods on disinfection of bulb scales of Lilium cernuum

圖1 垂花百合鱗片不定芽的誘導(dǎo)（A）與增殖（B）Fig.1 Adventitious buds induction（A）and multiplication（B）in vitro from bulb scales of Lilium cernuum Komar.

表2 垂花百合鱗片不同部位對(duì)誘導(dǎo)不定芽的影響Table 2 Effect of different parts of scales on inducing adventitious buds of Lilium cernuum

2.3 不同激素濃度對(duì)鱗片不定芽誘導(dǎo)和增殖的影響

垂花百合鱗片在6種培養(yǎng)基上均可誘導(dǎo)出不定芽，但不同激素濃度培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率和平均每外植體誘導(dǎo)不定芽數(shù)存在一定差異（見表3）?？梢钥闯?，隨著BA/NAA的提高，誘導(dǎo)率逐漸降低，說(shuō)明高比值的BA/NAA不利于垂花百合鱗片誘導(dǎo)不定芽。BA和NAA濃度同為0.5 mg·L-1或同為1.0 mg·L-1的兩個(gè)培養(yǎng)基最適于鱗片誘導(dǎo)不定芽，即培養(yǎng)基MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1和 MS+BA 1.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1是垂花百合鱗片最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率分別達(dá)到67.5%和72.5%，平均每外植體分別誘導(dǎo)2.4個(gè)和2.2個(gè)不定芽。垂花百合鱗片誘導(dǎo)出的不定芽轉(zhuǎn)接在6種培養(yǎng)基上的增殖系數(shù)均在2.0以上（見表4）。試驗(yàn)觀察到，雖然BA濃度變大時(shí)增殖系數(shù)變化不大，但植株生長(zhǎng)緩慢，葉片稀少，因此，高濃度的BA不利于組培苗的生長(zhǎng)。MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1為垂花百合最適增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)為2.9，且植株生長(zhǎng)健壯、整齊、生根多，平均株高可達(dá)6.8 cm（見圖1B）。

2.4 不同激素濃度對(duì)組培苗生根的影響

垂花百合組培苗生根較快，15 d即可長(zhǎng)出大量根系。組培苗接種在添加0.5 mg·L-1BA培養(yǎng)基上的生根率（99.4%）顯著高于接種在添加1.0 mg·L-1IBA培養(yǎng)基（見表5），且根系生長(zhǎng)健壯；隨著IBA濃度升高，組培苗生根率下降，根較粗壯，有木質(zhì)化現(xiàn)象，添加活性炭的培養(yǎng)基生根數(shù)顯著少于不添加活性炭的培養(yǎng)基，根長(zhǎng)度在各處理間無(wú)差異。因此，培養(yǎng)基1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1較適宜誘導(dǎo)垂花百合組培苗生根。

表3 不同激素濃度對(duì)垂花百合鱗片誘導(dǎo)不定芽的影響Table 3 Effect of different hormone concentration on inducing adventitious buds of Lilium cernuum

表4 不同激素濃度對(duì)垂花百合不定芽增殖的影響Table 4 Effect of different hormone concentration on adventitious buds multiplication of Lilium cernuum

表5 不同激素濃度對(duì)垂花百合組培苗生根的影響Table 5 Effect of different hormone concentration on rooting of tube plantlets of Lilium cernuum

2.5 不同基質(zhì)對(duì)組培苗扦插成活的影響

基質(zhì)對(duì)垂花百合組培苗扦插成活有顯著影響（見表6）。扦插在河沙上的組培苗成活率最高，達(dá)94.0%，且苗長(zhǎng)勢(shì)良好，其次是草炭∶蛭石（1∶1）和草炭∶蛭石（2∶1），而扦插在草炭上的組培苗成活率極顯著低于其他各處理，僅為25%。

表6 不同基質(zhì)對(duì)垂花百合組培苗扦插成活的影響Table 6 Effect of different media on tube plantlets survival of Lilium cernuum

3 討論與結(jié)論

垂花百合可以采用鱗片離體培養(yǎng)短期內(nèi)獲得大量組培苗。其最佳消毒方法是70%酒精處理30 s再用0.1%升汞浸泡12 min，污染率低，且成活率高。隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，雖然污染率降低，但消毒液的毒害作用會(huì)導(dǎo)致外植體的成活率極顯著降低。垂花百合鱗片不同部位誘導(dǎo)不定芽的能力差異顯著，誘導(dǎo)能力從強(qiáng)到弱依次為：下部鱗片＞中部鱗片＞上部鱗片，可能是下部鱗片較肥厚，且細(xì)胞幼嫩，更易誘導(dǎo)出不定芽，而上部鱗片尖而薄，較老化，許多學(xué)者在松葉百合[7]、東方百合[10-11]、蘭州百合和野百合[15]研究中也有類似的結(jié)論。合理的激素濃度配比是百合離體誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素[11-12]，垂花百合鱗片誘導(dǎo)不定芽對(duì)BA和NAA的濃度配比有一定要求，隨著BA/NAA的增高，誘導(dǎo)率逐漸降低，這與王剛在蘭州百合和野百合組培快繁中的結(jié)論一致[12]，但與郭海濱在索邦百合鱗片離體誘導(dǎo)中的結(jié)果不一致[11]，她認(rèn)為BA/NAA為1.5/0.2時(shí)最適合不定芽分化，這可能與百合種類不同有關(guān)。

本試驗(yàn)觀察到低濃度IBA有利于組培苗生根，IBA濃度過(guò)高，生根率下降，根變粗、且木質(zhì)化，這與葛蓓孛等觀察的細(xì)葉百合再生苗生根結(jié)果一致[13]，同時(shí)，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：添加活性炭時(shí)，生根數(shù)明顯減少，這與張素勤等在非洲菊研究中的結(jié)果[14]不一致，活性炭對(duì)不同植物生根的影響還需做進(jìn)一步的研究和探討。垂花百合組培苗扦插成活對(duì)基質(zhì)有一定要求，在供試的三種基質(zhì)中，河沙是最適合的扦插基質(zhì)，這可能是因?yàn)楹由惩笟?、排水性好，且較致密，有利于組培苗生根成活。

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