寒地粳稻耐鹽愈傷組織生理特性及再分化研究

趙宏偉，薩日娜

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所，哈爾濱 150030）

水稻（Oryza sativa）是我國城鄉(xiāng)居民的主要口糧之一，東北是全國粳稻主產(chǎn)區(qū)。黑龍江省水稻產(chǎn)量在東北稻作區(qū)占有舉足輕重位置，其種植面積占東北稻作總面積的58.1%[1]。鹽害是影響大田作物生產(chǎn)的嚴(yán)重問題，近年來隨著自然生態(tài)環(huán)境的惡化及人為破壞，干旱頻繁發(fā)生，灌溉方式不合理等造成的土壤鹽漬化越來越嚴(yán)重，鹽漬化土壤面積越來越大。

水稻是一種對鹽堿中度敏感的作物[2]，土壤鹽堿化不利于水稻生長，因此選育水稻耐鹽新品種是實(shí)現(xiàn)鹽漬化區(qū)域稻作高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要途徑[3]。常規(guī)育種方法效率低且周期長，近年來運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)在耐鹽品種的篩選方面取得一定進(jìn)展[4]。本試驗(yàn)以兩個寒地粳稻品種長白3和龍稻9為試驗(yàn)材料，分析在不同NaCl濃度脅迫下，胚性愈傷組織的生長量、生理特性及其分化能力，并獲得再生植株，為北方寒地粳稻利用組織培養(yǎng)技術(shù)選育耐鹽突變體的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

龍稻9，粳型常規(guī)糯稻，黑龍江省農(nóng)業(yè)科院耕作栽培研究所提供。

長白3，粳型常規(guī)水稻，吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 耐鹽突變體的選擇培養(yǎng)

采用逐步提高培養(yǎng)基NaCl濃度的方法，即把繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)2代的愈傷組織轉(zhuǎn)移到50 mmol·L-1NaCl的培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2代，每代1周。選擇生長良好的愈傷組織切成小塊（直徑為2～3 mm），轉(zhuǎn)移到高濃度的培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)，每個培養(yǎng)基接12塊。依照此方法在每個不同濃度NaCl的培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2代。選擇培養(yǎng)的同時，調(diào)查記錄愈傷組織生長量，并把部分生長良好的愈傷組織移入分化培養(yǎng)基上（于27℃光照培養(yǎng)，光強(qiáng)約2 000 lx，每日光照12 h）誘導(dǎo)再生植株。

1.2.2 試驗(yàn)中有關(guān)指標(biāo)的測定

①愈傷組織生長量（g）=培養(yǎng)后的愈傷組織重量-培養(yǎng)前的愈傷組織重量；

②愈傷組織相對生長量（%）=愈傷組織生長量/培養(yǎng)前愈傷組織重量×100%；

③脯氨酸含量測定采用茚三酮法；

④丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸法；

⑤綠苗分化率（%）=長出綠苗的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織總塊數(shù)×100%。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配置

①誘導(dǎo)培養(yǎng)基：誘導(dǎo)和增殖愈傷組織，NMB（N6大量元素+MS微量元素+B5有機(jī)物），附加2，4-D 2 mg·L-1，6-BA 1 mg·L-1，蔗糖3%，水解酪蛋白0.03%，瓊脂粉0.7%，pH 5.80。

②選擇培養(yǎng)：在誘導(dǎo)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別加入50、100、150 mmol·L-1NaCl，以不加NaCl的培養(yǎng)基為對照，pH 5.80。

③再分化培養(yǎng)基：基本成分是MS，培養(yǎng)基附加6-BA 3 mg·L-1，NAA 1 mg·L-1，蔗糖3%，水解酪蛋白0.03%，瓊脂粉0.7%，pH 5.80。

1.3.2 培養(yǎng)條件

愈傷組織的誘導(dǎo)：選取飽滿成熟的水稻種子，剝?nèi)シf殼選取干凈完整的穎果。在超凈工作臺內(nèi)先用70%酒精處理1 min，無菌水沖洗3～4次，再用10%的次氯酸鈉處理10 min，然后用無菌水沖洗5～6次，用無菌濾紙吸干后，接種于固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每個培養(yǎng)皿接種20～23個外植體，在24～26℃條件下暗培養(yǎng)12 d，誘導(dǎo)愈傷組織形成。

愈傷組織的繼代培養(yǎng)：將誘導(dǎo)出的愈傷組織切下來，轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上，24～26℃暗培養(yǎng)2周。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對水稻愈傷組織生長的影響

水稻成熟胚誘導(dǎo)出的愈傷組織繼代1次后，采用逐步提高培養(yǎng)基中NaCl濃度的方法，在每個培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)兩代，調(diào)查生長量。由表1可知，隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度的提高，水稻愈傷組織鮮重生長量逐步降低。2個品種表現(xiàn)出同樣的變化趨勢，對照的鮮重生長量最多，為3.48和3.54 g，而在150 mmol·L-1濃度下其生長量最少，低至1.29和0.81 g。

相對生長量是增重量占總重量的比例，更能體現(xiàn)出不同NaCl濃度處理下愈傷組織在單位時間內(nèi)鮮重生長的速度，相對生長量越高生長能力越強(qiáng)。由圖1可知，隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度的提高，2個水稻品種愈傷組織相對生長量變化趨勢基本相同，均呈下降趨勢，降低程度因不同基因型品種而異。在相同NaCl濃度下，長白3愈傷組織相對生長量高于龍稻9。NaCl濃度低于50 mmol·L-1時，長白3愈傷組織相對生長量差異不大，NaCl濃度高于100 mmol·L-1時，愈傷組織相對生長量降低程度較為明顯，當(dāng)NaCl濃度增至150 mmol·L-1時，愈傷組織相對生長量降低至10%以下，這說明NaCl濃度在100 mmol·L-1時已開始抑制愈傷組織的生長；龍稻9愈傷組織在50和100 mmol·L-1濃度下，相對生長量降低程度較為平均，但比較0和150 mmol·L-1濃度時發(fā)現(xiàn)，愈傷組織相對生長量明顯降低，從23.62%降低至8.67%。這說明濃度在150 mmol·L-1時明顯抑制愈傷組織生長。因此，可以把100 mmol·L-1作為長白3篩選耐鹽突變體的選擇劑量；把150 mmol·L-1作為龍稻9篩選耐鹽突變體的選擇劑量。

表1 不同NaCl濃度處理下愈傷組織的生長量Table 1 Callus growth under different NaCl concentration treatments

圖1 不同NaCl濃度處理下愈傷組織相對生長量Fig.1 Callus relative growth under different NaCl concentration treatments

2.2 鹽脅迫對水稻愈傷組織脯氨酸含量的影響

由圖2可知，隨著NaCl濃度的提高，水稻愈傷組織脯氨酸含量呈先增加后下降的趨勢，2個水稻品種的變化趨勢相同，而脯氨酸含量因不同基因型品種而異，除對照外，長白3愈傷組織脯氨酸含量都高于龍稻9，且在50和100 mmol·L-1濃度下最為明顯。2個水稻品種愈傷組織脯氨酸含量均在100 mmol·L-1濃度下最高，在150 mmol·L-1濃度下降低，且較對照都有所增加。

2.3 鹽脅迫對水稻愈傷組織丙二醛含量的影響

由圖3可知，隨著NaCl濃度的提高，水稻愈傷組織丙二醛含量呈先上升后下降再上升的趨勢，2個水稻品種的變化趨勢相同，丙二醛含量因不同基因型品種而異，除對照處理外，長白3愈傷組織丙二醛含量都高于龍稻9，且在50 mmol·L-1濃度下最為明顯。2個水稻品種愈傷組織在50、100和150 mmol·L-1濃度下丙二醛含量均較對照成倍增加，以長白3為例，它在50、100和150 mmol·L-1濃度下丙二醛含量較對照分別增加3.95倍、1.93倍和2.53倍。

圖2 不同NaCl濃度處理下愈傷組織脯氨酸含量Fig.2 Pro content under different NaCl concentration treatments

圖3 不同NaCl濃度處理下愈傷組織丙二醛含量Fig.3 MDA content under different NaCl concentration treatments

2.4 鹽脅迫后水稻愈傷組織再分化情況

水稻愈傷組織經(jīng)逐步選擇培養(yǎng)2代后，每個處理選擇生長良好的愈傷組織，切成相同大小的小塊，轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，調(diào)查綠點(diǎn)數(shù)、綠苗數(shù)及分化率。

由表2可知，隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度的提高，除龍稻9在100 mmol·L-1濃度外，2個水稻品種的愈傷組織再分化率均呈現(xiàn)下降趨勢。2個水稻品種的愈傷組織在低濃度NaCl處理下，長白3的再分化率高于龍稻9，但隨著NaCl濃度的升高，長白3的再分化率反而比龍稻9的低。如相同NaCl濃度50 mmol·L-1下，長白3的再分化率較龍稻9高出12.47%，而在150 mmol·L-1濃度下，長白3的再分化率較龍稻9低6.25%。2個水稻品種愈傷組織均在150 mmol·L-1濃度下再分化率明顯降低，為18.75%和12.5%。

表2 不同NaCl濃度處理下水稻愈傷組織再分化率Table 2 Callus differentiation rate under different NaCl concentration treatments

3 討論

本試驗(yàn)以2個寒地粳稻品種成熟胚誘導(dǎo)出的愈傷組織為試驗(yàn)材料，以NaCl為誘變劑進(jìn)行耐鹽突變體篩選，通過對愈傷組織生長速率的研究，確定最適的選擇計(jì)量[5]。李洪建試驗(yàn)證明，不同基因型品種篩選耐鹽變異體合適的選擇劑量亦不相同[6]。試驗(yàn)結(jié)果證明，長白3篩選耐鹽變異體合適的選擇劑量為100 mmol·L-1，龍稻9為150 mmol·L-1。

脯氨酸是一種滲透調(diào)節(jié)劑，在植物滲透調(diào)節(jié)中主要積累溶質(zhì)。在干旱、鹽漬等脅迫條件下，水稻體內(nèi)脯氨酸大量積累，降低細(xì)胞的滲透勢，適應(yīng)外界的低水勢[7-8]。謝國生等研究表明，鹽堿脅迫下水稻幼苗脯氨酸的積累程度是反映水稻幼苗傷害程度的重要指標(biāo)之一[9]。本試驗(yàn)中，2個水稻品種的愈傷組織在不同NaCl濃度處理下，脯氨酸積累趨勢相同，除對照外，長白3愈傷組織脯氨酸積累量均高于龍稻9。趙勇等指出，鹽脅迫下植物組織中脯氨酸含量可以作為一種鹽脅迫的傷害指標(biāo)[10]，因此長白3愈傷組織在鹽脅迫下更容易受到傷害。2個水稻品種的愈傷組織，隨著NaCl濃度的升高脯氨酸積累增多，這與劉展基等研究結(jié)果一致[11]，100 mmol·L-1處理時脯氨酸積累達(dá)最大值，隨后減少，150 mmol·L-1時出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，但愈傷組織中脯氨酸積累量都較50 mmol·L-1對照多。

植物遭受逆境傷害時通常會發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量高低可體現(xiàn)植物遭受逆境傷害的程度[12]，并且可作為耐鹽性篩選的生理指標(biāo)[13]。本試驗(yàn)中，2個水稻品種愈傷組織在不同NaCl濃度處理下，丙二醛含量增加趨勢相同，除對照外，長白3愈傷組織丙二醛含量都高于龍稻9，因此本試驗(yàn)結(jié)果可說明龍稻9愈傷組織的耐鹽性較長白3高。本試驗(yàn)中，2個水稻品種愈傷組織中的丙二醛含量，隨著NaCl濃度的升高均呈先上升后下降再上升的趨勢，出現(xiàn)2個轉(zhuǎn)折點(diǎn)，當(dāng)NaCl濃度在50 mmol·L-1時愈傷組織中丙二醛含量最多，說明50 mmol·L-1時遭受的鹽傷害比其他處理大，這與范晶等研究結(jié)果不同，隨著鹽濃度的增加番茄植株丙二醛含量呈上升趨勢[14]。

近年來利用細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行離體篩選，已獲得一批耐鹽突變體[15]。陳香蘭等應(yīng)用組織培養(yǎng)方法培育出耐鹽堿水稻新品種[16]。本試驗(yàn)中，2個品種水稻愈傷組織在不同NaCl濃度培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中，第6天開始綠點(diǎn)分化，第12天綠點(diǎn)分化基本結(jié)束開始分化綠苗，NaCl濃度為50 mmol·L-1時最早分化綠點(diǎn)，低濃度的NaCl促進(jìn)愈傷組織分化。除龍稻9的100 mmol·L-1處理外，2個品種水稻的愈傷組織再分化率隨著NaCl濃度升高而減少。在低NaCl濃度處理下，長白3的再分化率高于龍稻9，而在高NaCl濃度處理下則相反，這表明龍稻9愈傷組織的耐鹽性較長白3強(qiáng)。

4 結(jié)論

采用逐步提高培養(yǎng)基中NaCl濃度的方法，對寒地粳稻長白3和龍稻9成熟胚誘導(dǎo)出的愈傷組織進(jìn)行選擇培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，其生長量、脯氨酸含量和丙二醛含量較對照都有所提升，但再分化率隨著NaCl濃度的升高而減少；2個寒地粳稻成熟胚誘導(dǎo)出的愈傷組織經(jīng)不同NaCl濃度處理后，生長量、脯氨酸含量和丙二醛含量變化趨勢均相同，長白3愈傷組織中各生理指標(biāo)含量均高于龍稻9，且在較高NaCl濃度處理下長白3的再分化率低于龍稻9，證明龍稻9愈傷組織的耐鹽性較長白3強(qiáng)。

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