黑穗醋栗總黃酮的抗氧化及抗非酶糖基化活性研究

徐雅琴，李 靜，于澤源，楊 昱，于子淇

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

黑穗醋栗(Ribes nigrum L.)，俗名黑加侖、黑豆果，是一種適宜于逆溫帶生長(zhǎng)的多年生小灌木，屬于虎耳草科。其果實(shí)有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含黃酮、活性多糖、維生素、氨基酸、礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分[1]。其中的黃酮類化合物是黑穗醋栗果實(shí)中有效功能性成分之一，據(jù)相關(guān)研究表明，黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌癥、抗糖基化、抗炎癥等生理活性，同時(shí)在醫(yī)藥、化妝、保健、食品加工方面有廣泛用途[2]。近幾年研究表明，蛋白質(zhì)與羰基化合物發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)，形成的糖基化終產(chǎn)物（AGEs），與糖尿病、衰老、老年性癡呆癥、動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)[3]。

本文對(duì)黑穗醋栗黃酮的抗氧化性以及非酶糖基化反應(yīng)中Amodori產(chǎn)物形成階段、二羰基化合物形成階段和終產(chǎn)物AGEs形成階段的抑制作用分別進(jìn)行研究，為黑穗醋栗的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

黑穗醋栗（布勞德）（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站）；牛血清蛋白（哈爾濱華美生物工程公司）；1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）（Sigma公司）；氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT)及其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

T6新悅-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芒生物科技），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠），熒光/磷光發(fā)光光度計(jì)LS45（美國(guó)PerkinElmer）。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮的制備

稱取10 g黑穗醋栗果漿，按液料比1:12加入95%乙醇，在功率500 W下超聲提取3次，每次30 min。過(guò)濾，將3次濾液混合，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用乙酸乙酯萃取黃酮類物質(zhì)，減壓濃縮除去乙酸乙酯，用95%乙醇溶解，多次提取富集，冷凍備用。

1.2.2 總黃酮的含量測(cè)定[4]

以蘆丁為對(duì)照品，按照紫外分光光度法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，在266 nm處測(cè)定提取物中總黃酮含量。蘆丁濃度c在0～1.00 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度（A）具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為：A=17.661c+0.0046，R2=0.9996。

1.2.3 羥自由基(·OH)清除能力的測(cè)定

參照Fenton反應(yīng)建立反應(yīng)體系模型[5]，向試管中加 2.00 mL 8 mmol·L-1FeSO4，2.00 mL 8 mmol·L-1水楊酸-乙醇，2.00 mL濃度為0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 mg·mL-1的黃酮提取液，最后加2.00 mL 8.8 mmol·L-1H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)30 min，在510 nm下測(cè)定各反應(yīng)溶液的吸光度A1。以2.00 mL蒸餾水代替2.00 mL H2O2溶液作空白調(diào)零，以2.00 mL蒸餾水代替黃酮溶液測(cè)吸光值A(chǔ)0。以2.00 mL 8 mmol·L-1FeSO4，2.00 mL 8 mmol·L-1水楊酸-乙醇，2.00 mL不同濃度黃酮提取液和2.00 mL蒸餾水作為黃酮的本底值A(chǔ)2，計(jì)算清除率，VC做陽(yáng)性對(duì)照。所有試驗(yàn)均3次重復(fù)，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.4 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法[6]，取50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2）5 mL，加入4.7 mL H2O，混勻后25℃水浴保溫20 min。然后加入3 mmol·L-1鄰苯三酚0.3 mL，立即于319 nm處每隔30 s記錄一次吸光度(A0)，持續(xù)10 min，計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值(V0)。再依上法試驗(yàn)，在加入鄰苯三酚前加入濃度分別為0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg·mL-1的黑穗醋栗總黃酮溶液2.0 mL，混勻25℃水浴保溫20 min，取出后立即加入25℃預(yù)熱過(guò)的3 mmol·L-1的鄰苯三酚0.3 mL，混勻，于319 nm處每隔30 s記錄1次吸光度(At)，持續(xù)10 min。計(jì)算線形范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值(Vt)。以VC作陽(yáng)性對(duì)照，按照下面公式計(jì)算黑穗醋栗總黃酮對(duì)O2-·的清除率。

1.2.5 DPPH自由基清除能力的測(cè)定[7-8]

取濃度分別為 0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mg·mL-1的黑穗醋栗黃酮溶液2.00 mL于試管中，加入0.3 mmol·L-1DPPH 2.00 mL，避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(Ai)；再取上述黃酮溶液2 mL，加入2.00mL無(wú)水乙醇，反應(yīng)30 min測(cè)吸光度(Aj)；取2.00 mL DPPH，加入2.00 mL無(wú)水乙醇，反應(yīng)30 min測(cè)吸光度(A0)。以Vc做陽(yáng)性對(duì)照，按照下面公式計(jì)算黑穗醋栗總黃酮對(duì)DPPH自由基清除率。

1.2.6 糖基化活性研究

1.2.6.1 體外非酶糖基化體系的建立[9]

在無(wú)菌條件下，向無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入用0.2 μm除菌膜除菌后的20.00 g·L-1牛血清白蛋白溶液和0.50 mol·L-1葡萄糖溶液各5.00 mL，加入含1%NaN3的0.20 mol·L-1pH 7.4的磷酸鹽緩沖液10.00 mL，建立完整糖基化體系對(duì)照組a，同時(shí)設(shè)立不加黃酮溶液不加葡萄糖溶液的對(duì)照組b；加黃酮溶液不含蛋白的對(duì)照組c；加黃酮溶液不加葡萄糖溶液的對(duì)照組d。設(shè)置溶液中黃酮終濃度分別為0.05 、0.10、0.15、0.20 mg·mL-1的干預(yù)組，37 ℃恒溫培養(yǎng) 14 d。分別于 0、2、4、6、8、10、12、14 d進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.6.2 NBT還原實(shí)驗(yàn)

取0.50 mL糖基化物質(zhì)和2.00 mL 0.3 mmol·L-1NBT在2.50 mL 100 mmol·L-1pH 10.35碳酸鈉緩沖溶液中，至于室溫孵化20 min，在最大吸收波長(zhǎng)412 nm處測(cè)定吸光度。用碳酸鈉緩沖溶液代替糖基化物質(zhì)作為空白，按公式(2-1)計(jì)算抑制率IE。公式(2-1)：

1.2.6.3 二羰基化合物含量測(cè)定[10]

取糖基化體系溶液0.40 mL與0.20 mL 500 mmol·L-1吉拉德-T儲(chǔ)備液和3.40 mL pH 2.9甲酸鈉溶液在室溫下孵化1 h，在最大吸收波長(zhǎng)277 nm處測(cè)定吸光度，以甲酸鈉溶液代替糖基化物質(zhì)為空白。以乙二醛標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算二羰基化合物含量，按公式(2-1)計(jì)算抑制率IE。

1.2.6.4 糖基化終產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的測(cè)定[11]

取出0.5 mL培養(yǎng)液，稀釋至10 mL，測(cè)定糖基化終產(chǎn)物在激發(fā)波長(zhǎng)370 nm發(fā)射波長(zhǎng)440 nm處的熒光值F，計(jì)算對(duì)非酶糖基化的抑制率IE。公式(2-2)：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的黃酮提取物對(duì)羥自由基的清除能力

從圖1中可以看出，黑穗醋栗總黃酮和Vc對(duì)羥自由基清除能力都隨濃度增加而逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度在0～0.7 mg·mL-1范圍內(nèi)，黃酮對(duì)羥自由基清除率大于Vc，當(dāng)濃度大于0.7 mg·mL-1時(shí)，Vc對(duì)羥自由基清除率高于黃酮。黑穗醋栗黃酮的IC50=0.296 mg·mL-1，Vc的IC50=0.379 mg·mL-1。黃酮和 Vc濃度對(duì)羥自由基清除率都呈顯著性差異(P＜0.05)。

圖1 對(duì)羥自由基的清除能力Fig.1 Scavenging ability of hydroxyl radicals

2.2 不同濃度的黃酮對(duì)超氧陰離子(O2-·)自由基清除能力

從圖2可以看出，Vc對(duì)O2-·自由基清除率在0～0.2 mg·mL-1范圍內(nèi)，迅速上升至95%以上之后逐漸趨于平衡。黑穗醋栗總黃酮對(duì)O2-·自由基清除率先隨濃度增加而上升之后略有下降，當(dāng)濃度為0.80 mg·mL-1時(shí)清除率達(dá)到最大81.33%，黑穗醋栗總黃酮的IC50=0.279mg·mL-1，Vc的IC50=0.0927mg·mL-1。與Vc相比黑穗醋栗總黃酮對(duì)O2-·自由基清除能力略低，但仍表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除能力。黃酮濃度對(duì)其清除率差異性比Vc的差異性顯著(P＜0.05)。

圖2 對(duì)O2-·的清除能力Fig.2 Scavenging ability of superoxide anion radicals

2.3 對(duì)DPPH自由基清除能力

由圖3可以看出，隨著黑穗醋栗總黃酮濃度的增加，對(duì)DPPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度為0.6 mg·mL-1時(shí)清除率達(dá)到57.68%，IC50=0.319 mg·mL-1；Vc隨濃度的增加，對(duì)DPPH自由基的清除能力也略有增強(qiáng)，濃度為0.6 mg·mL-1時(shí)清除率達(dá)到40.15%，IC50=8.519 mg·mL-1，可見(jiàn)黑穗醋栗總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力相對(duì)比較好。黃酮濃度在0.1，0.2，0.3mg·mL-1時(shí)，DPPH自由基的清除率顯著性差異(P＜0.05)。

圖3 對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.3 Scavenging ability of DPPH radical

2.4 黃酮的抗非酶糖基化活性

2.4.1 對(duì)Amadori產(chǎn)物生成的影響

影響結(jié)果見(jiàn)圖4和表1，在糖基化反應(yīng)初期，葡萄糖的羰基與蛋白質(zhì)游離的氨基發(fā)生作用生成西弗堿，重排成Amadori產(chǎn)物。在0～8 d內(nèi)，糖基化體系中Amadori產(chǎn)物的量明顯增加，8～14 d內(nèi)變化不大逐漸趨于平衡。不同濃度的黃酮在糖基化體系中，對(duì)Amadori產(chǎn)物的產(chǎn)生都有一定抑制作用，而且隨著黃酮濃度的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)。在濃度為0.2 mg·mL-1時(shí)，抑制率達(dá)到30.69%(P＜0.05)。

2.4.2 二羰基化合物含量測(cè)定

由圖5和表1可看出，在0～10 d內(nèi)二羰基化合物含量增加趨勢(shì)顯著，在10～14 d二羰基化合物的含量逐漸趨于平衡，加入不同濃度的黑穗醋栗總黃酮對(duì)糖基化體系中的二羰基化合物的產(chǎn)生都有一定的抑制作用，濃度增加，二羰基化合物生成量降低的越明顯，抑制作用越強(qiáng)。在濃度為0.2 mg·mL-1時(shí)，抑制率達(dá)到48.15%(P＜0.05)。

圖4 對(duì)Amadori產(chǎn)物生成的抑制作用Fig.4 Inhibitory effects of Amadori product

圖5 對(duì)二羰基化合物產(chǎn)生的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of dicarbonyl compounds

表1 黃酮對(duì)葡萄糖/BSA體系A(chǔ)madori產(chǎn)物、二羰基化合物及GAEs形成的抑制作用Table 1 The inhibitory effects of flavonoids on the formation of Amadori product,dicarbonyl compounds and GAEs in glucose/BSA system

2.4.3 非酶糖基化終產(chǎn)物熒光強(qiáng)度測(cè)定

糖基化體系在孵化過(guò)程中能夠產(chǎn)生具熒光性質(zhì)的糖基化產(chǎn)物，影響結(jié)果見(jiàn)圖6和表1，在完全糖基化體系中AGEs熒光強(qiáng)度迅速增加；加入不同濃度的黑穗醋栗總黃酮的糖基化體系中，熒光強(qiáng)度亦有所增長(zhǎng)，但與完全糖基化體系相比明顯降低；在濃度為0.2 mg·mL-1時(shí)，抑制率達(dá)到42.59%(P＜0.05)。

圖6 非酶糖基化終產(chǎn)物熒光強(qiáng)度Fig.6 Fluorescence intensity of AGEs

3 討 論

3.1 黑穗醋栗總黃酮的抗氧化作用

黑穗醋栗總黃酮提取物具有較明顯的抗氧化作用，并隨提取濃度的增加而增強(qiáng)。①羥自由基的清除試驗(yàn)可知，黑穗醋栗總黃酮在FeSO4-H2O2體系中具有良好的清除羥自由基能力，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)其清除能力隨著濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，濃度低于0.7 mg·mL-1時(shí)，黃酮對(duì)羥自由基清除率大于Vc，而0.7 mg·mL-1以后黃酮的自由基清除率增加變慢，且低于Vc的清除率。這可能是由于黃酮類化合物在濃度較高時(shí)，往往表現(xiàn)出抗氧化效果減弱或發(fā)生促氧化作用引起。②從清除超氧陰離子試驗(yàn)可知，黃酮對(duì)超氧陰離子自由基清除率先隨濃度的增加而增強(qiáng)，之后略有下降趨勢(shì)，黃酮濃度為0.8 mg·mL-1時(shí)，清除率達(dá)到最大81.33%，這種現(xiàn)象也與黃酮類化合物在高濃度時(shí)抗氧化效果不明顯有關(guān)。黑穗醋栗總黃酮和Vc的IC50分別是0.279，0.0927 mg·mL-1。從 IC50值來(lái)看，Vc對(duì)清除超氧陰離子自由基能力強(qiáng)于黑穗醋栗黃酮。③從清除DPPH試驗(yàn)可知，黑穗醋栗總黃酮對(duì)DPPH自由基也有較好清除能力，這應(yīng)該是由黃酮類化合物抗氧化所必需的基團(tuán)B環(huán)鄰二酚羥基引起[15]。當(dāng)濃度為0.6 mg·mL-1時(shí)，清除率達(dá)到57.68%。

3.2 黑穗醋栗總黃酮抗非酶糖基化作用

①在堿性溶液中Amadori產(chǎn)物可以還原NBT產(chǎn)生顏色變化，本文通過(guò)NBT還原試驗(yàn)對(duì)其吸光度的測(cè)量，可見(jiàn)黑穗醋栗總黃酮對(duì)Amadori產(chǎn)物的產(chǎn)生有抑制作用，這可能因?yàn)楹谒氪桌觞S酮中含有帶醛基的黃酮類化合物，醛類可以和蛋白質(zhì)的氨基酸殘基反應(yīng)形成Schiff堿，從而限制了葡萄糖和蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的反應(yīng)。②中期,Amadori產(chǎn)物通過(guò)氧化、水解降解成一系列二羰基化合物，是糖基化終產(chǎn)物的主要來(lái)源，結(jié)果表明，隨時(shí)間變化黃酮類化合物對(duì)二羰基化合物產(chǎn)生量也有抑制作用，可能是黃酮類化合物通過(guò)與葡萄糖醛上的羰基結(jié)合，阻止糖基化終末產(chǎn)物的形成。③晚期，二羰基化合物繼續(xù)與游離的氨基作用，形成不可逆的具有熒光性質(zhì)的AGEs。通過(guò)熒光測(cè)定，證明黃酮對(duì)AGEs有抑制作用。黑穗醋栗總黃酮對(duì)非酶糖基化反應(yīng)的三個(gè)階段的抑制作用都隨黃酮濃度的增加而增強(qiáng)，且最大抑制率分別為30.69%、48.15%、42.59%，其中對(duì)二羰基化合物形成的抑制作用較強(qiáng)。

4 結(jié)論

結(jié)果表明，黑穗醋栗總黃酮提取物對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基均有較好的清除效果，清除能力與所測(cè)濃度有明顯的量效關(guān)系即隨濃度增加而增強(qiáng)。對(duì)非酶糖基化反應(yīng)中Amadori產(chǎn)物形成階段，二羰基化合物形成階段，AGEs形成過(guò)程有抑制作用，且抑制率隨黃酮濃度的增加而增強(qiáng)，其中對(duì)二羰基化合物形成抑制作用較強(qiáng)，具有一定抗非酶糖基化作用。

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