脆壁克魯維酵母基因置換技術(shù)的建立

李 杰，曹宇婷，徐 欣，張 旭，李 璐，呂 洋，盧松沖

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

20世紀(jì)80年代后半期，應(yīng)用DNA同源重組原理，基因置換技術(shù)逐漸發(fā)展并應(yīng)用到多種領(lǐng)域。利用基因置換技術(shù)，克服隨機(jī)整合的盲目性和偶然性，能夠?qū)?xì)胞染色體進(jìn)行精確修飾和改造構(gòu)建目標(biāo)載體，而目經(jīng)修飾和改造的基因能進(jìn)行穩(wěn)定遺傳[1]。目前，基因置換技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、釀酒酵母、畢赤酵母、絲狀真菌和動(dòng)物等的基因敲除、轉(zhuǎn)基因和基因修飾研究中?？唆斁S酵母是天然新鮮牛乳中含有的微生物，來源于克魯維酵母菌的乳糖酶是一種中性乳糖酶，不僅活性高，其最適pH與天然牛乳的pH（6.6～6.8）最為接近[2]，適合工業(yè)化處理牛乳和乳清。此外，來源于克魯維酵母菌的乳糖酶另一優(yōu)點(diǎn)是在低溫時(shí)仍具有較好活力，可在低溫下分解乳糖，避免乳品加工過程中的腐敗菌污染引起牛奶酸敗變質(zhì)。但是，來源于克魯維酵母的乳糖酶產(chǎn)量并不理想，采用基因工程手段提高乳糖酶表達(dá)量是增加乳糖酶產(chǎn)量的有效方法。

本研究以中性乳糖酶生產(chǎn)菌脆壁克魯維酵母（Kluyveromyces fragilis）為材料，通過構(gòu)建以脆壁克魯維酵母乳糖酶基因上游調(diào)控區(qū)為同源臂的基因置換載體，優(yōu)化脆壁克魯維酵母電擊轉(zhuǎn)化的條件，試圖建立一套有效的脆壁克魯維酵母基因置換技術(shù)，以期為利用精確的基因修飾技術(shù)構(gòu)建高表達(dá)中性乳糖酶生產(chǎn)菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

菌株脆壁克魯維酵母（哈爾濱美華生物技術(shù)有限公司提供），質(zhì)粒pPIC9K（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)雙寶講師惠贈(zèng)），質(zhì)粒pTPlac、pPkan（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)研究室構(gòu)建所得）。

1.1.2 試劑

Pyrobest Taq酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶（購自大連寶生物工程公司）；DNA膠回收試劑盒（購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純（購自大連寶生物工程公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD：用于酵母培養(yǎng)，主要成分有10 g·L-1酵母提取物，20 g·L-1蛋白煉，20 g·L-1葡萄糖。

YPDG：用于轉(zhuǎn)化子篩選，主要成分有10 g·L-1酵母提取物，20 g·L-1蛋白胨，20 g·L-1葡萄糖，200 mg·L-1G418。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒pPkan的構(gòu)建和線性化

采用CTAB法提取脆壁克魯維酵母基因組，以其為模板，利用Plac擴(kuò)增引物（Sence-Plac：5'TC GCCGATTTGTAACACTCCT 3'，Antisence-Plac:5'CTCGTCAATGACCCAGAAGCC 3'，3.2 kb）擴(kuò)增乳糖酶基因調(diào)控區(qū)Plac，將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，酶切正確的陽性轉(zhuǎn)化子送交測序。根據(jù)pPIC9K的序列（Invirtrogen公司）和PLac序列，對(duì)質(zhì)粒pPIC9K和pTPLac進(jìn)行Mfe I和Eco R V雙酶切，電泳回收載體片段和目的片段，加入T4DNA連接酶連接構(gòu)建質(zhì)粒pPkan。電擊轉(zhuǎn)化時(shí)，用Sal I和Eco R I線性化質(zhì)粒pPkan。

1.2.2 脆壁克魯維酵母電擊轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

1.2.2.1 脆壁克魯維酵母的活化培養(yǎng)及感受態(tài)的制備

挑取脆壁克魯維酵母的單菌落接種于10 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r·min-1，振蕩培養(yǎng)過夜。再以1%的接種量轉(zhuǎn)接于100 mL YPD培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至OD600=0.5～1.5，4℃。5 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，用100 mL冰預(yù)冷的無菌水將菌體重懸。4℃，5 000 r·min-1離心10 min，棄去上清，用50 mL冰預(yù)冷的無菌水將菌體重懸。4 ℃，5 000 r·min-1離心10 min，再用20 mL，1 mol·L-1山梨醇洗滌 1次，溶于200 μL 1 mol·L-1冰預(yù)冷的山梨醇中，以備轉(zhuǎn)化(現(xiàn)做現(xiàn)用)。

1.2.2.2 脆壁克魯維酵母生長時(shí)期對(duì)電擊轉(zhuǎn)化率的影響

每隔1 h對(duì)二次活化的脆壁克魯維酵母培養(yǎng)液取樣測OD600值，繪制生長動(dòng)力曲線，并取處于OD600為0.5、0.8、1.0、1.5的脆壁克魯維酵母制備感受態(tài)，以1.0 kV電壓進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，電擊后培養(yǎng)60 min涂板。

1.2.2.3 電壓對(duì)脆壁克魯維酵母電擊轉(zhuǎn)化率的影響

固定電容 C=25 μF，電阻=200 Ω，OD600為0.8，以電壓分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 kV進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，電擊后培養(yǎng)60 min涂板。

1.2.2.4 電擊后涂布前培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

OD600為0.8，電壓1.5 kV，電擊后分別培養(yǎng)0、30、60、90、120 min進(jìn)行涂板。

1.2.3 限制內(nèi)切酶介導(dǎo)法在酵母電擊轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

OD600為0.8，電壓1.5 kV，取200 μL感受態(tài)細(xì)胞加入質(zhì)粒pPkan混合均勻。分別加入0、5、8、10限制性內(nèi)切酶Eco R I和Sau I，冰浴30 min后，以電壓1.5 kV進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)60 min，吸取200 μL涂布。

圖1 重組質(zhì)粒pPKan的構(gòu)建Fig.1 Construction of plasmid pPKan

1.2.3 轉(zhuǎn)化子鑒定

根據(jù)pPIC9K的序列和pTPLac序列分析，應(yīng)用軟件Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物對(duì)Genekan用以檢測kan基因的插入（Genekan-Sense:5'GATGG TCGGAAGAGGC 3'，Genekan-Antisense:5'CCAGT AGTAGGTTGAGGC 3'，600 bp），引物對(duì) Upkan、Downkan分別用以檢測上下游同源臂的同源插入（Upkan-Sense:5'TTTGCCCACCCTCTTG 3'，Upkan-Antisense:5'TTGCCCGCTAATGCTA 3'，1.5 kb;Downkan-Sense:5'CAAGTATGTCTGCCTGTATT 3'，Downkan-Antisense:5'AGCCTCCAAGTTCGTAT 3'，1.0 kb）。

2 結(jié)果與分析

2.1 脆壁克魯維酵母電擊轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.1.1 脆壁克魯維酵母生長時(shí)期對(duì)電擊轉(zhuǎn)化率影響

每隔一小時(shí)對(duì)二次活化的脆壁克魯維酵母培養(yǎng)液取樣測OD600值，得到生長動(dòng)力曲線(見圖2)。

脆壁克魯維酵母的不同生長期對(duì)電擊轉(zhuǎn)化率表現(xiàn)出較大影響，當(dāng)OD600為0.8時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，為1.92×102轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA，繼續(xù)培養(yǎng)反而使轉(zhuǎn)化率下降（見圖3），說明處于對(duì)數(shù)生長期中前期的細(xì)胞可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效果。

圖2 脆壁克魯維酵母生長動(dòng)力曲線Fig.2 Curve of growth of Kluyveromyces fragilis

圖3 OD600 對(duì)脆壁克魯維酵母電擊轉(zhuǎn)化的影響Fig.3 Ecffect of OD600 on electroporation Kluyveromyces fragilis

2.1.2 電壓對(duì)脆壁克魯維酵母電擊轉(zhuǎn)化率的影響

電場強(qiáng)度是電擊轉(zhuǎn)化中最敏感的參數(shù)，直接影響轉(zhuǎn)化率[3]，而電容C=25 μF，電阻=200 Ω比較適合微生物電擊轉(zhuǎn)化[4]，試驗(yàn)中采用0.2 cm的小電擊槽，固定其他參數(shù)，調(diào)節(jié)電壓從0.5～2.5 kV，得到電場強(qiáng)度為2.5～12.5 kV·cm-1。當(dāng)電場強(qiáng)度為7.5 kV·cm-1時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到2.37×102轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA，繼續(xù)增加電壓，轉(zhuǎn)化率反而下降（見圖4）。這種轉(zhuǎn)化頻率隨電壓的變化說明了較低的電壓不足以引起細(xì)胞變化為易于接受外源DNA的生理狀態(tài)，而過高的電壓則會(huì)對(duì)細(xì)胞造成較大的傷害，細(xì)胞膜產(chǎn)生不可逆破裂[3]，使細(xì)胞死亡率過高，有效轉(zhuǎn)化率降低。

圖4 電壓對(duì)脆壁克魯維酵母電擊轉(zhuǎn)化的影響Fig.4 Eeffect of voltage on electroporation of Kluyveromyces fragilis

2.1.3 電擊后涂布前培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

在相同的試驗(yàn)條件下，電擊后加入培養(yǎng)基立即涂布和培養(yǎng)不同時(shí)間后涂布。電擊后培養(yǎng)120 min時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。這種轉(zhuǎn)化頻率隨轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)時(shí)間的變化說明了由于標(biāo)記基因轉(zhuǎn)入后，需要較長時(shí)間表達(dá)其功能。電擊后培養(yǎng)120 min后涂板相較于培養(yǎng)90 min后涂板，轉(zhuǎn)化率并沒有顯著的提高（見圖4），造成這種結(jié)果的原因可能由于培養(yǎng)90 min已經(jīng)足夠時(shí)間使電擊后的脆壁克魯維酵母進(jìn)行恢復(fù)，延長時(shí)間僅促進(jìn)酵母的分裂繁殖，考慮到縮短操作時(shí)間和培養(yǎng)過程中的細(xì)胞分裂不利于轉(zhuǎn)化子篩選等因素[5]，以培養(yǎng)90 min后涂板為宜。

圖5 電擊后涂布前培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響Fig.5 Eeffect of culture time on electroporation of Kluyveromyces fragilis

2.2 限制內(nèi)切酶介導(dǎo)法在酵母電擊轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

限制酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化是在限制酶存在下用線性化質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化真菌，外源基因可以插在基因組的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，從而獲得轉(zhuǎn)化子。REMI被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物病原真菌以及其他真菌的轉(zhuǎn)化中[6-8]，普遍可獲得較高的轉(zhuǎn)化率[9-10]。該方法首先在酵母菌中由Schiestl建立，轉(zhuǎn)化率比直接轉(zhuǎn)化提高了7倍[11]。而在本試驗(yàn)中，加入限制內(nèi)切酶后，與未加入限制內(nèi)切酶的對(duì)照相比轉(zhuǎn)化率僅相差0.2×102轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA，并未顯著提高轉(zhuǎn)化率，可能原因是Schiestl建立的REMI法建立在原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的基礎(chǔ)上，而本試驗(yàn)中采取的電擊轉(zhuǎn)化法已經(jīng)具有較高的轉(zhuǎn)化率，因此REMI法并未對(duì)轉(zhuǎn)化率有顯著的提高。

2.3 轉(zhuǎn)化子鑒定

PCR檢測結(jié)果見圖6～8。

圖6 PCR擴(kuò)增檢測kan基因Fig.6 Detection of kan gene by PCR

圖7 PCR擴(kuò)增檢測上游同源臂的插入優(yōu)點(diǎn)Fig.7 Detection of insertion site of upstream homologous arm by PCR

圖8 PCR擴(kuò)增檢測下游同源臂的正確插入Fig.8 Detection of insertion site of downstream Homologous arm

電擊轉(zhuǎn)化法是目前轉(zhuǎn)化效率最高的轉(zhuǎn)化方法之一，但采用電擊轉(zhuǎn)化法時(shí)，發(fā)生假陽性的頻率也是最高的[12]。因此，僅僅利用抗性或利用營養(yǎng)缺陷型對(duì)重組子進(jìn)行篩選是不夠的，有必要對(duì)重組子進(jìn)行二次篩選，最簡便有效的二次篩選法為PCR法。隨機(jī)選取10個(gè)轉(zhuǎn)化子，用引物對(duì)kan基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，可擴(kuò)增出600 bp條帶的即為陽性轉(zhuǎn)化子，試驗(yàn)結(jié)果證明80%的轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子（見圖6）。用引物對(duì)Upkan、Downkan對(duì)陽性轉(zhuǎn)化子的整合位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，上下游分別可擴(kuò)增出1.5 kb、1.0 kb條帶即為進(jìn)行了同源重組的轉(zhuǎn)化子，試驗(yàn)結(jié)果證明陽性轉(zhuǎn)化子中87.5%進(jìn)行了同源重組（見圖7～8），獲得較高的同源重組率。

3 討論與結(jié)論

基因置換技術(shù)在研究基因功能和實(shí)現(xiàn)基因精確缺失有廣泛應(yīng)用，但成功率低[13]，提高同源重組率和轉(zhuǎn)化率是解決問題關(guān)鍵。同源臂長度對(duì)同源重組率有重要影響，在釀酒酵母系統(tǒng)中，當(dāng)兩端同源臂為30 bp時(shí)，同源重組率可高達(dá)80%[14]。而在非常規(guī)酵母系統(tǒng)中，如多形漢遜酵母，即使兩端同源臂為1 kb時(shí)，同源重組率僅為50%[15]。脆壁克魯維酵母為非常規(guī)酵母，試驗(yàn)選擇1 kb同源區(qū)作為同源臂，以期獲得較高的同源重組率。對(duì)脆壁克魯維酵母的電擊轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化。不同的轉(zhuǎn)化條件對(duì)轉(zhuǎn)化率有較大影響，研究可知，制備感受態(tài)時(shí)脆壁克魯維酵母的生長時(shí)期和電擊轉(zhuǎn)化時(shí)電場強(qiáng)度對(duì)轉(zhuǎn)化率影響較大，合適條件可以提高轉(zhuǎn)化率，以O(shè)D600為0.8的脆壁克魯維酵母為受體、電場強(qiáng)度為7.5 kV·cm-1、電擊后培養(yǎng)時(shí)間為90 min，可獲得較高的轉(zhuǎn)化率，最高轉(zhuǎn)化效率為2.37×102轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA。而采用REMI法，在電擊轉(zhuǎn)化的同時(shí)加入限制性內(nèi)切酶，對(duì)電擊轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化率無顯著影響。

試驗(yàn)的下一步將以乳糖酶基因上游調(diào)控區(qū)缺失的脆壁克魯維酵母為載體，對(duì)其啟動(dòng)子的上游激活序列及信號(hào)肽進(jìn)行基因工程改造。對(duì)其啟動(dòng)子的上游激活序列的改造，在提高乳糖酶的生物活性的基礎(chǔ)上，并未有改變脆壁克魯維酵母乳糖酶本身的基因序列，避免以往表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因時(shí)，分泌表達(dá)的蛋白不能正確折疊和修飾加工等問題引起乳糖酶的活性降低甚至失活；并嘗試已在畢赤酵母中成功表達(dá)了外源蛋白的信號(hào)肽α-Factor信號(hào)肽和菊粉酶基因信號(hào)肽INU，以期獲得高表達(dá)中性乳糖酶的分泌型表達(dá)載體。

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