中醫(yī)藥干預(yù)脊髓損傷后基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

王雨辰,馬 勇

(南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇南京210046)

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是指因直接暴力或間接暴力作用在正常脊柱和脊髓組織,致?lián)p傷平面以下脊髓各項(xiàng)功能,包括運(yùn)動(dòng)、感覺、括約肌和反射功能障礙。脊髓損傷對(duì)個(gè)人及社會(huì)帶來巨大的負(fù)擔(dān),所以研究脊髓損傷的治療具有十分重要的意義。西藥治療主要是皮質(zhì)類固醇、鴉片對(duì)抗劑、利尿劑等。近年來,中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)干預(yù)脊髓損傷是以抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)再生為主要研究方向。文章就近年來中醫(yī)藥在干預(yù)脊髓損傷后基因表達(dá)方面的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究做一概述,為今后的中醫(yī)藥治療脊髓損傷的研究提供參考。

1 SCI模型

SCI模型有挫傷型模型、氣囊壓迫型模型、切割型模型、光化學(xué)誘導(dǎo)型模型、牽拉型模型等,而壓迫型與挫傷型模型可較準(zhǔn)確地模擬臨床SCI病理表現(xiàn),并很好地呈現(xiàn)SCI繼發(fā)性損傷的病理變化[1]。

急性脊髓損傷模型較多采用挫傷型模型,即使用改良的Allen重物打擊法造模,王健等[2]人對(duì)分組后的SD大鼠稱重,以2%戊巴比妥鈉按30 mg/kg麻醉,消毒后以T10棘突為中心取背部后正中縱行切口。將長(zhǎng)10 mm,寬2 mm,厚1 mm的塑料墊片按大鼠脊髓背側(cè)生理曲度屈曲預(yù)彎后,小心放置于T10處脊髓硬脊膜外,將特制的套筒嘴垂直輕放于塑料墊片正中心上,用改良Allen氏打擊裝置,以50 gcf(沖擊量為5 g重物從10 cm高度自由落下)致傷能量強(qiáng)度的重力打擊脊髓,以觀察到鼠尾痙攣性擺動(dòng),雙下肢及軀體回縮撲動(dòng),示建模成功。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常選用SD大鼠、Wistar大鼠,也有少數(shù)實(shí)驗(yàn)使用恒河猴或新西蘭大白兔。給藥方法:中藥提取物多用腹腔注射或靜脈注射,復(fù)方多采用灌喂方式,針灸主要是特定穴位進(jìn)行電刺激。

2 中醫(yī)藥干預(yù)SCI后基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

2.1 B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因-2(B-cell lymphoma/leukemia 2,Bcl-2)基因家族 現(xiàn)代研究[3]表明Bcl-2能夠阻止或減緩多種類型細(xì)胞的凋亡。羅春山等[4]在造模(加速壓迫型Allen's打擊法造模)前后對(duì)SD大鼠靜注漢防己甲素和甲基強(qiáng)的松龍。免疫組化結(jié)果:漢防己甲素和甲基強(qiáng)的松龍可以明顯促進(jìn)脊髓細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)同時(shí)抑制Bax的表達(dá),而兩組間在Bcl-2和Bax表達(dá)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明漢防己甲素在抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡方面與甲基強(qiáng)的松龍作用相似。井曉磊等[5]用女貞子液治療SCI造模大鼠,結(jié)果顯示女貞子液可以明顯增強(qiáng)脊髓Bcl-2表達(dá),減弱Bax表達(dá)。宋永興等[6]用Western blot方法檢測(cè)人參皂苷治療SCI大鼠后bcl-2和bax的表達(dá),結(jié)果示各時(shí)間段大鼠脊髓中Bcl-2蛋白表達(dá)均高于損傷組(P<0.01),bax蛋白均低于損傷組(P<0.05或P<0.01),表明人參皂苷能夠明顯增加脊髓細(xì)胞Bcl-2表達(dá),抑制bax的表達(dá)。杜長(zhǎng)青等[7]使用中藥髓復(fù)康(生黃芪、川芎、赤芍、紅花、葛根和三七等 8味中草藥)灌喂脊髓半橫斷后的恒河猴,結(jié)果表明髓復(fù)康可以明顯促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá),抑制Bax蛋白表達(dá)和脊髓神經(jīng)元凋亡。素問《骨空論》云:“督脈者,貫脊,屬腎”,針刺督脈直達(dá)病所,可以活血祛瘀、溫陽(yáng)通督,從而使經(jīng)氣上下貫通起作用,陽(yáng)氣通達(dá),筋脈得以濡養(yǎng)[8]?，F(xiàn)代研究表明電針可以阻止脊髓繼發(fā)性損傷、促進(jìn)軸突再生、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖[9]。李曉寧等[10]采用夾脊電針治療SCI大鼠,并使用原位雜交法觀察SCI后bcl-2mRNA的表達(dá),結(jié)果顯示隨著電針治療時(shí)間的增加,電針密波組bcl-2mRNA的表達(dá)逐漸優(yōu)于模型組和地塞米松組,14 d時(shí)達(dá)到高峰(P<0.01),夾脊電針通過提高bcl-2mRNA的表達(dá)來抑制脊髓損傷早期細(xì)胞凋亡,對(duì)脊髓功能的恢復(fù)起著重要作用。

2.2 半胱氨酸基天冬氨酸-特異性蛋白酶(caspase,cysteine-aspartic proteases)基因家族 caspase基因家族大部分成員都參與了細(xì)胞凋亡,其作用過程涉及的因素及信號(hào)傳導(dǎo)途徑非常復(fù)雜。其中Caspase-3被認(rèn)為是凋亡過程最重要的蛋白酶[11],Caspase-3介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致脊髓繼發(fā)性損傷[12]。王健等[2]應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)川芎嗪對(duì)大鼠急性脊髓損傷后caspase-3mRNA表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用川芎嗪和甲強(qiáng)龍后各時(shí)間點(diǎn)caspase-3mRNA的表達(dá)量下降,治療后caspase-3mRNA表達(dá)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)同甲強(qiáng)龍組接近。李曉寧等[13]采用電針刺激“心俞、脾俞”等穴位的方法治療大鼠脊髓損傷,免疫組化法檢測(cè)Caspase-9證實(shí)電針可以抑制Caspase-9在大鼠脊髓損傷神經(jīng)元中表達(dá)。

2.3 熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)基因家族HSP基因家族的作用機(jī)制很復(fù)雜,它們中既有促炎癥效應(yīng)的因子,也有具備抗炎癥及細(xì)胞保護(hù)的雙重作用的因子[14]。膠質(zhì)瘢痕是SCI修復(fù)的阻礙因素之一[15],熱休克蛋白47(HSP47)在瘢痕纖維化的形成過程中起重要作用。何玉寶等[16]對(duì)鉗夾型SCI大鼠模型給予腹腔注射苦參素。結(jié)果:GFAP和HSP47表達(dá)降低,說明苦參素通過干預(yù)HSP47的表達(dá)阻止膠質(zhì)瘢痕形成,對(duì)脊髓細(xì)胞起到保護(hù)作用。HSP70可通過抑制caspase-8的激活,減少凋亡,達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用[17]。HSP70可通過抑制JNK3的激活,進(jìn)而阻止Bax進(jìn)入線粒體;亦可直接抑制Bid的活化,阻斷其后的凋亡通路[18]。徐維蓉等[19]采用督脈電針治療大鼠脊髓損傷并使用免疫組化法觀察HSP70的陽(yáng)性表達(dá),結(jié)果示電針治療可以增加脊髓損傷大鼠脊髓損傷部HSP70及其mRNA的表達(dá)。

2.4 白介素家族(IL,interleukin) 最近研究[20]表明SCI后細(xì)胞外谷氨酸鹽的升高能促進(jìn)細(xì)胞的死亡和功能減退,而IL-1β介導(dǎo)了SCI后谷氨酸鹽的損害作用。提示阻斷IL-1β可能減輕脊髓繼發(fā)性損傷。Fan L等[21]采用免疫組化的觀察使用川芎嗪治療缺血性脊髓損傷大鼠IL-10和IL-1β的表達(dá)情況,結(jié)果顯示川芎嗪組較對(duì)照組IL-10明顯上調(diào),IL-1β表達(dá)明顯減少。白細(xì)胞介素1(IL-1)是具有廣泛生物學(xué)活性的多肽,IL-1α主要參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫及調(diào)節(jié)機(jī)體代謝,IL-1α表達(dá)減少提示炎癥反應(yīng)的減弱。張瑩瑩等[22]采用針刺并電刺激“夾脊穴”和“足三里”后觀察IL-1α的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-1α陽(yáng)性表達(dá)在傷后7 d內(nèi)持續(xù)上升,傷后5 d、7 d,電刺激組IL-1α表達(dá)低于損傷組(P<0.05),這表明了針刺及電刺激可以抑制IL-1α的表達(dá),有利于減輕脊髓炎癥反應(yīng)。

2.5 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族(neurotrophin families,NTFs)NTFs包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素3/4/5(NT3/4/5)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)等,它們不僅能促進(jìn)正常神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育,而且對(duì)損傷的神經(jīng)元有預(yù)防退變和促進(jìn)再生的作用。李花等[23]發(fā)現(xiàn)利用三七總皂苷干預(yù)脊髓全橫斷大鼠,觀察腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)較正常組增強(qiáng),這表明三七總皂苷可能改善脊髓再生的微環(huán)境,促進(jìn)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。杜旭等[24]取“大椎、命門”和“夾脊穴”兩組穴位交替電針治療治療SCI大鼠,觀察腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的免疫組化變化,結(jié)果顯示BDNF在電針組和甲強(qiáng)龍組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著強(qiáng)于模型對(duì)照組和空白對(duì)照組。組間沒有顯著性差異(P>0.05),表明電針治療可明顯增強(qiáng)SCI后BDNF的表達(dá),促進(jìn)SCI后神經(jīng)的修復(fù)與再生。陳虹等[25]發(fā)現(xiàn)經(jīng)皮電刺激“夾脊穴”及“足三里”治療脊髓損傷大鼠,能夠促進(jìn)脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的表達(dá)。

3 小結(jié)

綜上所述,中醫(yī)藥是具有千年歷史的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué),博大精深,同西醫(yī)治療相比,中醫(yī)藥治療具有自身優(yōu)勢(shì),通常存在劑型豐富、方法多樣、多系統(tǒng)多靶點(diǎn)的作用。相比復(fù)方制劑而言,單味中藥治療及針灸電針更容易被實(shí)驗(yàn)者采納,其在相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究上取得的成功亦為中醫(yī)藥治療脊髓損傷提供了更廣闊的前景,如川芎(川芎嗪)目前發(fā)現(xiàn)其不但可以有效抑制模型大鼠caspase-3的表達(dá)[2],同時(shí)也可以有效增加IL-10的表達(dá)[21],從而對(duì)損傷脊髓起到保護(hù)作用。但中醫(yī)藥具體的作用機(jī)制尚不明確,相信隨著分子生物學(xué)的深入研究,中醫(yī)藥保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制將進(jìn)一步闡明,將為脊髓損傷的治療提供新的治療思路和方法。

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