寄生蟲耐藥性檢測方法研究進展

徐倩倩, 郭時金, 沈志強

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都安特動物藥業(yè)有限公司，山東 濱州 256600))

寄生蟲耐藥性，一般指寄生蟲與藥物多次接觸后，對藥物的敏感性下降甚至消失，致使藥物對抗藥寄生蟲的療效降低或無效。目前，驅蟲藥主要有苯并咪唑類、咪唑并噻唑類和大環(huán)內酯類三大類，寄生蟲對三類藥物的耐藥現象均已有報道。抗藥性的出現直接影響著寄生蟲病的治療效果，并給寄生蟲病的控制帶來困難，及時發(fā)現和控制寄生蟲耐藥是保證藥物有效性的基礎[1]?，F已建立的體內外寄生蟲耐藥性檢測方法有糞便蟲卵計數、對照試驗、蟲卵孵化分析、幼蟲麻痹、移行和活力測試、幼蟲發(fā)育試驗、靜止期幼蟲形態(tài)分析、幼蟲采食抑制試驗、成蟲發(fā)育試驗、生化試驗和分子技術的應用等，但每種方法在可信性、重復性、敏感性和適用性等方面都存在一些缺陷。本文對每種方法進行了分析，為抗寄生蟲藥物耐藥性的研究和耐藥蟲株的監(jiān)測提供參考。

1 寄生蟲耐藥性體內檢測方法

1.1 糞便蟲卵計數

糞便蟲卵計數(Faecal egg reduction, FECRT)是通過計數用藥前后糞便中蟲卵數來評價耐藥性[2-3]。該方法只能推測雌性成蟲排卵數，不能完全反映蟲體數，所以不能準確反映驅蟲藥的效果。糞便蟲卵計數受寄生蟲類型、寄主類型、耐藥藥物、檢測時間等因素影響較大[4-6]。如該方法對捻轉血矛線蟲檢測較為有效，而在普通奧斯脫他線蟲、蛇形毛圓線蟲和細頸線蟲檢測時，相關性較差；山羊糞便蟲卵數一般較高，但與載蟲數相關性不好；伊維菌素治療普通奧斯脫他線蟲時，給藥后10～14 d排卵才被完全抑制，過早檢測可能會出現假陰性結果[7]，而在左咪唑耐藥評價時，如果給藥后10 d進行檢測，則可能會出現假陽性結果，而應在給藥后7 d檢測。

進行糞便蟲卵計數時，選擇寄生蟲感染陽性動物數不應少于10頭；蟲卵計數時，一般選用算術平均數進行計算；不同實驗室之間數據的轉換可能也不同，這給數據的比較也帶來了困難。

單獨應用FECRT并不能提供準確的結果，可借助幼蟲孵育確定蟲體種類，但不同種屬幼蟲孵育所需條件也有差別，從而導致蟲體種類確定的困難。另外，當耐藥蟲株比例小于25%時，該方法就失去了效用[8]。有學者對該方法進行了改良，可以用于田間檢測[6]。雖然FECRT存在眾多缺點，但一直作為寄生蟲耐藥性檢測的經典方法[9-10]，或者作為新檢測方法的對照使用[11-12]。

1.2 對照試驗

對照試驗是評價耐藥性最有效，也是最費力、使用動物最多、最費時的試驗[13]，目前已極少應用。為了減少花費、縮短試驗周期，多采用動物模型。該方法是用感染性蟲卵攻毒無寄生蟲感染動物，用推薦劑量的0.5、1、2倍驅蟲，如果蟲體平均下降率低于90%，或剖檢動物體內仍有1000條蟲體，則說明耐藥已產生。

2 寄生蟲耐藥性體外檢測方法

2.1 蟲卵孵化分析

蟲卵孵化分析(Egg hatch assays, EHAs)源于苯并咪唑類驅蟲藥抑制蟲卵受精及孵化，可以定性、定量評價藥物對蟲體Ⅰ期或Ⅲ期幼蟲的作用，該方法適用于水溶性較好的驅蟲藥。在不同濃度的驅蟲藥中孵育幼蟲，計算一段時間后每個濃度下蟲卵的孵化率(或死亡率)，不加藥物組進行對照，描繪劑量-效應曲線，對數據進行對數處理后做線性回歸，得出ED50(蟲卵半數死亡的藥物濃度)。Boersema等[2]用該方法評價苯并咪唑對敏感和耐藥線蟲卵受精和發(fā)育的影響，發(fā)現其所需濃度不同，捻轉血矛線蟲敏感和耐藥蟲株的ED50也不同。但也有學者懷疑該方法的準確性，因為該方法受寄生蟲年齡和宿主感染程度影響[14-15]。與FECRT相同，當耐藥蟲株比例小于25%時，EHAs就失去了意義[16]。

EHAs試驗需未發(fā)育蟲卵，限制了其使用范圍，因為采用已發(fā)育的蟲卵可能會導致假陽性結果。因此，檢測苯并咪唑類藥物耐藥時，用飽和糖水法收集蟲卵，用絕緣材料密封保存以防運輸途中蟲卵發(fā)育；或者將新鮮糞便放在4 ℃環(huán)境中，可保存3 d，無氧環(huán)境可保存7 d。該方法成功檢測了細頸線蟲和寄生蟲對左咪唑的耐藥。目前，EHAs被許多反復驗證、優(yōu)化和試驗過程的標準化[17]，用于自然感染線蟲的耐藥性檢測時取得了與實驗室一致的結果[18]。

2.2 幼蟲麻痹、移行和活力測試

幼蟲麻痹試驗主要用來檢測左咪唑和甲噻嘧啶的耐藥性。試驗中，感染性Ⅲ期幼蟲與不同濃度的驅蟲藥作用24 h，計數不同濃度下麻痹幼蟲數目，做劑量-效應曲線，并與已知參考蟲株比較。該方法必須選用合適發(fā)育階段的幼蟲，否則已麻痹的幼蟲存在復蘇的可能，降低方法的重復性[19]。

Sutherlan等[20]在乙酰膽堿酯酶抑制劑毒扁豆堿存在的條件下檢測噻苯咪唑耐藥，結果發(fā)現耐藥幼蟲產生麻痹比相應的敏感蟲株要慢。后來研究者發(fā)明了一種微活力測試器，應用微處理器測量半月板界面的光反射，用來檢測線蟲幼蟲和成蟲與藥物作用后的活力改變[21-22]。溶液中幼蟲的移行改變折射到光電二極管內的角度，通過檢測光線偏移，將信號傳入計算機系統(tǒng)，推算移動指數。用該儀器檢測了捻轉血矛線蟲的體外耐藥性：苯并咪唑耐藥捻轉血矛線蟲對不同驅蟲藥的活力反應，并獲得捻轉血矛線蟲幼蟲在感染不同階段對驅蟲藥的反應。結果發(fā)現苯并咪唑耐藥和敏感蟲株的活力有所不同，但對左咪唑耐藥和敏感蟲株卻未發(fā)現區(qū)別[23]。

Gill等[24]用活力測試檢測捻轉血矛線蟲Ⅲ期幼蟲對伊維菌素的耐藥性。Ⅲ期幼蟲在含有不同濃度伊維菌素的瓊脂內，25 ℃避光孵育，一段時間后，用光刺激使其活動，結果發(fā)現藥物濃度和幼蟲活力之間有相關性，即伊維菌素引起的幼蟲麻痹試驗能夠區(qū)分耐藥和敏感分離株。

也有人用成蟲移行試驗檢測豬齒狀核結節(jié)線蟲對噻嘧啶和苯并咪唑的耐藥性[25]。先將成蟲放入不同濃度的藥液中培養(yǎng)30 min，再轉移到移行裝置，這種裝置該有30～50 μm微孔聚酰胺網，移行30 min，按照不同濃度藥物對移行的抑制做劑量-效應曲線。

2.3 幼蟲發(fā)育試驗

大多數驅蟲藥對寄生蟲的代謝都有一定程度的作用，從而影響寄生蟲的發(fā)育，為耐藥檢測提供了思路。學者將Ⅰ期幼蟲(加熱的冷凍干燥大腸桿菌作為飼料)放入不同濃度的試驗藥物，同時設有不加藥物的對照組。這種方法可以區(qū)分苯并咪唑和左咪唑耐藥和敏感捻轉血矛線蟲，幾乎可以用于檢測所有驅蟲藥的耐藥，被認為是快速、可信、廉價并適于田間應用。同時，這種方法需要Ⅰ期幼蟲，無需未發(fā)育的蟲卵和新鮮糞便樣品，給樣品的采集帶來了方便。后來這種方法被用于伊維菌素耐藥性檢測，用酵母提取物作為幼蟲的飼料[26]。

雖然LDT(Larval development tests,LDT)不能給出劑量-效應關系推導LD50，但可用于UK的驅蟲藥耐藥性調查。據報道，檢測苯并咪唑和左咪唑耐藥可信性較高，但伊維菌素耐藥檢測的效果較差[27]。后來對該方法進行了改進，例如將蟲卵放入含有驅蟲藥的瓊脂層中的微量板法，采用瓊脂可以解決大環(huán)內酯類藥物的溶解性問題，并可以測出伊維菌素的劑量-效應關系及LD50值。

Hubert等[28]采用Earle's平衡鹽、酵母提取物和細菌作為基質，在5 mL導管中進行試驗，測得了三類驅蟲藥的LD50值，這種方法測得的劑量-效應關系的線性良好。因為被測藥物與幼蟲有更大的接觸面積，該方法在檢測苯并咪唑和左咪唑耐藥時效果很好，但檢測阿維菌素類藥物時需要伊維菌素以外的同系物做參照[27]。近年來，采用液體基質LDA檢測牛線蟲的伊維菌素耐藥性取得了較好的結果[29]。伊維菌素敏感和耐藥點狀古柏線蟲比較，耐藥率為5.3[10]。

2.4 靜止期幼蟲形態(tài)分析

根據藥物作用的機理，有的驅蟲藥作用于寄生蟲的神經肌肉系統(tǒng)，因此引起幼蟲形態(tài)的影響，通過幼蟲與藥物作用一段時間后的形態(tài)變化，評估藥物對蟲體的作用[30]。試驗一般采用96孔細胞培養(yǎng)板，設置空白對照組(不加藥物的溶媒對照)和不同濃度的試驗藥物組，每組設多個重復。微孔加入溶媒或不同濃度的藥物后一定量 20 g/L融化的瓊脂，將培養(yǎng)板在室溫放置2 h平衡溫度，然后向瓊脂表面滴加30 μL幼蟲混懸液(每毫升含有7000條幼蟲的水溶液，含10 mL/L青-鏈霉素和100 mL/L兩性霉素B)，每孔大約分布有200條幼蟲。用封口膜封好，25 ℃孵育[31]。250倍顯微觀察不同作用時間三期幼蟲形態(tài)的改變。幼蟲沒有扭結或僅在頭部和尾部有輕微偏移的為“正?！保砬?、扭結者為受藥物影響蟲體為“異常”，計數各組每個時間點的“正?！焙汀爱惓！毕x體數，通過各組間比較評價藥物對蟲體的作用。Kopp等[32]用該方法評價了噻嘧啶對犬鉤蟲耐藥和敏感蟲株的體外作用，發(fā)現耐藥和敏感蟲株的LD50有顯著差異，徐倩倩等[33]用該方法評價了米爾貝肟對犬鉤蟲的體外作用，表明米爾貝肟對犬鉤蟲形態(tài)有極大的影響。

2.5 幼蟲采食抑制試驗

Hawdon等[34]利用幼蟲采食抑制試驗評價犬鉤蟲的體外耐藥情況。在96微孔細胞培養(yǎng)板進行，每孔加入100 μL采食激活液(激活液為含有15%犬血清和100 mM甲基谷胱甘肽的RPMI-C)。犬鉤蟲幼蟲以3 000 rpm 離心10 min后加入到含有1%HCl的PBS中。37 ℃輕搖30 min后，再次離心，然后將幼蟲移入RPMI-C，使幼蟲含量為1 500個/mL。取含有幼蟲的混懸液加入到微孔中，5% CO237 ℃孵育24 h，加入不同濃度的藥物，然后每孔中加入100 μL熒光異硫氰酸酯結合牛血清白蛋白，繼續(xù)孵育3 h。試驗結束，將微孔中的幼蟲轉移到1.5 mL EP管中，用1.5 mL PBS清洗5次，每次3 000 rpm 離心3 min，之后將幼蟲轉移到平底96微孔細胞培養(yǎng)板中進行計數，然后在激發(fā)波長460 nm，光柵565 nm下熒光倒置顯微鏡觀察熒光強度，只有50%的腸道有熒光的幼蟲算入采食，比較藥物處理組采食幼蟲數占對照組采食幼蟲數的比例[35-36]。Kopp等[32]將該方法成功用于犬鉤蟲對噻嘧啶的耐藥研究。

2.6 成蟲發(fā)育試驗

體外培育毛圓線蟲的技術已有報道[37]。如捻轉血矛線蟲已在體外培育到成蟲，但因為成蟲體外培養(yǎng)體系過于復雜，該方面的研究進展很小。

2.7 生化分析試驗

苯并咪唑類藥物耐藥的機制是微管蛋白與驅蟲藥的結合力降低，基于該理論，Lacey等[38]通過氚標記了的苯并咪唑氨基甲酸酯與Ⅲ期幼蟲提取的微管蛋白結合評價耐藥性。這種方法快捷、耐用，重復性好，對寄生蟲耐藥情況的微小變化即有敏感反應，但需要幼蟲數目過大，不適于田間分析。

苯并咪唑耐藥與敏感毛圓線蟲的非特異性酯酶和乙酰膽堿酯酶也用于生化分析，這種方法通過目測或光密度計的比色分析，耐藥蟲株的酯酶或乙酰膽堿酯酶的活性顯著高于敏感株。

2.8 分子技術

從分子遺傳學角度看，耐藥的出現可能有以下幾種原因：分子靶標的改變，藥物不能識別靶標從而失效；代謝的改變，使藥物失活、移除藥物或阻止其活性；藥物在靶組織分布的改變，阻止藥物接觸其作用位點；靶基因擴增超過藥物作用[39]。主要抗寄生蟲藥物耐藥性產生的機制大概如下：

(1)苯并咪唑類 β-微管蛋白同種型Ⅰ突變，其中F200Y，F167Y是最重要的。Roos等[40]在Southern blotting之后用RFLPs研究苯并咪唑耐藥和敏感捻轉血矛線蟲的幼蟲和成蟲DNA多態(tài)性。捻轉血矛線蟲的克隆α-和β-微管蛋白用作探針分析感染性幼蟲和成蟲DNA。在敏感蟲體，采用α-和β-微管蛋白DNA探針時，最多有6個不同組分，但在耐藥株，僅有一種或兩種組分與β-微管蛋白探針相符，說明苯并咪唑耐藥蟲株可能比敏感蟲株多了一個變化了的β-微管蛋白基因，耐藥蟲株β-微管蛋白可能更低表達苯并咪唑敏感株β-微管蛋白同種型，或表達的β-微管蛋白缺乏與藥物的高度結合性。一種等位基因特異性PCR報告可檢測氨基酸取代(Phe取代Tyr)在捻轉血矛線蟲的β-微管蛋白同種型Ⅰ基因200，對于苯并咪唑耐藥十分重要，后來也有等位基因特異性PCR的報道[11]。

(2)大環(huán)內酯類藥物 阿維菌素類和美貝霉素類作用機制可能是藥物與谷氨酸門控氯離子通道的α-亞基結合，打開或者門控通道，導致靶神經肌細胞的超極化，谷氨酸與β-亞基結合門控通道[41]。捻轉血矛線蟲采用單鏈多肽現象分析α-亞基的克隆片段，顯示阿維菌素耐藥可能與這個亞基基因的兩個等位基因的頻率變化有關。對P-gp的研究顯示P-gp具有細胞膜藥物轉運功能，提示可能會參與到大環(huán)內酯類藥物耐藥[42]?？傊蟓h(huán)內酯類藥物耐藥的機制概括為：①β-微管蛋白同種型Ⅱ突變；改變代謝或吸收機制；②谷氨酸和或γ-氨基丁酸-R基因突變；③P-gp的超量表達[43]。

(3)左咪唑 左咪唑的耐藥可能與nAChR的減少或結合位點改變有關。左咪唑耐藥捻轉血矛線蟲的理化特性研究顯示左咪唑受體的配體結合特性在耐藥和敏感蟲株間的變化不明顯[44]。同樣的，雖然捻轉血矛線蟲的序列分析和分離的nAChR基因RFLP顯示氨基酸序列的多態(tài)性，但未檢測到與耐藥的相關性，不同種屬左咪唑耐藥蟲株的耐藥分析過程中均未發(fā)現特異性hcal等位基因的改變。

3 小 結

驅蟲藥耐藥導致藥物效能下降而不能有效控制疾病，集約化養(yǎng)殖模式更趨向于用化療藥物控制寄生蟲，但任何一種驅蟲藥的長期應用都會導致耐藥的產生。世界范圍內寄生蟲對一種或幾種廣譜驅蟲藥的耐藥已引起了相應研究部門的關注，為保證可用的化合物能夠持續(xù)有效地用于養(yǎng)殖業(yè)，藥物的有效性就需要有效監(jiān)控。因此，正確給藥至關重要，即可保證畜牧業(yè)發(fā)展，也可限制耐藥進一步發(fā)生。靈敏、快速的耐藥檢測方法與其應用方式結合起來，為減少或避免耐藥的產生奠定基礎。

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