蜂蜜中細(xì)菌的篩選、鑒定及其抑菌作用

韓惠麗， 蔡宇杰， 管政兵， 孫付保， 廖祥儒

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122）

蜂蜜是工蜂將采集的植物花蜜或分泌物經(jīng)過充分釀造而貯存在蜂巢內(nèi)的甜味物質(zhì)，它是一種粘度高、透明或半透明的液體。蜂蜜不僅具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且還具有多種生物學(xué)活性，如抗氧化、解毒、抗菌、消炎、滋潤(rùn)、防腐、保護(hù)創(chuàng)面、促進(jìn)細(xì)胞再生等[1]。

由于蜂蜜具有滲透勢(shì)低、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)低（17%～22%）、pH 值低（3.2～4.5）、葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化不斷產(chǎn)生過氧化氫、粘度高、含有抗氧化劑和抗菌物質(zhì)等特點(diǎn)[2]，故蜂蜜中所含營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的細(xì)菌極少。微生物大部分以孢子的形式存在，使得蜂蜜能保存很長(zhǎng)時(shí)間。有研究發(fā)現(xiàn)，蜂蜜對(duì)60多種細(xì)菌以及7種真菌有抑菌作用，其中對(duì)炭疽桿菌、短小芽孢桿菌、白喉狀桿菌、大腸桿菌、肺炎桿菌等均有明顯的殺菌作用[3]。

大多數(shù)芽孢桿菌對(duì)蜂蜜的品質(zhì)和人類健康影響較小，但肉毒桿菌危害較大。據(jù)報(bào)道，在蜂蜜中發(fā)現(xiàn)了肉毒梭狀芽孢桿菌的孢子，其能夠引發(fā)嬰兒肉毒桿菌中毒[4]。但也有研究從蜂蜜中篩選得到一些細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)生一些抑菌物質(zhì)進(jìn)而抑制一些病原菌的生長(zhǎng)[5-6]。

作者從4種蜂蜜中篩選得到了8株細(xì)菌，通過生理生化實(shí)驗(yàn)及形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)合16S rRNA基因序列分析對(duì)這些菌種進(jìn)行了鑒定，然后初步研究了8株菌對(duì)大腸桿菌，痢疾桿菌及粘質(zhì)沙雷氏菌的抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原蜜 研究采用的4種蜂蜜為未經(jīng)過加工的蜂蜜，分別為小茴香蜜（產(chǎn)于廣西），桉樹蜜（產(chǎn)于廣西扶緩），五倍子蜜（產(chǎn)于廣西南丹）和棗花蜜（產(chǎn)于河南）。使用前避光室溫放置。

1.1.2 指示菌 大腸桿菌（Escherichia coli），痢疾桿菌 （Shigella dysenteriae S7NaCl），粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens SYBCT02）均保存于作者所在實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 培養(yǎng)基

1）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（組分 g/L）:牛肉膏 5.0，蛋白胨 10.0，NaCl 5.0，瓊脂 20.0；pH 7.2～7.4。

2）驗(yàn)證培養(yǎng)基:含葡萄糖的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，分別含質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、30%、40%、50%的葡萄糖。

3）TSA 培養(yǎng)基（組分 g/L）:胰蛋白胨 17.0，大豆胨 3.0，葡萄糖 2.5，NaCl 5.0，K2HPO4·3H2O 2.5，瓊脂15.0（或 7.5）；pH 7.1～7.5。

數(shù)字出版是數(shù)字內(nèi)容產(chǎn)業(yè)的著力點(diǎn)之一。重慶市積極謀劃數(shù)字出版發(fā)展戰(zhàn)略，未來3年要建成5個(gè)數(shù)字內(nèi)容產(chǎn)業(yè)基地。重慶的數(shù)字出版已突破“技術(shù)+出版”的模式，初步形成了“出版+服務(wù)”和“內(nèi)容+服務(wù)”的商業(yè)模式，拓展了數(shù)字出版業(yè)的內(nèi)涵和外延，形成網(wǎng)絡(luò)出版服務(wù)商業(yè)模式，而服務(wù)又反向作用于出版和內(nèi)容的創(chuàng)新，形成基于市場(chǎng)需求的創(chuàng)新動(dòng)力，與政策的推動(dòng)力，形成推進(jìn)重慶數(shù)字出版業(yè)發(fā)展新動(dòng)能。

4）種子培養(yǎng)基（組分 g/L）:牛肉膏 5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，pH 7.2～7.4。

5）發(fā)酵培養(yǎng)基（組分 g/L）:葡萄糖 20.0，蛋白胨20.0，K2HPO4·3H2O 1.5，MgSO4·7H2O 2.5；pH 7.0。

生理鹽水:NaCl 0.85 g/dL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種篩選 4種蜂蜜用滅過菌的生理鹽水稀釋到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%，分別取200 μL涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，放置在培養(yǎng)箱于30℃培養(yǎng)。每天觀察，每長(zhǎng)出一個(gè)菌落都要轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上，劃線分離純化直到長(zhǎng)出單菌落，轉(zhuǎn)接并保藏菌種。

1.2.2 菌種驗(yàn)證 用含糖培養(yǎng)基驗(yàn)證分離得到的菌，先在含糖20 g/dL的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接篩到的菌落，30℃培養(yǎng)一段時(shí)間觀察菌落是否能夠生長(zhǎng)。把能夠在含20 g/dL的葡萄糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落再轉(zhuǎn)接到含糖30 g/dL的培養(yǎng)基上，觀察是否生長(zhǎng)。依次再轉(zhuǎn)接到含糖40、50 g/dL的培養(yǎng)基上，篩選出耐高糖的菌落，轉(zhuǎn)接保藏菌種。

1.2.3 菌種鑒定

1）菌體形態(tài)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn):把篩到的細(xì)菌轉(zhuǎn)接到倒有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的平板上，30℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征；根據(jù)《伯杰細(xì)菌手冊(cè)》和《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中的方法測(cè)定其生理生化特性。生理生化實(shí)驗(yàn)包括淀粉水解、V-P試驗(yàn)、M-R試驗(yàn)、過氧化氫酶的產(chǎn)生、反硝化、明膠液化試驗(yàn)、檸檬酸鹽的利用、脲酶的測(cè)定以及糖發(fā)酵試驗(yàn)等。

1.2.4 分離菌對(duì)指示菌的抑制作用 用接種針將分離得到的細(xì)菌分別點(diǎn)種到倒有TSA（1.5 g/dL的瓊脂）的平板上，30℃培養(yǎng)48 h，直到有菌落長(zhǎng)出。然后把融化的TSA（0.75 g/dL的瓊脂）培養(yǎng)基冷卻到40℃左右（以不燙手為準(zhǔn)），取2 mL加入200 μL指示菌，混勻，分別涂布在已長(zhǎng)有菌落的平板上，30℃培養(yǎng)24 h，觀察是否有抑菌圈[7]。

1.2.5 分離菌發(fā)酵液的抑菌作用 將篩到細(xì)菌接入種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖12 h。然后將種子液接入裝液量50 mL的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種體積分?jǐn)?shù)為 4%，30℃、200 r/min恒溫培養(yǎng) 72 h，得到發(fā)酵液。發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心15 min，得到上清液。上清液用0.22 μm的過濾器進(jìn)行過濾除菌。分別取3種指示菌200 μL涂平板，并在涂好的平板上打孔（9 mm），取100 μL過濾除菌的上清液加入孔中，30℃培養(yǎng)24 h，觀察是否有抑菌圈。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選及驗(yàn)證

通過篩選及驗(yàn)證最終得到8株細(xì)菌，分別為:X1，X2 來自小茴香蜜；W1，W3 來自五倍子蜜；A1，A3來自桉樹蜜；Zao2，Zao3來自棗花蜜。因?yàn)榉涿壑械奶呛亢芨?，從蜂蜜中篩選的微生物有可能是耐高糖的，所以要用高糖培養(yǎng)基驗(yàn)證以排除其它的雜菌。

8株菌都能在含葡萄糖20 g/dL的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)； 其中 X1，X2，W1，A1，A3 能在含葡萄糖 30 g/dL的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；只有A1能在含葡萄糖40 g/dL的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；8株菌均不能在含葡萄糖50 g/dL的培養(yǎng)基生長(zhǎng)。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌體形態(tài)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn) 在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征:X1白色，邊緣有樹狀分枝；X2淡紅色，菌落邊緣呈絨毛狀，菌落干燥；W1黃色，菌落較規(guī)則；W3淺黃色；A1乳白色，菌落較光滑，邊緣透明，產(chǎn)粘液；A3乳白色，菌落邊緣呈絨毛狀，產(chǎn)粘液；Zao2白色，邊緣有絨毛狀分枝，菌落較小；Zao3白色，邊緣有絨毛狀分枝，菌落較大，與Zao2相比生長(zhǎng)較快。生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics

2.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 通過MEGA 4.0.2軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining method）進(jìn)行聚類分

圖1 MEGA4.0.2軟件構(gòu)建的8株分離菌的16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the 8 isolated strains structure by MEGE4.0.2

經(jīng)測(cè)定菌株X1的16S rRNA基因序列全長(zhǎng)1 424 bp， 與 菌 株 Bacillus subtilis ZWQ-1（FR 729926.1）的同源性水平最高，置信度為92%，相似度為99%，并且菌株X1的菌落形態(tài)特征和生理生化性質(zhì)大部分符合伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)中枯草芽孢桿菌的性質(zhì)，所以初步鑒定X1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；菌株X2的16S rRNA基因序列全 長(zhǎng)1 423 bp， 和 菌 株 Bacillus licheniformis SCA1228（JN998733.1）的置信度為 100%，相似度達(dá)到了100%，菌株X2的菌落形態(tài)特征和生理生化性質(zhì)與伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)中的Bacillus licheniformis相似，則認(rèn)為X2屬于地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；菌株W1的16S rRNA基因序列全長(zhǎng)1 427 bp，與 Bacillus megaterium SVC1（JQ655729.1）的置信度為100%，相似度為99%，結(jié)合菌株W1的菌落形態(tài)特征和生理生化性質(zhì)，可以認(rèn)為W1為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）；菌株 W3的 16S rRNA基因序列全長(zhǎng)1 423 bp，和菌株Bacillus pumilus YPB10-2（JQ308586.1）的置信度為 100%，相似度為100%，菌株W3的菌落形態(tài)特征和生理生化性質(zhì)與伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)中的Bacillus pumilus相符合，則認(rèn)為W3是短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）；經(jīng)測(cè)定菌株 A1的16S rRNA 基因序列全長(zhǎng)1 574 bp，其與Bacillus subtilis SCUT09（FN869038.1）同源性水平最高，置信度為97%，相似度達(dá)到了99%，結(jié)合菌株A1的菌落形態(tài)特征和生理生化性質(zhì)，可以認(rèn)為A1屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；菌株A3的16S rRNA基因序列全長(zhǎng) 1 580 bp， 與 Bacillus aminovorans Mali 57（AY211151.1）同源性水平最高，置信度為100%，相似度僅僅94%，而菌株A3的菌落形態(tài)特征和生理生化性質(zhì)與伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)中枯草芽孢桿菌的性質(zhì)符合，暫且命名A3為Bacillus sp.SYBC-hb6；菌株Zao2的16S rRNA基因序列全長(zhǎng)1 577 bp，與菌株 Bacillus thuringiensis Ss3（JF833089.1）同源性水平最高，置信度為100%，相似度達(dá)到了99%，同時(shí)析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，得到的進(jìn)化樹見圖1。結(jié)合其菌落形態(tài)特征和生理生化性質(zhì)，認(rèn)為Zao2屬于蘇云金芽孢桿菌 （Bacillus thuringiensis）；Zao3的16S rRNA基因序列全長(zhǎng)1 433 bp，與菌株Bacillus cereus PR15（JQ435675.1）的同源性最高，置信度為94%，相似度為99%，并且菌株Zao3的菌落形態(tài)特征和生理生化性質(zhì)符合伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)中蠟樣芽孢桿菌的性質(zhì)，所以認(rèn)為其為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

最終確定X1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），X2 為 地 衣 芽 孢 桿 菌 （Bacillus licheniformis），W1 為 巨 大 芽 孢 桿 菌 （Bacillus megaterium），W3 為 短 小 芽 孢 桿 菌 （Bacillus pumilus），A1 為枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis），Zao2為蘇云金芽孢桿菌 （Bacillus thuringiensis），Zao3為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。分別命名8株菌見表2。

表2 菌種的命名及來源Table 2 Honey isolates species name and species origin

2.3 分離菌對(duì)指示菌的抑制作用

分離菌對(duì)指示菌的抑制作用的實(shí)驗(yàn)中見表3。

表3 分離菌對(duì)3種指示菌的抑制作用Table 3 Antimicrobial activity of the bacterial isolates against three indicator bacteria

菌株X2，W1，W3周圍沒有抑菌圈；而菌株X1，A1，A3，Zao2，Zao3 的周圍有明顯的抑菌圈，見圖 2。說明其對(duì)三種或者其中的一種指示菌有抑制作用，原因有兩種:可能是分離菌和指示菌之間的生長(zhǎng)有競(jìng)爭(zhēng)作用，即生活在一起的兩種微生物，為了生長(zhǎng)爭(zhēng)奪有限的同一營(yíng)養(yǎng)或其他共同需要的生長(zhǎng)條件而相互競(jìng)爭(zhēng)，互相受到不利的影響稱為競(jìng)爭(zhēng)。另一種可能菌株 X1，A1，A3，Zao2，Zao3 適應(yīng)環(huán)境快，生長(zhǎng)的較快，使其在生長(zhǎng)上占優(yōu)勢(shì)，而三種指示菌適應(yīng)環(huán)境慢，生長(zhǎng)的較慢，其在生長(zhǎng)上處于不利的形勢(shì)， 導(dǎo)致菌株 X1，A1，A3，Zao2，Zao3 的周圍形成了抑菌圈；也有可能是它們之間存在著拮抗現(xiàn)象，即兩種微生物生活在一起，其中的一種能產(chǎn)生某些特殊的代謝產(chǎn)物或改變環(huán)境條件，從而抑制或殺死另一種微生物的現(xiàn)象稱為拮抗。X1，A1，A3，Zao2，Zao3這些菌株可能產(chǎn)生某些抑菌物質(zhì)或改變環(huán)境條件，從而抑制或殺死指示菌，也導(dǎo)致菌株X1，A1，A3，Zao2，Zao3的周圍形成了抑菌圈。

2.4 分離菌發(fā)酵液的抑菌作用

加有X2，W1，W3這些菌的發(fā)酵液的周圍沒有抑菌圈，見表4。表明其發(fā)酵液對(duì)3種指示菌沒有抑制作用，可能是X2，W1，W3在代謝過程中沒有產(chǎn)生抑菌物質(zhì)。

圖2 Zao2對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌的抑制作用Fig.2 Antibacterial activity of Zao2 against Serratia marcescens SYBCT02

菌株X1，A1，A3的發(fā)酵液抑菌效果較好，在平板上有明顯的抑菌圈，見圖3、圖4。通過菌種的鑒定得知X1，A1為枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis），而枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）在生長(zhǎng)代謝過程中能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，包括非核糖體合成的脂肽類抗生素（lipopeptide antibiotics）、核糖體合成的羊毛硫抗生素（lantibiotics）和抗菌蛋白[8-9]。這些抗菌物質(zhì)可以抑制細(xì)菌、真菌和酵母，在食品、醫(yī)藥、化工和防治植物病害等方面有重要的應(yīng)用價(jià)值[10]。加入X1，A1的發(fā)酵液后，產(chǎn)生抑菌圈，可能就是因?yàn)樗鼈兊陌l(fā)酵液含有這些抗菌物質(zhì)。菌株A3的性質(zhì)尚待進(jìn)一步研究。

表4 分離菌的發(fā)酵液對(duì)指示菌的抑制作用Table 4 Antimicrobial activity of the bacterial isolates of liquid fermentation against three indicator bacteria

菌株 Zao2，Zao3的周圍在分離菌對(duì)指示菌的抑制作用實(shí)驗(yàn)中有抑菌圈，而在分離菌發(fā)酵液的抑菌作用實(shí)驗(yàn)中沒有，則有可能是分離菌和指示菌之間存在著生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)作用，菌株Zao2，Zao3適應(yīng)環(huán)境快，生長(zhǎng)的速度也快于指示菌，而使其在生長(zhǎng)上占優(yōu)勢(shì)，就在菌株Zao2，Zao3的周圍形成了抑菌圈。

圖3 A3，Zao2，Zao3的發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌的抑制作用Fig.3 Antimicrobial activity of the liquid fermentation of A3，Zao2，Zao3 against Escherichia coli

圖 4 X1，X2，A1，A3，Zao3 的發(fā)酵液對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌的抑制作用Fig.4 Antimicrobial activity of the liquid fermentation of X1，X2，A1，A3，Zao3 against Serratia marcescens SYBCT02

3 結(jié)語

作者從4種蜂蜜中篩選到8株細(xì)菌，均為芽孢桿菌，并通過驗(yàn)證這8株菌能夠在耐高糖的環(huán)境下生長(zhǎng)，這與它們的生存環(huán)境有關(guān):蜂蜜中的含糖量很高（平均超過了85%），包括果糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和其他碳水化合物[11]。

通過對(duì)這些分離菌的抑菌性質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)有些菌株是通過競(jìng)爭(zhēng)作用抑制其他菌落的生長(zhǎng)，還有些菌株是通過其代謝過程產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)來抑制其他菌落的生長(zhǎng)。通過菌種的鑒定得知有兩株菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），枯草芽孢桿菌在生長(zhǎng)代謝過程中能夠產(chǎn)生兩類抗菌物質(zhì)，一類是非核糖體合成的脂肽類抗生素 （lipopeptide antibiotics），例如 surfactin，iturin，plipastatin 等[12]，通常對(duì)植物病原真菌具有顯著的抑菌活性，對(duì)細(xì)菌、病毒和寄生蟲也有一定抑制效果；另一類為核糖體合成的細(xì)菌素（bacteriocin）， 例如 subtilosin，sublancin，subtilint[13]屬于類似于nisin的羊毛硫抗生素（lantibiotics），能夠有效地殺死近緣細(xì)菌。因此研究Bacillus subtilis抗菌物質(zhì)在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和食品上具有廣闊的應(yīng)用前景。

[1]玄紅專，胡福良.過氧化氫與蜂蜜的抗菌活性[J].蜜蜂雜志，2002，9:23-24.XUAN Hong-zhuan，HU Fu-liang.Hydrogen peroxide and antimicrobial activity of honey[J].Journal of Bee，2002，9:23-24.（in Chinese）

[2]張金振，趙靜.蜂蜜中微生物的污染與控制[J].中國(guó)蜂業(yè)，2006，57（9）:30.ZHANG Jin-zhen，XIAO Jing.Microbial contamination and control in honey[J].Apiculture of China，2006，57 （9）:30. （in Chinese）

[3]姚京輝，陳云，姚海春.蜂蜜抗菌作用機(jī)理研究[J].蜜蜂雜志，2009，11:41-42.YAO Jing-hui，CHEN Yun，YAO Hai-chun.Research on antimicrobial function mechanism of honey[J].Journal of Bee，2009，11:41-42.（in Chinese）

[4]Nakano H，Okabe T， Hashimoto H，et al.Incidence of Clostridium botulinum in honey of various origin[J].Japanese Journal of Medical Science and Biology，1989，43:183-195.

[5]Lee H，Churey J J，Worobo R W.Antimicrobial activity of bacterial isolates from different floral sources of honey[J].International Journal of Food Microbiology，2008，126:240-244.

[6]López A C，Alippi A M.Phenotypic and genotypic diversity of Bacillus cereus isolates recovered from honey[J].International Journal of Food Microbiology，2007，117:175-184.

[7]Harding C D，Shaw B G.Antimicrobial activity of Leuconostoc gelidum against closely related species and Listeria monocytogenes[J].Journal of Applied Bacteriology，1990，69:648-654.

[8]Moyne A L，Cleveland T E，Tuzun S.Molecular characterization and analysis of the operon encoding the antifungal lipopeptide bacillomycin D[J].FEMS Microbiology Letters，2004，234:43-49.

[9]孔建，王文夕，趙白鴿，等.枯草芽孢桿菌B-903菌株的研究及影響抗菌物質(zhì)產(chǎn)生和積累的主要因素[J].中國(guó)生物防治，2000，16（2）:65-68.KONG Jian，WANG Wen-xi，ZHAO Bai-ge，et al.Research on Bacillus subtilis strain B-903 and the main factors affected antibacterial substances produced and accumulated[J].Chinese Journal of Biological Control，2000，16 （2）:65-68. （in Chinese）

[10]Yeh M S，Wei Y H，Chang J S.Bioreactor design for enhanced carrier-assisted surfactin production with Bacillus subtilis[J].Process Biochemistry，2006，41:1799-1805.

[11]Nakayma S，Takahashi M.Isolation of new variants of surfactin by a recombinant Bacillus subtilis[J].Applied Microbiol Biotechnol，1997，48:80-82.

[12]Hansen J N.Antibiotics synthesized by post translational modification[J].Annu Rev Microbiol，1993，47:535-564.