穩(wěn)定表達(dá)甜味受體蛋白T1R2/T1R3的HEK293細(xì)胞系的建立

錢玲玲， 秦玉梅， 鄧少平

（浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州310035）

20世紀(jì)初甜味受體的發(fā)現(xiàn)，揭開(kāi)了人類研究甜味感受機(jī)理的新篇章，研究者開(kāi)始從甜味受體的結(jié)合與激活角度分析甜味劑結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系[1]。甜味受體T1R2和T1R3以異二聚體的形式共表達(dá)參與甜味識(shí)別，對(duì)多種天然糖及各種人工甜味劑具有高親和力，是一種廣譜的甜味感受器[2-4]。當(dāng)不同的甜味物質(zhì)與T1R2/T1R3受體作用時(shí)，或通過(guò)激活G蛋白的α亞基，或通過(guò)激活α亞基導(dǎo)致與β、γ亞基的分離，從而引起各下游信號(hào)分子途徑的開(kāi)放，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化和神經(jīng)遞質(zhì)釋放[5-6]，產(chǎn)生甜味感知。

甜味受體的發(fā)現(xiàn)，也使各種新技術(shù)如分子模擬、異源表達(dá)、離子影像及膜片鉗電生理技術(shù)[7-10]等如雨后春筍般地涌現(xiàn)出來(lái)。作者所在實(shí)驗(yàn)室則利用近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的等溫量熱滴定（ITC）技術(shù)手段，對(duì)細(xì)胞水平上甜味感受的熱動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，以期從新的角度詮釋甜味識(shí)別機(jī)理。以味細(xì)胞以及NCIH716作為味細(xì)胞的替代細(xì)胞[11]為對(duì)象，確定了用于細(xì)胞甜味識(shí)別熱力學(xué)研究的等溫量熱滴定各種實(shí)驗(yàn)條件；系統(tǒng)的研究了不同濃度的同種甜味劑、同種濃度不同甜味劑與味蕾細(xì)胞相互作用的熱力學(xué)行為；證明了ITC作為一種新型實(shí)驗(yàn)手段在活細(xì)胞層面上通過(guò)熱力學(xué)參量研究受體與配體分子相互作用的物理化學(xué)機(jī)制的可行性，在甜味識(shí)別的熱動(dòng)力學(xué)機(jī)制方面做了開(kāi)創(chuàng)性工作。但不論是原代味細(xì)胞還是替代細(xì)胞，由于細(xì)胞中蛋白質(zhì)成分的復(fù)雜性及細(xì)胞的不穩(wěn)定性，使得甜味劑與甜味受體相互作用時(shí)信號(hào)較弱，從而影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。

作者利用異源表達(dá)受體蛋白質(zhì)技術(shù)，通過(guò)提取總RNA、擴(kuò)增目的基因和重組表達(dá)載體，將甜味受體蛋白基因?qū)際EK293細(xì)胞，通過(guò)篩選獲得能夠穩(wěn)定、單一地表達(dá)甜味受體蛋白的細(xì)胞系，從而為ITC實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供細(xì)胞來(lái)源，以期實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平上甜味識(shí)別熱動(dòng)力學(xué)規(guī)律研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、質(zhì)粒和細(xì)胞株 6～8周大C57BL/6J小鼠:SPF級(jí)，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心； 大腸桿菌 Stbl3、pEGFP-C1、pDsRed1-N1、pcDNATM6.2/N-YFP-DEST質(zhì)粒:購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；HEK293細(xì)胞系:由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑、PCR試劑盒、Marker、T4連接酶和內(nèi)切酶:均購(gòu)自TaKaRa公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑:購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；高純度質(zhì)粒小提試劑盒:購(gòu)自O(shè)MEGA公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清:購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Gustducin兔多克隆抗體:購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；T1R2/T1R3鼠單克隆抗體:購(gòu)自美國(guó)Abcam生物技術(shù)公司；二抗:購(gòu)自上海艾比馬特公司；預(yù)染蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、PVDF膜:購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠舌組織mRNA的提取 取6～8周大C57BL/6J小鼠置于密閉容器中，通入N2致死，取舌組織，立即投入液氮中，后放入預(yù)冷的研缽，研磨至粉末狀。在液氮基本揮發(fā)完時(shí)，加入Trizol，繼續(xù)研磨至粉末，粉末呈液態(tài)狀后，轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中冰上勻漿。最后根據(jù)mRNA提取操作方法獲取總mRNA。RNA樣品短期內(nèi)于-20℃保存，長(zhǎng)期則-80℃保存。

1.2.2 Gα15、T1R2與 T1R3基因的克隆 參考NCBI上Gα15、T1R2與T1R3的蛋白編碼全序列，再結(jié)合初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物CDS區(qū)序列，使用Prime primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并在正反向引物的5’端分別加入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)所得引物見(jiàn)表1。引物由上海生工生物公司合成。以小鼠總mRNA為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 124 bp的Gα15基因，以及長(zhǎng)度分別為2 531、2 576 bp的T1R2和T1R3基因。反轉(zhuǎn)錄條件為65℃5 min、冰浴 5 min 變性、退火，30 ℃ 10 min；42 ℃ 25 min；95℃5 min終止反應(yīng)。PCR條件為94℃5 min；98℃10 s，68 ℃（Gα15、T1R2、T1R3 退火溫度分別為 68、61、63 ℃）30 s，72 ℃ 1 min/kbp，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳后回收純化PCR產(chǎn)物?；厥债a(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表 1 設(shè)計(jì)所得Gα15、T1R2、T1R3引物Table 1 Primers designed for Gα15，T1R2，T1R3

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建 用EcoRⅠ和XhoⅠ分別雙酶切目的基因 Gα15、T1R2與 T1R3，以及質(zhì)粒pEGFP-C1、pDsRed1-N1 與 pcDNATM6.2/N-YFPDEST，然后T4連接酶16℃反應(yīng)過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化自制Stbl3感受態(tài)。氨芐青霉素及卡那霉素培養(yǎng)板篩選出陽(yáng)性克隆，最后重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、Xho I和EcoR I雙酶切及送上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.4 穩(wěn)定株的構(gòu)建與篩選 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEK293細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，過(guò)夜培養(yǎng)，當(dāng)匯合度達(dá)到40%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將重組表達(dá)質(zhì)粒 Gα15-pEGFP-C1與 lipofectamine混合的轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到已鋪好HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后，移除含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，加入DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后，取部分觀察GFP熒光，按照極限稀釋法篩選出細(xì)胞株后，加入G418至終質(zhì)量濃度為5 μg/mL。同時(shí)將沒(méi)有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對(duì)照，加入含G418質(zhì)量濃度為4 μg/mL的選擇培養(yǎng)基。當(dāng)對(duì)照組細(xì)胞全部死亡后，將實(shí)驗(yàn)組G418質(zhì)量濃度降為2 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)。篩選培養(yǎng)2周，篩選出的抗性單克隆株繼續(xù)篩選5 d，挑取單克隆，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。再以相同的方法將 T1R2和T1R3共轉(zhuǎn)染 Gα15/HEK293 細(xì)胞。 其中 G418 為 5 μg/mL，neomycin 與滅稻瘟素質(zhì)量濃度各4 μg/mL。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)目標(biāo)基因表達(dá)水平 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 Gα15/T1R2/T1R3/HEK 293細(xì)胞，利用RNAiso PLUS試劑提取細(xì)胞總mRNA，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，利用自行設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出目的基因。PCR擴(kuò)增程序設(shè)為:95℃30 s；95 ℃ 5 s，65 ℃（Gα15、T1R2、T1R3 退火溫度分別為 65、59、63 ℃）34 s，72 ℃ 1 min/kbp，40 個(gè)循環(huán)；72℃ 5min。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá) 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Gα15/T1R2/T1R3/HEK293細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，提取細(xì)胞蛋白質(zhì)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印PVDF膜，封閉2 h，然后依次與一抗（1∶1 000比例稀釋）和二抗（1∶5 000比例稀釋）反應(yīng)，最后化學(xué)發(fā)光，凝膠系統(tǒng)拍照獲取結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠舌組織總mRNA提取結(jié)果

實(shí)驗(yàn)提取C57BL/6J小鼠的總mRNA，經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。其中28S的條帶的亮度和寬度大約為18S條帶的兩倍，說(shuō)明該總mRNA樣品完整性好且降解較少。因此本實(shí)驗(yàn)所得到的小鼠總mRNA可以作為RT-PCR模板。

圖1 小鼠舌組織總mRNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total mRNA products

2.2 目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

以小鼠總mRNA為模板，利用自行設(shè)計(jì)的Gα15、T1R2及T1R3引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，預(yù)計(jì)分別獲得長(zhǎng)度為1 124、2 531、2 576 bp的目的片段，經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。發(fā)現(xiàn)經(jīng)PCR擴(kuò)增后，獲得目的基因片段大小與預(yù)計(jì)大小基本一致。

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

pEGFP-C1-Gα15、pDsRed1-N1-T1R2 和pcDNATM6.2/N-YFP-DEST-T1R3重組質(zhì)粒經(jīng)Xho I和 EcoR I雙酶切后，將分別產(chǎn)生長(zhǎng)度為1 124、2 531、2 576 bp 的 Gα15、TIR2、T1R3 目的基因片段及相應(yīng)的載體片段。雙酶切結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。將重組表達(dá)質(zhì)粒送往上海生工生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與源序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，Gα15與TIR2同源性達(dá)到100%，僅T1R3在2 545 bp位點(diǎn)發(fā)生一個(gè)位點(diǎn)突變，經(jīng)密碼子翻譯后，所編碼的氨基酸種類保持不變，屬于同義突變，證明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products

圖3 pEGFP-C1-Gα15重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of double digestion productsofpEGFP-C1-Gα15recombinant plasmid

2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果鑒定

按比例將 PEGFP-Gα15表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中。以成功構(gòu)建的Gα15/HEK293細(xì)胞為基礎(chǔ)，將pDsRed1-N1-T1R2與pcDNATM6.2/NYFP-DEST-T1R3表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至 Gα15/HEK293細(xì)胞中，經(jīng)單克隆篩選后，將細(xì)胞置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察GFP/YFP/RFP熒光，結(jié)果見(jiàn)圖 5。 結(jié)果說(shuō)明，PEGFP-Gα15、pDsRed1-N1-T1R2與pcDNATM6.2/N-YFP-DEST-T1R3三種表達(dá)載體已被成功轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞且轉(zhuǎn)染效率良好。

圖 4 pDsRed1-N1-T1R2、pcDNATM6.2/N-YFP-DESTT1R3重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of double digestion products of pDsRed1-N1-T1R2、pcDNATM6.2/NYFP-DEST-T1R3 recombinant plasmids

圖5 穩(wěn)定表達(dá)Gα15/T1R2/T1R3的HEK293細(xì)胞Fig.5 HEK293 cells express Gα15/T1R2/T1R3.Scale bar represent 30μm in A-D

2.5 RT-PCR 檢測(cè) Gα15、T1R2、T1R3表達(dá)結(jié)果

所得內(nèi)參基因 GAPDH和 Gα15、T1R2、T1R3 PCR產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳后，電泳條帶分別位于 400、1 124、2 531、2 576 bp 左右位置，與實(shí)際長(zhǎng)度基本一致，結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7。

圖6 RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.6 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products

圖7 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.7 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products

2.6 Western blot蛋白質(zhì)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western blot鑒定結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 Western Blot 結(jié)果Fig.8 Western Blot results

與空白對(duì)照組相比，穩(wěn)定細(xì)胞株HEK293可以檢測(cè)到Gα15，T1R2，T1R3。因此表明所篩選出來(lái)的HEK293細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)了 Gα15，T1R2以及 T1R3蛋白。

3 結(jié) 語(yǔ)

甜味劑是一類重要的食品添加劑，它賦予食品以甜味。目前人工合成甜味劑在日常食品中應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，使用量越來(lái)越大，同時(shí)人工合成甜味劑的安全性一直是各國(guó)政府和相關(guān)科研機(jī)構(gòu)所關(guān)注的熱點(diǎn)[12]。大批科學(xué)家正在從各個(gè)方面尋找方法詮釋甜味感受的機(jī)制，不僅用來(lái)指導(dǎo)新型甜味劑的開(kāi)發(fā)，也利于研究甜味劑的安全性。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的等溫滴定微量技術(shù)（ITC），通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)便可提供熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)信息[13-14]。作者所在實(shí)驗(yàn)室即利用ITC，研究了細(xì)胞水平甜味感受的熱動(dòng)力學(xué)機(jī)制，從新的角度進(jìn)一步研究甜味感受機(jī)制。通過(guò)前期研究[15]發(fā)現(xiàn)，要實(shí)現(xiàn)甜味識(shí)別熱力學(xué)機(jī)制的詮釋，穩(wěn)定單一的細(xì)胞來(lái)源是實(shí)驗(yàn)的前提保障。異源表達(dá)技術(shù)在甜味機(jī)理研中究發(fā)揮著重要作用[10]，所以作者所在實(shí)驗(yàn)利用異源表達(dá)技術(shù)以C57BL/6J小鼠舌組織提取的總RNA為模板，擴(kuò)增了甜味受體T1R2和T1R3，以及甜味受體偶聯(lián)的G蛋白α15亞基；選擇 pEGFP-C1、pDsRed1-N1、pcDNATM6.2/N-YFPDEST構(gòu)建表達(dá)，因上述質(zhì)粒表達(dá)特定的熒光蛋白，簡(jiǎn)化了轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選，最后利用PCR與Western Blot技術(shù)證明，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)甜味受體蛋白T1R2/T1R3的Gα15/HEK293細(xì)胞株，從而為研究生物動(dòng)力學(xué)和生物熱力學(xué)提供了穩(wěn)定的細(xì)胞來(lái)源。為甜味機(jī)理研究提供了良好的材料，也為細(xì)胞水平上的其他研究提供方法學(xué)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)晶體的獲得成為了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能特性研究的瓶頸問(wèn)題[16]。甜味研究亦是如此。作者成功構(gòu)建了穩(wěn)定單一表達(dá)甜味受體的細(xì)胞株，同時(shí)也為獲得甜味受體蛋白提供了堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

[1]Vigues S，Dotson C D，Munger S D.The receptor basis of sweet taste in mammals[J].Results Probl Cell Differ，2009，47:187-202.

[2]Nelson G，C A J，Hoon M A，et al.An amino acid taste receptor[J].Nature，2001，416:199-202.

[3]Nelson G，H M A，Chandrashekar J，et al.Mammalian sweet taste receptors[J].Cell，2002，106:381-390.

[4]Assadi-Porter F M，Tonelli M，Maillet E L，et al.Interaction between the human sweet-sensing T1R2-T1R3 receptor and sweeteners detected by saturation transfer difference NMR spectroscopy[J].Biochimica et Biophysica Acta，2010，1798:82-86.

[5]Shin Y K，Martin B，Golden E，et al.Modulation of taste sensitivity by GLP-1 signaling[J].Journal of Neurochemistry，2008，106:455-463.

[6]Chaudhari N，Roper S D.The cell biology of taste[J].Journal of Cell Biology，2010，190（3）:285-296.

[7]Cui M，J P，Maillet E，et al.The heterodimeric sweet taste receptor has multiple potential ligand binding sites[J].Curr Pharm Des，2006，12:4591-4600.

[8]Jiang P，J Q，Liu Z，et al.The cysteine-rich region of T1R3 determines responses to intensely sweet proteins[J].The Journal of Biological Chemistry，2004，279:45068-45075.

[9]Jiang P，C M，Zhao B，et al.Identification of the cyclamate interaction site within the transmembrane domain of the human sweet taste receptor subunit T1R3[J].The Journal of Biological Chemistry，2005，280:34296-34305.

[10]Winnig M，Bufe B，Kratochwil N A，et al.The binding site for neohesperidin dihyrochalcone at the human sweet taste receptor[J].BMC Struct Biol，2007，7:66.

[11]Wang T H，Hui G H，Deng S P.A novel sweet taste cell based sensor[J].Biosensors and Bioelectronics，2010，26（2）:929-934.

[12]吳世嘉，王洪新，陶冠軍.超高壓液相色譜—質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定白酒中6種微量甜味劑的方法研究 [J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，29（5）:670-675.WU Shi-jia，WANG Hong-xin，TAO Guan-jun.Ultra-high pressure liquid chromatography-mass spectrometry method for simutaneous determination of six micro-sweeteners in distilled spirit[J].Jounal of Food Science and Biotechnology，2010，29（5）:670-675.（in Chinese）

[13]Chen Z X，Guo G M，Deng S P.Isothermal titration calorimetry study of the interaction of sweeteners with fullerenols as an artificial sweet taste receptor model[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57:2945-2954.

[14]Weber P C，Salemme F R.Applications of calorimetric methods to drug discovery and the study of protein interactions[J].Current Opinion in Chemical Biology，2003，13:115-121.

[15]秦玉梅，張根華，石錦芹，等.小鼠味蕾細(xì)胞分離及體外培養(yǎng)方法[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2009，31（1）:119-122.QIN Yu-mei，ZHANG Gen-hua，SHI Jin-qin，et al.The isolation and in vitro culture of mouse taste bud cells[J].Journal of Cell Biology，2009，31（1）:119-122.（in Chinese）

[16]耿利強(qiáng)，尹大川，盧慧甍，等.原子力顯微鏡在蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)研究中的應(yīng)用[J].硅酸鹽通報(bào)，2008，27（3）:512-518.DI Li-qiang，YIN Da-chuan，LU Hui-meng，et al.Investigations of protein crystals growth by atomic force microscope[J].J silicate bulletin，2008，27（3）:512-518.（in Chinese）