泡菜中乳桿菌的快速檢出和乳桿菌質(zhì)粒資源的初步調(diào)查

楊四佳， 王 穎， 李宇婷， 李 晨， 張 進(jìn)， 劉 銳， 潘 渠

（1.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610083；2.成都醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610083）

質(zhì)粒是染色體外可自我復(fù)制的遺傳元件，在各類(lèi)生物細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)，對(duì)分子生物學(xué)的發(fā)展和基本生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)一直發(fā)揮著不可替代的作用。乳桿菌的質(zhì)粒不僅決定了乳桿菌的某些性狀，還應(yīng)用于乳桿菌克隆表達(dá)載體的構(gòu)建，是一種珍貴的遺傳信息資源。

自從1976年Chassy首次在乳桿菌中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒以來(lái)，已經(jīng)有數(shù)十個(gè)乳桿菌質(zhì)粒被發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)，傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的乳桿菌質(zhì)粒資源被不斷的發(fā)掘。希臘傳統(tǒng)奶酪Kopanisti中分離到了pLAC1質(zhì)粒和屬于theta復(fù)制pUCL287家族的pREN質(zhì)粒。通過(guò)序列分析，在pREN質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)了新的復(fù)制起始蛋白，并首次分析了pUCL287質(zhì)粒家族復(fù)制起始位點(diǎn)的保守程度[1]。中國(guó)內(nèi)蒙的馬奶酒中分離到了屬于滾環(huán)復(fù)制pMV158家族的pTXW質(zhì)粒。該質(zhì)粒編碼了一個(gè)移動(dòng)蛋白（MOB）家族的釋放酶，并且具有較高的拷貝數(shù)，是構(gòu)建載體的良好材料[2]。

中國(guó)泡菜歷史悠久，源遠(yuǎn)流長(zhǎng)。在四川和重慶，基本上家家戶(hù)戶(hù)都有一個(gè)泡菜壇子。已經(jīng)從中國(guó)泡菜中分離了十幾種乳桿菌[3]。卻很少有人關(guān)注中國(guó)泡菜中的乳桿菌質(zhì)粒。到目前為止，只報(bào)道了兩個(gè)質(zhì)粒。兩個(gè)都是從四川泡菜中分離的植物乳桿菌質(zhì)粒。一個(gè)是質(zhì)粒pLR1，屬于滾環(huán)復(fù)制pC194家族，有36個(gè)拷貝數(shù)[4]；另一個(gè)是我們分離鑒定的質(zhì)粒pLP18，屬于滾環(huán)復(fù)制pMV158家族，每個(gè)菌體有24個(gè)拷貝[5]。

為了探明中國(guó)泡菜中乳桿菌和乳桿菌質(zhì)粒資源，作者開(kāi)發(fā)了快速的乳桿菌檢出方法，并對(duì)52份泡菜樣品進(jìn)行了檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，中國(guó)泡菜中存在豐富的乳桿菌質(zhì)粒資源，值得進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

采集泡菜樣品52份，主要采自四川，有4份樣品分別采自遼寧、青海和山西，見(jiàn)表1。乳桿菌菌株均用 MRS培養(yǎng)基[6]，在 37℃靜置培養(yǎng) 18～48 h，其它菌株使用LB培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)18 h。PCR（Ex Taq）和T載體試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司（TaKaRa），質(zhì)粒提取試劑盒與膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司（Bio-Tek USA）。

表1 泡菜樣品采集地列表Table 1 Places of collection of pickle samples

1.2 革蘭染色初步鑒定

將泡菜樣品在MRS培養(yǎng)基上劃線接種，培養(yǎng)出菌落后挑取菌落繼續(xù)劃線分離2次，分離純化泡菜樣品中的細(xì)菌。MRS培養(yǎng)基是乳桿菌的半選擇培養(yǎng)基，可以富集泡菜樣品中的乳桿菌。挑取MRS培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行革蘭染色并在顯微鏡油鏡下觀察（×1 000）。革蘭染色陽(yáng)性，菌體為桿狀的菌株初步鑒定為乳桿菌。

1.3 PCR 檢出

利用我們?cè)O(shè)計(jì)的乳桿菌PCR快速檢出技術(shù)[7]對(duì)革蘭染色初步鑒定為乳桿菌的菌株進(jìn)一步鑒定。該技術(shù)利用一對(duì)可以特異性擴(kuò)增乳桿菌16S rDNA序列的引物（上游:5′-GTAGCGGTGAAATGCGTAGAT ATATGGAA-3′，下游:5′-GTGAT CCAGCCGCAGG TTCTCC-3′），直接挑取微量菌體為模板，特異性擴(kuò)增長(zhǎng)約850 bp的片段，可以快速鑒定乳桿菌。菌落PCR過(guò)程如下[8]:從菌落上挑取微量菌體，微波爐大火處理3 min后，加入到 PCR體系（25 μL）中進(jìn)行擴(kuò)增。然后取5 μL反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠（0.7 g/dL）電泳，凝膠上出現(xiàn)800 bp條帶者鑒定為乳桿菌。

1.4 測(cè)序鑒定

利用通用引物（上游:5'-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3'；下游:5'-AAGG AGGTGA TCCAG CCGC A-3'），PCR擴(kuò)增細(xì)菌菌株16S rDNA全序列，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1 500 bp。使用膠回收技術(shù)純化擴(kuò)增片段，再用TaKaRa公司的T載體試劑盒，通過(guò)電轉(zhuǎn)化，將目標(biāo)擴(kuò)增片段克隆到大腸桿菌中，然后提取重組質(zhì)粒送大連寶生物公司測(cè)序。利用NCBI網(wǎng)站的BLASTn工具比對(duì)測(cè)序結(jié)果。最后根據(jù)測(cè)序結(jié)果將細(xì)菌菌株鑒定到種。

1.5 質(zhì)粒提取

使用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒提取乳桿菌質(zhì)粒，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，只是在solution I中要加入1%的溶菌酶，同時(shí)增加37℃水浴10 min的處理步驟。用瓊脂糖凝膠電泳檢查提取結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 革蘭染色結(jié)果

通過(guò)在MRS培養(yǎng)基上的劃線分離和革蘭染色鑒定，從52份泡菜樣品得到43株菌株。其中6、8、9、25、38、41、44、45、49 號(hào)等 9 個(gè)樣品未能在 MRS選擇培養(yǎng)基中分離到菌株；其余樣品各分離到3株菌株，各樣品3株菌株的革蘭染色結(jié)果均一致，故只保存3株菌株中的1株，菌株編號(hào)與樣品編號(hào)相同。 其中 1、2、5、14、42號(hào)等共 5株菌株革蘭染色陽(yáng)性，菌體呈大卵圓形，初步鑒定為酵母菌；7、11、26～27、29、31～33、35～37、40、46、48 號(hào)等共 14 株菌株為革蘭陽(yáng)性球菌； 無(wú)革蘭陰性球菌；3、10、12、13、15～24、28、30、34、39、43、47、50～52 號(hào)共 23 株菌株為革蘭陽(yáng)性桿菌；4號(hào)菌株為革蘭陰性桿菌，見(jiàn)表2。

表2 泡菜樣品分離菌株的革蘭染色結(jié)果Table 2 Gram stain results of isolated strain from pickle samples

2.2 菌落PCR結(jié)果

對(duì)表2中列出的23株革蘭陽(yáng)性桿菌用特異性引物行 PCR 擴(kuò)增， 電泳顯示其中 3、10、12、15～24、28、34、39、43、47、52 號(hào)共 19 株菌株在 800 bp 左右出現(xiàn)清晰條帶，其余13、30、50、51號(hào)等4株菌株無(wú)條帶，見(jiàn)圖1。從52個(gè)泡菜樣品中鑒定到19株乳桿菌菌株，各地泡菜樣品的乳桿菌檢出率為36.5%。

圖1 革蘭陽(yáng)性桿菌菌株的PCR鑒定電泳圖（PCR引物為乳桿菌特異性引物）Fig.1 PCR detection of gram-positive Bacillus（using Lactobacillus-specific primer）

2.3 測(cè)序結(jié)果

對(duì)分離的23株革蘭陽(yáng)性桿菌菌株和5株革蘭陽(yáng)性球菌菌株進(jìn)行了16S rDNA測(cè)序。利用NCBI網(wǎng)站的 BLASTn 工具比對(duì)顯示，見(jiàn)表 3。 3、10、12、15～24、28、34、39、43、47、52 號(hào)共 19 株菌株被鑒定為乳桿菌；其它鑒定為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、有害片球菌（Pediococcus damnosus）、赫倫魏斯氏菌（Weissella hellenica）、 蠟 樣 芽 胞 桿 菌 （Bacillus cereus）、 表 皮 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus epidermidis）、 巴 氏 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus pasteuri）等。測(cè)序鑒定結(jié)果和乳桿菌PCR快速檢出結(jié)果吻合。19株乳桿菌分離株中僅鑒定為兩種乳桿菌:清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），其中清酒乳桿菌1株，植物乳桿菌18株。13株植物乳桿菌的16S rDNA序列和植物乳桿菌WCFS1（Lactobacillus plantarum WCFS1）的相似性為100%，只有5株植物乳桿菌的16S rDNA序列和植物乳桿菌WCFS1分別有1、2、6、8個(gè)堿基的差異，相似性分別是99.9%、99.6%和99.5%。15和24號(hào)植物乳桿菌分離株和植物乳桿菌WCFS1的16S rDNA序列相差同一個(gè)堿基，即15和24號(hào)植物乳桿菌兩菌株之間的相似性為100%。

表3 泡菜樣品分離菌株的16s rDNA測(cè)序結(jié)果列表Table 3 16s rDNA sequencing results of isolated strains from pickle samples

圖2 19株乳桿菌分離株的質(zhì)粒提取電泳圖Fig.2 Plasmid extracts electrophoresis of 19 isolated Lactobacillus strains

2.4 質(zhì)粒提取結(jié)果

提取19株乳桿菌分離株的質(zhì)粒，見(jiàn)圖2。清酒乳桿菌沒(méi)有提到質(zhì)粒，18株植物乳桿菌中7株沒(méi)有質(zhì)粒，有質(zhì)粒的植物乳桿菌菌株共11株。從電泳圖來(lái)看有10種質(zhì)粒譜型，見(jiàn)表4。18株植物乳桿菌分離株在質(zhì)粒譜型上表現(xiàn)出了遺傳差異。 提示泡菜中蘊(yùn)藏著豐富的乳桿菌質(zhì)粒資源。有質(zhì)粒的乳桿菌分離株分別來(lái)自成都、綿陽(yáng)、眉山、峨眉山、宜賓、樂(lè)山、雅安、涼山和阿壩共9個(gè)地方，分布地域較廣。從地理分布上看，有些地區(qū)有多種質(zhì)粒譜型，有些地區(qū)的質(zhì)粒譜型和別的地區(qū)一樣，例如:成都有P6和P9兩種質(zhì)粒譜型，眉山有P2和P5兩種質(zhì)粒譜型，峨眉山、宜賓和樂(lè)山的質(zhì)粒譜型都是P8。這提示乳桿菌質(zhì)粒的分布不是平均的，明顯存在地區(qū)差異。

表4 19株乳桿菌分離株的質(zhì)粒譜型列表Table 4 Plasmid profiles of 19 isolated Lactobacillus strains

3 結(jié)語(yǔ)

本研究是對(duì)中國(guó)泡菜中的乳桿菌和乳桿菌質(zhì)粒資源的初步調(diào)查，共分析了52份泡菜樣品。調(diào)查表明，36.5%的泡菜樣品中含有乳桿菌。理論上泡菜是植物制品，在制作中容易攜帶生長(zhǎng)在植物表面的植物乳桿菌，所以從泡菜分離的乳桿菌絕大多數(shù)應(yīng)該是植物乳桿菌。四川地區(qū)的一次對(duì)泡菜中乳桿菌資源的調(diào)查中分離了260余株乳桿菌，其中植物乳桿菌141株，占50%以上[9]，東北的泡菜中也分離到了多株植物乳桿菌[10]。這些研究表明，植物乳桿菌是泡菜中的優(yōu)勢(shì)乳桿菌。我們共分離了19株乳桿菌菌株，其中植物乳桿菌就有18株，這和理論以及之前的研究結(jié)果是相吻合的。江蘇揚(yáng)州地區(qū)調(diào)查了3種泡菜，發(fā)現(xiàn)的卻是嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），沒(méi)有植物乳桿菌[11]，這可能是樣本太少的結(jié)果，也可能是地區(qū)差異所致。從地理分布上看，來(lái)自遼寧以及四川的成都、綿陽(yáng)、松潘、資陽(yáng)、眉山等地的泡菜樣品中皆分離到了乳桿菌。乳桿菌的分布沒(méi)有出現(xiàn)明顯的地域差異。在極為鄰近區(qū)域，有的泡菜樣品中有乳桿菌，有的卻沒(méi)有。例如:采集自成都金牛區(qū)不同地點(diǎn)的 1、15、37、49、38 和 39 號(hào)泡菜樣品只有15和39號(hào)分離到了乳桿菌；采集自成都青白江相鄰3個(gè)鎮(zhèn)的50、51和52號(hào)泡菜樣品只有52號(hào)樣品分離到乳桿菌。這可能是泡菜制作手法不同造成的。

本研究共檢出乳桿菌質(zhì)粒譜型9種（不含無(wú)質(zhì)粒的譜型），檢出含質(zhì)粒乳桿菌11株，乳桿菌質(zhì)粒檢出率為21.2%，乳桿菌質(zhì)粒譜型檢出率為17.3%。52份泡菜樣品中28份采集自四川成都，占樣品總數(shù)的53.8%，從中分離出6株植物乳桿菌，兩種質(zhì)粒譜型 （P6和P9）。成都地區(qū)的乳桿菌檢出率為21.4%，低于此次調(diào)查的乳桿菌總檢出率（36.5%）。成都地區(qū)的乳桿菌質(zhì)粒譜型檢出率為7.1%，遠(yuǎn)低于此次調(diào)查的乳桿菌質(zhì)粒譜型總檢出率 （17.3%），這表明擴(kuò)大樣品采集區(qū)間，而不是在狹小地域密集采樣有利于乳桿菌檢出率以及乳桿菌質(zhì)粒譜型檢出率的升高。如果在廣大的地域采集更多的樣品，一定能檢出更多的乳桿菌質(zhì)粒譜型。我們的初步調(diào)查可以確定的是:中國(guó)泡菜中蘊(yùn)藏豐富的乳桿菌質(zhì)粒資源，值得進(jìn)行更大規(guī)模的調(diào)查和研究。

乳桿菌是公認(rèn)安全的微生物，是目前的研究熱點(diǎn)之一[12]，其質(zhì)粒是研究乳桿菌遺傳和生理的重要材料，也是進(jìn)行基因工程的潛在載體。發(fā)掘中國(guó)泡菜中的乳桿菌質(zhì)粒具有重大的研究和應(yīng)用價(jià)值。

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