蕨菜總蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系的建立

黃勁松， 姜 麗， 石 韻， 宦 晨， 郁志芳*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，江蘇 南京210095；2.池州學院材料與化學工程系，安徽 池州247000）

蛋白質(zhì)是生命體活動的體現(xiàn)者和執(zhí)行者，蛋白質(zhì)組學技術(shù)已成為探索果實蔬菜采后成熟衰老機理的重要手段，已被應(yīng)用于草莓[1]、桃[2-3]、葡萄[4]、番茄[5]、柑橘[6]等果實成熟衰老的研究。目前，蛋白質(zhì)組學在果實成熟衰老研究中的應(yīng)用主要集中4個方面[7]:①成熟過程不同品種、不同成熟度果實的蛋白表達比較；②果實的抗病性研究；③采后處理對果實成熟調(diào)控機理的研究；④果實的冷害機理研究，這些研究結(jié)果為闡述果實成熟衰老過程中各個生理生化過程的分子機理提供了新的思路和理論依據(jù)。由于植物中蛋白質(zhì)含量相對較低，且含有如色素、多糖、酚類物質(zhì)、單寧和有機酸類等大量干擾性物質(zhì)，給植物蛋白質(zhì)組學研究增加了困難。近年來，隨著蛋白質(zhì)提取技術(shù)的改進，雙向電泳技術(shù)已廣泛地應(yīng)用在桃[3]，番茄[5]，草莓[1]等果蔬上，但在蕨菜中的應(yīng)用未見報道。

蕨菜又名蕨苔、龍頭菜、拳頭菜，屬鳳尾蕨科中可食用的多年生草本植物。蕨菜營養(yǎng)豐富、味道鮮美，其營養(yǎng)價值和藥用價值高，蕨菜中不僅含有豐富的膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)等，而且現(xiàn)代醫(yī)學研究認為蕨菜具有提高免疫力、治療心腦血管疾病等藥用保健功能[8]。由于新鮮蕨菜在貯藏及運銷過程易出現(xiàn)營養(yǎng)流失，組織變硬和纖維化、變色、風味下降等品質(zhì)劣變現(xiàn)象，從而縮短了產(chǎn)品的貯藏和貨架壽命，常溫下僅能維持3～5 d。研究蕨菜采后品質(zhì)劣變的蛋白質(zhì)組學，可從蛋白質(zhì)分子水平上揭示蕨菜品質(zhì)劣變機理具有重要意義，為生產(chǎn)實踐中開發(fā)蕨菜的保鮮技術(shù)提供理論指導(dǎo)。

作者以皖南山野蕨菜為研究對象，通過比較不同蛋白質(zhì)提取方法，不同上樣量及不同pH范圍IPG膠條對2-DE圖譜的影響，以期探索出一種適合蕨菜的蛋白質(zhì)組分析的方法，為進一步開展蕨菜差異蛋白質(zhì)組學的研究作鋪墊。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料 實驗用蕨菜為3月下旬可食用的池州三臺山產(chǎn)的蕨菜，選擇新鮮、綠色、葉片未展開、呈拳狀彎曲，無病蟲害、無機械損傷蕨菜，采收后迅速用液氮冷凍，保存于-70℃冰箱備用。

1.1.2 試劑 乙二醇-雙-（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、固化 pH 梯度干膠條 （IPG，）、兩性電解質(zhì) （Bio-Lyte）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘代乙酰胺（IAA）、丙烯酰胺（Arc）、N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、二甲氨基丙磺酸（CHAPS）、低熔點瓊脂糖（LMP）、考馬斯亮藍G-250等:購自美國 Bio-Rad公司；三氯乙酸（TCA）、丙酮、尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、甘氨酸（Glycine）、β-巰基乙醇（β-Me）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、聚乙二醇辛基苯基醚 （Triton X-100）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、 礦物油、 過硫酸銨 （Aps）、 四甲基乙二胺（TEMED）、Tris-平衡酚、牛血清蛋白（BSA）等:均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器 高速冷凍離心機:GL-20G-Ⅱ 上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；微量高速冷凍離心機:FRESCO 17 Thermo電子公司產(chǎn)品；等電聚焦儀:Protean IEF System，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；垂直電泳儀:PROTEAN II XL Cell美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng):Versdoc 3000，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 蛋白質(zhì)提取與質(zhì)量分數(shù)測定

1.2.1 酚抽法 根據(jù)Bianco等[9]的方法并加以改進:稱取5 g蕨菜莖部分，用液氮在研缽中研磨成粉。然后加入20 mL的勻漿緩沖液（勻漿液pH 8.0，其 中 含 有 65 mmol/L Tris，1.05 mol/L sucrose，10 mmol/L EGTA，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT 以及質(zhì)量分數(shù)1%Triton X-100繼續(xù)研磨。勻漿液以10 000 g離心30 min，在上清液中加入3倍體積的pH為7.8的Tris-平衡酚，充分渦旋搖蕩，混勻，10 000 g，4℃下離心30 min，上層為酚相，中間白色物質(zhì)為雜質(zhì)，下層為水相?；厥辗酉啵尤?倍體積預(yù)冷丙酮，充分混勻，-20℃下過夜培養(yǎng)，沉淀蛋白。沉淀分別用預(yù)冷的甲醇和丙酮沖洗2次，4℃下干燥后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 TCA/丙酮結(jié)合酚抽法 根據(jù)Wang等[10]方法并加以改進:稱取5 g蕨菜，用液氮在研缽中研磨成粉。然后分別加入20 mL-20℃預(yù)冷的體積分數(shù)10%TCA/丙酮、0.1 mol/L乙酸銨-甲醇、體積分數(shù)80%丙酮清洗并沉淀，并于10 000 g離心30 min，去掉上清，收集沉淀，最后置于4℃下干燥。向干燥好沉淀中按先后順序加入2倍體積pH為7.8 Tris-平衡酚及 SDS混合液（體積比為1∶1），充分振蕩，混勻，10 000 g，4 ℃下離心 30 min，上層為酚相，中間白色物質(zhì)為雜質(zhì)，下層為水相。回收酚相，加入3倍體積預(yù)冷丙酮，充分混勻，-20℃下過夜培養(yǎng)，沉淀蛋白。沉淀分別用預(yù)冷的甲醇和體積分數(shù)80%丙酮沖洗1次，4℃下干燥后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

蛋白質(zhì)沉淀中加入 500 μL裂解液 （7 mol/L urea，2 mol/L thiourea，4%CHAPS，1%DTT，0.5%IPG buffer），至沉淀完全溶解后，并于 10 000 g，4 ℃下離心30 min，用Bradford方法[11]定量蛋白質(zhì)。

1.3 雙向電泳相關(guān)程序設(shè)定

第一向采用 17 cm pH 4-7、pH 5-8、pH 3-10的bio-rad預(yù)制膠條進行水化上樣（上樣量分別為1 000，1 200，1 400 μg）上樣體積 360 μL，應(yīng)用表 1 所示的程序進行等電聚焦。等電聚焦結(jié)束后將第一向膠條分別置于含質(zhì)量分數(shù)2%DTT和2.5%碘乙酰胺的 平 衡 液 （6 mol/L urea，75 mmol/L Tris-HCl，pH 8.8，體積分數(shù) 20%glycerol，體積分數(shù) 4%SDS）中各平衡15 min，然后再轉(zhuǎn)移第二向垂直電泳。第二向SDS-PAGE膠質(zhì)量濃度為12 g/dL，采用恒功率進行垂直電泳，起始用1W/gel進行1 h后，改為15W/gel直到溴酚藍到達膠底部，停止電泳，取下凝膠。然后將放在固定液 （體積分數(shù)40%甲醇，10%冰醋酸，超純水定容）中固定2h，用考馬斯亮藍染色液（質(zhì)量分數(shù)0.12%考馬斯亮藍G-250，質(zhì)量分數(shù)10%磷酸，質(zhì)量分數(shù)10%硫酸銨，體積分數(shù)20%甲醇，超純水定容）進行染色12 h、再在脫色液（體積分數(shù)10%甲醇，體積分數(shù)10%冰醋酸，超純水定容）中進行脫色直凝膠背景清晰，蛋白質(zhì)點明顯可見為止。脫色后的凝膠用分辨率為300dpi的Versdoc 3000凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，保存為GSC的圖像文件，應(yīng)用PDQuest 8.0.1圖像分析軟件進行。

表1 17 cm膠條的雙向電泳等電聚焦程序Table 1 The isoelectric focusing programme of 2-DE with 17 cm strips

2 結(jié)果與討論

2.1 不同蛋白質(zhì)提取方法對蕨菜總蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響

比較了酚抽法和TCA/丙酮結(jié)合酚抽法兩種蛋白質(zhì)提取方法對2-DE圖譜的影響，圖1表明，在相同條件下，用TCA/丙酮結(jié)合酚抽法得到大約有235個蛋白質(zhì)點，而且橫紋較少，點的分布相對均勻，點比較清晰；而直接的酚抽法得到大約162個蛋白質(zhì)點，明顯少于TCA/丙酮結(jié)合酚抽法，且所得到的圖譜水平橫紋較多。以上結(jié)果表明，TCA/丙酮結(jié)合酚抽法提取的蛋白質(zhì)純度較高，質(zhì)量較好，無背景干擾，因此，后期實驗采用TCA/丙酮結(jié)合酚抽法作為蛋白質(zhì)的提取方法，這與占志勇[12]等提取油桐種仁蛋白質(zhì)所采取的提取方法一致。TCA/丙酮結(jié)合酚抽法適合于抗逆境的植物性材料[10]的蛋白質(zhì)提取上，如應(yīng)用于松樹、竹、檸檬、紅樹、橄欖樹等植物葉片分析上，同時此方法也被應(yīng)用于果肉的研究上，如蘋果、橄欖、桃子[10]。而酚抽法較多應(yīng)用于果肉蛋白方面的研究，如櫻桃、番茄、冬棗等[13]。不同的實驗材料，由于其組成不同，采用的提取方法有很大差異。

圖1 不同蛋白質(zhì)提取方法 （酚抽法及TCA/丙酮結(jié)合酚抽法）對蕨菜總蛋白質(zhì)2-DE的影響Fig.1 Comparison of 2-DE maps of Pteridium aquilinum with different protein extraction methods

2.2 不同pH范圍膠條對蕨菜總蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響

IPG膠條pH范圍對2-DE圖譜有重要影響，寬pH范圍的IPG膠條能初步分析蛋白質(zhì)的分布狀況，但是等電點相近的蛋白質(zhì)難以有效分離，窄pH范圍IPG膠條會丟失其pH值范圍之外的蛋白質(zhì)，但有利于提高蛋白質(zhì)的分辨率[14]。為探索蕨菜總蛋白2-DE適宜的pH范圍，分別采用pH 3～10、pH 4～7和pH 5～8 17 cm的IPG膠條進行雙向電泳，結(jié)果表明:在相同條件下，pH 4-7和pH 5-8圖譜蛋白質(zhì)點數(shù)目分別為442和710，而pH 3-10圖譜的蛋白質(zhì)點數(shù)目為235，蛋白點集中在膠條的中間部分，使得等電點相近的蛋白質(zhì)無法得到很好的分離，蛋白質(zhì)會出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，其數(shù)量明顯低于pH 4～7 和 pH 5～8 的圖譜（圖 2），這與王紹美等[15]研究煙草葉片蛋白質(zhì)組選用pH 3～10所得現(xiàn)象一致。pH 4～7膠條的圖譜點在大約pH 4～5之間未見有蛋白點，膠條沒有得到充分利用，而使用膠條pH 5～8圖譜點分散比較開，分布比較均勻，從蛋白質(zhì)點的數(shù)量上看明顯多于膠條pH 3～10、pH 4～7，但在pH 8端出現(xiàn)了一條垂直條紋，這個垂直條紋包括了所有等電點大于8的蛋白質(zhì)，這是膠條pH范圍的限制，使得pH＞8的蛋白被壓縮，盡管采用這種膠條會丟失pH范圍之外的蛋白，但靈敏度和分辨率大大提高，為后續(xù)的分析鑒定奠定良好的基礎(chǔ)。由于選用的試驗材料蛋白質(zhì)本身性質(zhì)不同，分析所使用的IPG膠條的pH范圍也不盡相同，王一鳴[16]分析桃果實硬核期的蛋白質(zhì)選用了pH 5～8的膠條，Bianco等[9]在草莓成熟過中的差異蛋白質(zhì)選用pH 4～7的膠條，而喬建軍等[17]過氧化氫作用下東北紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞中蛋白質(zhì)表達差異研究選用IPG膠條pH 3～10。作者確定分析蕨菜中蛋白質(zhì)的IPG膠條pH 5～8。

圖2 不同pH值范圍的IPG膠條對蕨菜全蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響Fig.2 Comparison of 2-DE maps of Pteridium aquilinum with three IPG strips with different gradients

2.3 不同上樣量對蕨菜總蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響

蛋白質(zhì)的上樣量同樣影響2-DE圖譜的好壞，適宜的蛋白質(zhì)上樣量才能跑出清晰蛋白質(zhì)點且蛋白質(zhì)數(shù)量多的點，故確定蛋白質(zhì)上樣量也是雙向電泳的一個關(guān)鍵步驟[18]。如圖3所示，當?shù)鞍踪|(zhì)上樣量達到1 400 μg時，由于蛋白質(zhì)濃度過高，影響了蛋白質(zhì)的聚焦，一些大相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)堆積在一起，分離效果不好，出現(xiàn)較多水平條紋，這可能蛋白質(zhì)上樣量過高、高豐度蛋白質(zhì)存在、聚焦不足或過度等有關(guān)。而蛋白質(zhì)上樣量為1 000 μg時，由于蛋白質(zhì)濃度較低，盡管膠上的蛋白質(zhì)點分布均勻，低相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)也部分呈現(xiàn)出來，但圖譜的點清晰度沒有上樣量1 200 μg明顯，而上樣量1 200 μg圖譜蛋白質(zhì)點高達719個，且蛋白質(zhì)點邊界清晰，無拖尾現(xiàn)象。而1 000、1 400 μg圖譜分別是592個和608個，蛋白質(zhì)點數(shù)量較少且圖譜質(zhì)量不及上樣量1 200 μg的清晰。有人認為上樣量的多少與蛋白質(zhì)聚焦伏小時數(shù)有一定的關(guān)系，當上樣量低時，低豐度蛋白質(zhì)點不清晰，可以通過提高上樣量來提高蛋白質(zhì)點清晰度，但上樣量過大時，高豐度的蛋白易發(fā)生重疊，2-DE圖譜可能會出現(xiàn)大量的條紋，可以通過延長聚焦程度來解決[13]。對于一定的上樣量，在聚焦時需有一適宜的聚焦伏小時數(shù)，延長或縮短此數(shù)值都有可能影響蛋白質(zhì)的聚焦，從而影響圖譜的質(zhì)量，影響下一步分析。作者比較了不同上樣量2-DE圖譜，發(fā)現(xiàn)蕨菜總蛋白質(zhì)上樣量1 200 μg時，等電聚焦60 000 Vh，得到電泳圖譜中蛋白質(zhì)點數(shù)量明顯高于其他2種上樣量，且背景清晰，適合下一步分析。

圖3 不同上樣量（1 000，1 200，1 400 μg）對蕨菜中總蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響Fig.3 Comparison of 2-DE maps of Pteridium aquilinum with different loading amount

3 結(jié)語

采用TCA-丙酮結(jié)合酚抽法提取蕨菜中的蛋白質(zhì)，所得到的蛋白質(zhì)純度較高。采用17 cm pH 5～8膠條，蛋白質(zhì)的上樣量為1 200 μg，凝膠質(zhì)量濃度為12 g/dL，經(jīng)考馬斯亮藍G250膠體染色后所得到的圖譜蛋白質(zhì)點多達719個，點分布均勻，蛋白質(zhì)點間邊界清晰，無明顯的拖尾現(xiàn)象，重復(fù)性好的蛋白質(zhì)2-DE圖譜。

[1]Bianco L，Lopez L，Scalone A G，et al.Strawberry proteome characterization and its regulation during fruit ripening and in different genotypes[J].Journal of Proteomics，2009，72:586-607.

[2]Zhang L，Yu Z，Jiang L，et al.Effect of post-harvest heat treatment on proteome change of peach fruit during ripening[J].Journal of Proteomics，2011，74:1135-1149.

[3]Obenland D M，Vensel W H.Alterations in protein expression associated with the development of mealiness in peaches[J].Journal of Horticultural Science and Biotechnology，2008，83（1）:85-93.

[4]Vincent D.Optimization of protein extraction of mature grape berry clusters[J].Electrophoresis，2006，27:1853-1865.

[5]Amber A，Muhammad R K，Nagib A，et al.Comparative proteomic analysis of bacterial wilt susceptible and resistant tomato cultivars[J].Peptides，2009，（30）:1600-1607.

[6]Yun Ze，Li Wenyun，Pan Zhiyong，et al.Comparative proteomics analysis of differentially accumulated proteins in juice sacs of ponkan（Citrus reticulata） fruit during postharvest cold storage[J].Postharvest Biology and Technology，2010，56:189-201.

[7]張麗，羅海波，姜麗，等.果實成熟衰老過程中蛋白質(zhì)組學研究進展[J].植物生理學報，2011，47（9）:861-871.ZHANG Li，LUO Hai-bo，Jiang Li，et al.Advances in proteomics related to fruit ripening and senescence[J].Plant Physiology Journal，2011，47（9）:861-871.（in Chinese）

[8]左瑞華，王莉.蕨菜黃酮飼喂肉雞的試驗研究[J].皖西學院學報，2012，28（2）:10-12.ZUO Rui-hua，WANG Li.Experimental study on the effect of flavonoids extracted from pteridium aquilinum var.Latiusculum on chickens[J].Journal of west Anhui University，2012，28（2）:10-12.（in Chinese）

[9]Bianco L，Lopez L，Scalone AG，et al.Strawberry proteome characterization and its regulation during fruit ripening and in different genotypes[J].Journal of Proteomics，2009，72（4）:586-607.

[10]Wang Wei，Rita V，Monica S，et al.A universal and rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant tissues for proteomic analysis[J].Electrophoresis，2006，27:2782-2786.

[11]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72:248-254.

[12]占志勇，陳益存，韓小嬌，等.一種適合油桐種仁蛋白質(zhì)分離的雙向電泳技術(shù)體系[J].林業(yè)科學研究，2012，25（6）:745-750.ZHAN Zhi-yong，CHEN Yi-cun，HAN Xiao-jiao，et al.An improved system of two-dimensional electrophoresis for the tung tree seed protein separation[J].Forest Research，2012，25（6）:745-750.（in Chinese）

[13]張麗.1-MCP和熱處理調(diào)控采后桃果實蛋白表達的研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學，2012.ZHANG Li.Proteomic study on the effect of heat and 1-MCP treatments on post-harvest peach fruit[D].Nanjing:Nanjing Agricultural university，2012.（in Chinese）

[14]陳偉，黃榕輝，林小敏，等.秋茄根系蛋白質(zhì)組的雙向電泳技術(shù)優(yōu)化[J].福建農(nóng)業(yè)學報，2012，27（8）:863-868.CHEN Wei，HUANG Rong-hui，LIN Xiao-min，et al.Optimization of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis for proteome of Kandelia candel Roots[J].Fujian Journal of Agricultural Sciences，2012，25（6）:745-750.（in Chinese）

[15]王紹美，羅成剛，劉貫山，等.煙草葉片蛋白質(zhì)組雙向電泳實驗體系的建立[J].中國煙草科學，2012，33（6）:54-60.WANG Shao-mei，LUO Chenggang，LIU Guanshan，et al.Establishment of two-dimensional electrophoresis protocol for tobacco leaf proteome[J].Chinese Tobacco Science，2012，33（6）:54-60.（in Chinese）

[16]王一鳴，花寶光，王有年，等.桃果實蛋白質(zhì)雙向電泳影響因素的研究[J].園藝學報，2007，（6）:244-249.WANG Yi-ming，HUA Bao-guang，WANG You-nian，et al.Studies on influence factors of protein two-dimensional electrophoresis in prunus persica fruit[J].Acta Horticulturae Sinica，2007（6）:244-249.（in Chinese）

[17]喬建軍，趙紅，牛晉陽，等.過氧化氫作用下東北紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞中蛋白表達差異的研究[J].植物病理學報，2003，33（5）:429-433.QIAO Jian-jun，ZHAO Hong，NIU Jin-yang，et al.Two-dimensional gel electrophoresis on patterns of proteins from suspension cultured cells of Taxus cuspidata following treatment with H2O2[J].ACTA Phytopathologica Sinica，2003，33（5）:429-433.（in Chinese）

[18]黃榕輝，陳品品，王曉艷，等.荔枝花蕊蛋白雙向電泳體系的建立與優(yōu)化[J].熱帶作物學報，2012，33（10）:1812-1818.HUANG Rong-hui，CHEN Pin-pin，WANG Xiaoyan，et al.Establishment and optimization of two-dimensional electrophoresis system for proteins of Litchi Flower buds[J].Chinese Journal of Tropical Crops，2012，33（10）:1812-1818.（in Chinese）