鹿花盤營養(yǎng)成分及蛋白多肽提取工藝的研究進(jìn)展

黃彬彬，趙 越，徐 峰，楊 柳，劉 磊，南璐璐，陳思瑤綜述，葛紅娟審校

(吉林醫(yī)藥學(xué)院：1.護(hù)理學(xué)院，2.臨床醫(yī)學(xué)院，3.營養(yǎng)教研室，吉林 吉林 132013)

·綜 述·

鹿花盤營養(yǎng)成分及蛋白多肽提取工藝的研究進(jìn)展

Researchprogressonapproximatecompositionsandextractionofpolypeptideofdeercoronet

黃彬彬1，趙 越1，徐 峰1，楊 柳1，劉 磊2，南璐璐1，陳思瑤2綜述，葛紅娟3*審校

(吉林醫(yī)藥學(xué)院：1.護(hù)理學(xué)院，2.臨床醫(yī)學(xué)院，3.營養(yǎng)教研室，吉林 吉林 132013)

鹿花盤是一種成分豐富的具有較高藥用價值的動物性中藥材，其中含有蛋白質(zhì)多肽、氨基酸、膽固醇、多糖、脂類和無機(jī)物與礦物質(zhì)等，其中豐富的蛋白質(zhì)和多肽是鹿花盤主要的藥效成分。本文對其營養(yǎng)成分和近年來鹿花盤蛋白質(zhì)多肽的提取工藝進(jìn)行了綜述。

鹿花盤；營養(yǎng)成分；蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸；提取工藝

鹿花盤別名“花盤”、“角盤”、“珍珠盤”、“鹿角盤”[1]，是鹿科動物的角冠和殘留的角根于翌年新茸萌發(fā)時自然脫落的部分。鹿花盤中含有蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、膽固醇和磷脂酰膽堿等，并含大量的鈣、磷及鋅、鐵、錳、銅等微量元素，其中豐富的蛋白質(zhì)是鹿角盤主要的藥效成分[2]。近年來關(guān)于鹿花盤的研究多集中在鹿花盤蛋白多肽的活性成分分析以及藥理作用的研究。在研究過程中有關(guān)鹿花盤蛋白的提取方法主要有分子篩層析、酶解法、鹽提法。鹿花盤多肽的提取方法有鹽析、高壓輔助提取、熱回流浸提法、分子篩層析。本文對其化學(xué)成分和近年來鹿花盤蛋白質(zhì)多肽的提取工藝進(jìn)行了綜述。

1 營養(yǎng)成分

1.1蛋白質(zhì)和多肽

蛋白質(zhì)和多肽是鹿花盤主要的活性成分，人們對其研究報道比較多。王志兵等[3]采用酶水解提取，并通過Folin酚法和水合茚三酮法鑒定，得到分子質(zhì)量在8 000～15 000之間的鹿花盤蛋白多肽。王艷梅等[4]采用80%甲醇提取并配合柱層析分離,得到2種相對分子質(zhì)量為395.1和691.1的鹿花盤小分子肽，且后者是主要成分；同時，對鹿茸和鹿花盤多肽進(jìn)行電泳比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹿茸中有2條多肽帶，而鹿花盤中只有1條。唐任能等[5]通過電泳法比較了鹿茸、鹿花盤和鹿骨中水溶性總蛋白。結(jié)果表明，鹿花盤有11條帶，鹿茸8條帶，而鹿骨幾乎無明顯可見的條帶。這個結(jié)果說明，鹿茸、鹿花盤和鹿骨中總蛋白組成及含量有明顯差異。田玉華等[6]采用凱氏定氮法測定鹿花盤中粗蛋白，采用二唆琳甲酸(BCA)法測定水溶性蛋白質(zhì)。結(jié)果表明，粗蛋白含量為32.8%，水溶性蛋白質(zhì)含量為8.29%。幺寶金等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鹿花盤蛋白質(zhì)多為酸性蛋白質(zhì)。蘇鳳艷等[8]采用鹽提、熱處理及凝膠過濾分離梅花鹿花盤蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)初步證實鹿花盤是由5種分子質(zhì)量在10 000～70 000的蛋白質(zhì)組成的混合物。邱芳萍等[9]通過分子篩層析、酶解等技術(shù)分離純化得到1種分子質(zhì)量在20 100～31 000之間的鹿花盤蛋白。

1.2氨基酸

鹿花盤中氨基酸含量高且種類十分豐富。李澤鴻等[10]通過比較梅花鹿不同產(chǎn)品中的氨基酸含量，發(fā)現(xiàn)鹿花盤中各種氨基酸的總量為33.5%，必需氨基酸含量為10.6%，低于鹿茸但高于鹿角。王麗虹等利用KJA-5型氨基酸自動分析儀對采用分子篩方法制備的鹿花盤水溶性成分進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，其中含有15種氨基酸。張寶香等[11]采用KJA-5型氨基酸自動分析儀對鹿花盤的測定。結(jié)果表明，鹿花盤中含有16種氨基酸，與王麗虹等人的測定結(jié)果相比多了色氨酸。蘇鳳艷等[8]采用鹽提、熱處理及凝膠過濾法提取鹿花盤總蛋白，并通過835-50型氨基酸自動分析儀對其進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，其中含有17種氨基酸，比吉村壽等人報道的鹿花盤水溶性成分中氨基酸種類多了半胱氨酸和纈氨酸。以上測定結(jié)果中氨基酸種類的不同，可能是因為采用的提取方法不能提取出所有種類的鹿花盤蛋白，因而造成了氨基酸組成的差異。

1.3膽固醇

王芳等[12]采用高效液相色譜法檢測了鹿脫盤中膽固醇的含量，并建立了鹿脫盤品質(zhì)的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)和方法，可為鹿脫盤資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1.4多 糖

天然多糖是一類無毒、無害、具有生理活性的高分子化合物，尤其作為免疫治療藥物越來越受到重視，已成為新藥開發(fā)和保健品的研究熱點。田玉華等[6]采用3，5-二硝基水楊酸法測定鹿花盤中還原糖、總糖含量，采用苯酚硫酸法測定可溶性糖含量。結(jié)果表明，鹿花盤中總糖含量為1.68%，還原糖含量為0.58%，可溶性糖含量為1.14%。

1.5脂 類

人們對鹿花盤中脂類的研究較少，尤其對具有較強(qiáng)生物活性的不飽和脂肪酸種類的研究更加缺乏。田玉華等[6]利用索氏提取法對鹿花盤中粗脂肪含量進(jìn)行了測定，采用氫氧化鈉滴定法、分光光度法分別對游離脂肪酸和磷脂含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，粗脂肪含量為1.91%，游離脂肪酸含量0.067%，磷脂含量0.30%。王芳等[12]通過高效液相色譜分析鹿花盤膽固醇含量。結(jié)果表明，含量很低，約為0.224 μg/g。

1.6無機(jī)物與礦物質(zhì)

元素的含量及存在的狀態(tài)與中藥藥理作用密切相關(guān)。鹿花盤中的無機(jī)元素種類多且含量隨鹿齡的改變而變化。田玉華等[6]采用灰化法測定鹿花盤中無機(jī)物含量為58.14%，利用AA-6300型原子吸收分光光度計測定了鈣、磷、鈉、鎂、鐵、鋅、錳7種礦物元素。結(jié)果表明，鈣、磷含量分別達(dá)10.7%和11.23%。姚玉霞等[13]測定結(jié)果表明，鹿花盤中鈣、磷含量分別達(dá)7.71%和7.47%。由此可見，鹿花盤中鈣、磷含量非常高，這與其骨化特征相一致。張寶香等采用原子吸收分光光度法測定了鹿花盤中的鈣、磷、鎂、鈉、鉀、鐵、錳、鋅、鋁、鍶、鋇11種元素,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鈣、磷、鉀、鋅及鋁的含量隨鹿齡的增長而增加，鐵含量不受年齡影響。劉佳佳等[14]采用火焰原子吸收光譜法測定了不同鹿齡梅花鹿花盤礦質(zhì)元素鋅、銅、錳和鐵4種元素的含量。結(jié)果表明，所測樣品中4種元素含量都很豐富，且各元素含量的變化與鹿齡有關(guān)，其中鋅含量隨著鹿齡的增加而減少，銅和鐵含量隨著鹿齡的增加而增加，3歲鹿花盤中錳含量最高，其他年齡鹿花盤中錳含量差異不明顯(P>0.05)。此結(jié)論與張寶香等人的測定結(jié)果相悖，說明鹿花盤中無機(jī)元素含量隨鹿齡的變化規(guī)律還需進(jìn)一步研究。

2 鹿花盤的蛋白質(zhì)提取工藝

2.1分子篩層析

邱芳萍等[9]通過超微粉碎技術(shù)使堅硬的鹿花盤粉碎,再運(yùn)用生物化學(xué)技術(shù)，經(jīng)過浸提、鹽析、透析、分子篩層析等生物技術(shù)，分離純化出一種鹿花盤蛋白APPB，然后通過動物實驗考察其活性作用。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，檢測其分子質(zhì)量在20 100～31 000之間。蘇鳳艷等[8]將鹿花盤粉末先用1% NaCl和0.05 mol/L HCl溶液浸泡1 h，過濾，流水透析24 h。然后75 ℃熱變性3 min，4 000 r/min離心20 min，棄去沉淀取上清液進(jìn)行濃縮，用Sephdex G-50柱層析后用0.6% NaCl溶液洗脫，收集雙縮脲反應(yīng)陽性部分，濃縮后即得到鹿花盤蛋白。馬廣麗等[15]同樣采用鹽提、熱變性處理及凝膠過濾法從鹿茸、鹿花盤粉中提取蛋白質(zhì)。該方法提取分離的鹿花盤蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-PAGE法初步證實鹿花盤蛋白質(zhì)是由5種分子量在10 000～70 000的蛋白質(zhì)組成的混合物；氨基酸分析表明,鹿花盤蛋白質(zhì)含有17種氨基酸,比先前相關(guān)文獻(xiàn)[16]報道的鹿花盤水溶性成分氨基酸的種類多1種，因此該方法為鹿花盤蛋白質(zhì)的提取和氨基酸種類的鑒定提供新的依據(jù)。

2.2酶解法

張鶴[17]在研究鹿花盤膠原蛋白質(zhì)制備及治療骨質(zhì)疏松癥作用研究的過程中，提取鹿角脫盤膠原蛋白，并研究料液比(鹿角脫盤∶水)、水煮時間、提取次數(shù)、胰蛋白酶與底物比、酶解時間對鹿角脫盤明膠提取的影響，確定了提取膠原蛋白的方法為：稱取10 g鹿角脫盤粉3份，按料液比1∶5，每次水煮5 h，提取4次，離心，合并上清液。按酶與底物比為1∶10 000酶解1.5 h，加熱使酶失活，濃縮樣品，置于-20 ℃預(yù)凍，凍干得到鹿角脫盤膠原蛋白。采用熱水浸提與酶解法相結(jié)合，在料液比1∶5，水煮5 h，提取4次，胰蛋白酶與底物比1∶10 000酶解1.5 h，得到鹿角脫盤膠原蛋白的收率為22.31%，平均蛋白含量為66.32%。具體流程為：鹿花盤粉末按料液比1∶5加蒸餾水，提取4次，每次5 h，水提液4 000 r/min離心30 min,合并上清液，加胰蛋白酶，37 ℃酶解1.5 h，酶解液4 000 r/min離心30 min,0.45 μm濾膜過濾，濾液-20 ℃預(yù)凍,凍干得到鹿花盤膠原蛋白。采用胰蛋白酶制備鹿骨膠原蛋白和鹿角脫盤膠原蛋白，條件溫和，反應(yīng)時間短，水解后的相對分子質(zhì)量較小，易于人體吸收利用；建立了一條快速、簡單、高效的提取工藝路線，易于實現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)。

2.3鹽提法

幺寶金等[7]為建立鹿角脫盤蛋白提取工藝采用SDS-PAGE，考察不同pH值、不同料液比、不同浸提時間、不同鹽濃度等影響因素對蛋白提取效果的影響。最后得到鹿角脫盤蛋白的提取工藝:pH值12的緩沖液(含50 mmol/L EDTA、0.5mol/L NaCl)浸提，料液比為1∶5，浸提時間為3 h,浸提次數(shù)2次。驗證實驗結(jié)果表明,鹿角脫盤總蛋白收率可達(dá)2%,純度可達(dá)80%。黃萍等[18]以總蛋白得率為評價指標(biāo)，采用單因素試驗和正交試驗設(shè)計優(yōu)選最佳提取工藝。得出最佳提取工藝為:用含0.3 mol/L NaCl，20 mmol/L Na2HPO4緩沖液(pH值為9)提取，料液比為1∶15。采用該提取分離工藝可獲得較高的蛋白收率和純度，是一種快速、簡單、高效的鹿角托盤水溶性總蛋白提取工藝，這為鹿角托盤水溶性蛋白更深入的研究與開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

3 鹿花盤的多肽提取工藝

3.1鹽 析

王志兵等[3]以鹿花盤為原料,經(jīng)過水浴、過濾、鹽析和離心等步驟進(jìn)行提取,再采用中性甲醛滴定進(jìn)行水解，然后進(jìn)行純化，方法為將水解液裝入透析袋(截流分子質(zhì)量8 000～15 000)中，用蒸餾水于4 ℃冰箱中透析3 d，24 h換一次水。將外透析液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，并將濃縮液冷凍干燥,即得鹿花盤蛋白多肽樣品。此方法溫度系數(shù)小，溶解度大，應(yīng)用范圍廣，而且成本低廉，對多肽有保護(hù)作用，重復(fù)性好。但是其提純的蛋白質(zhì)濃度不高，只用于初步純化。

3.2高壓輔助提取

于文影[2]在采用高壓輔助提取法提取蛋白過程中，研究壓力、時間、料液比對蛋白質(zhì)提率的影響。以壓力(A)、提取時間(B)、料液比(C)三個因素作為實驗因子做高壓輔助提取的正交優(yōu)化實驗。結(jié)果表明對提取率影響最大的是料液比，然后是壓力和提取時間。最優(yōu)提取工藝組合壓力值為0.10 MPa，提取時間為15 min，料液比為1∶5。在上述條件下提取，提取率為92.03%。與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)提取方法相比，高壓輔助提取法具有操作工藝簡單易控制，產(chǎn)品無小分子鹽滲入，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)環(huán)保無污染的優(yōu)點。

3.3熱回流浸提法

王志兵等[3]以鹿花盤為試驗原料,以鹿花盤水溶性成分總氮含量為考察對象,通過熱回流浸提法、超聲波提取法、高壓脈沖電場提取法提取鹿花盤水溶性成分。結(jié)果得出，熱回流浸提法為最佳提取方法，并通過正交試驗優(yōu)化其提取的最佳工藝條件為溫度90 ℃、料液比1∶30、提取次數(shù)2次、提取時間60 min;高壓脈沖電場提取法最佳工藝條件為電場強(qiáng)度50 kV/cm、脈沖數(shù)30、溫度20 ℃、料液比為1∶20。熱回流浸提法作為比較成熟的提取方法，廣泛應(yīng)用于提取加工，它具有設(shè)備簡單、可以工業(yè)化放大等優(yōu)點，但同時破壞熱敏性物質(zhì),高能耗、費時，在當(dāng)今追求低溫、低能耗、省時的大趨勢下，熱回流浸提法已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代化提取技術(shù)的需要。

3.4分子篩層析

黃鳳杰等[19]以鹿角脫盤為原材料，經(jīng)稀醋酸提取，再利用離子交換柱層析、凝膠柱層析、反相柱層析進(jìn)一步純化和質(zhì)譜檢測確定其Mr為712 716的多肽，命名為鹿角脫盤多肽。王麗虹等[20]用分子篩制備的鹿花盤水溶性成分經(jīng)雙縮脲試驗為淡紫色，茚三酮反應(yīng)為藍(lán)紫色，證明其水溶性成分中含有多肽和氨基酸。通過用KJA-5型氨基酸自動分析儀測定含有15種氨基酸。制備的多肽成分經(jīng)雙縮脲反應(yīng)為陽性，茚三酮反應(yīng)為陰性。經(jīng)紫外光譜檢查在270～279 nm處為最高吸收峰。紅外檢測也有明顯的氨基酸和多肽成分的特征。王振玉等[21]采用水煎煮提取膠體物質(zhì)，再經(jīng)過透析或超濾分離，從中分離出有活性作用的16種氨基酸組成的小分子多肽。具體方法為：

1.樣品制備。取鹿花盤250 g經(jīng)透析分離后減壓濃縮至15 mL，置于真空干燥箱中70 ℃，干燥4 h取出提取物備用。

2.葡聚糖凝膠G-25層析柱制備。Sephadex G-25(粒度50～150)，分子量分級范圍(肽及球蛋白)1 000～5 000之間加入適量蒸餾水使之充分膨脹后，置于(980×25 mm)玻璃層析柱中，用0.02 mol/L NaCl洗脫平衡。

3.層析分離：將上述提取物加入Sephadex G-25層析柱頂端，樣品進(jìn)柱后，用0.02 mol/L NaCl洗脫，洗脫速度0.5 mL/min，分布收集，分別檢驗各管洗脫液的多肽和氨基酸，雙縮脲反應(yīng)陽性為多肽成分，雙縮脲反應(yīng)而茚三酮反應(yīng)陽性為氨基酸成分。該方法應(yīng)用范圍廣且設(shè)備簡單、操作方便、復(fù)性高、不影響分子的生物學(xué)活性等。但其分辨率不高，分離操作較慢，由于凝膠層析是以物質(zhì)分子量的不同作為分離依據(jù)的，分子量的差異僅表現(xiàn)在流速的差異上，所以分離時必須嚴(yán)格把握流速。因而分離操作一般較慢。而且對于分子量差別不大的物質(zhì)難以達(dá)到很好的分離。此外，凝膠層析要求樣品粘度不宜太高，凝膠顆粒有時還有非特異吸附現(xiàn)象。

4 展 望

綜上所述，可以用很多不同的方法如：分子篩層析、酶解法、SDS-PAGE等從鹿花盤中提取蛋白質(zhì)和多肽。隨著現(xiàn)代科技手段及實驗技術(shù)的發(fā)展，鹿花盤中蛋白質(zhì)、多肽可以利用高科技方法提純，這些方法雖可提高鹿花盤中蛋白質(zhì)和多肽利用率，并且對鹿花盤的進(jìn)一步開發(fā)有著極為重要的意義，但其價格較高，操作較復(fù)雜，用時較長，因此探求簡便、廉價的鹿花盤蛋白質(zhì)、多肽的提取方法有著極大的經(jīng)濟(jì)及現(xiàn)實意義。

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1673-2995(2013)04-0305-04

S865.4+2

A

吉林醫(yī)藥學(xué)院大學(xué)生科研基金資助項目(201211).

黃彬彬(1990-)，女(漢族)，在讀本科.

葛紅娟(1985-)，女(漢族)，助理實驗師,本科.

2012-12-06)