多發(fā)性骨髓瘤組織微小RNA-19表達及其臨床意義

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(青島市市立醫(yī)院血液科，山東 青島 266071)

微小RNA(miRNA)為一類長度約20～25個核苷酸的內(nèi)源性小分子非編碼單鏈RNA，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平表達調(diào)控[1]，其表達失調(diào)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用[2-4]。多發(fā)性骨髓瘤(MM)發(fā)病率高居血液系統(tǒng)惡性疾病第2位。研究結(jié)果顯示，miRNA-19在MM細胞中高表達[5-6]。本文檢測了43例MM病人及20例正常對照者骨髓單個核細胞(BMMNC)中miRNA-19表達水平，并分析miRNA-19表達與MM預(yù)后和臨床分期關(guān)系，探討其在MM發(fā)生、發(fā)展中可能的作用及意義。

1 材料和方法

1.1 材料來源

MM病人骨髓標本均取自我院血液科2006年5月—2011年3月住院的病人，符合張之南主編的《血液病診斷和療效標準》(1998年)中提出的MM診斷及療效標準。其中男25例，女18例；年齡為38～78歲，中位年齡55歲。曾分別以MP、VAD、TD和沙利度胺等方案治療。其中初治25例，難治復(fù)發(fā)18例。3個療程化療后43例中31例有效，無變化和疾病進展共12例。按照Durie-Salmon(D-S)分期標準，Ⅰ期2例，Ⅱ期16例，Ⅲ期25例。β2-MG水平<4.0 mg/L者20例，≥4.0 mg/L者23例。對照組20例，男11例，女9例；年齡39～64歲，中位年齡51歲，均為骨髓常規(guī)正常門診病人。所有入選對象均無自身免疫性疾病及惡性腫瘤等。

1.2 試劑和儀器

Trizol、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國Invitrogen公司)，Real-time PCR Master Mix(TOYOBO公司)，LightCyclerTM定量PCR儀(Roche公司)。

1.3 BMMNC的分離

取骨髓5 mL，EDTA抗凝，用生理鹽水稀釋 3～4倍，然后將其緩慢加至4 mL的Ficoll淋巴細胞分離液中(相對密度1.077)，2 000 r/min離心 16 min。自界面層取得BMMNC，用生理鹽水洗滌3次，以2×108/L的密度接種于含體積分數(shù)0.15的新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2和全濕條件下培養(yǎng)。

1.4 總RNA的提取和miRNA-19表達檢測

Trizol法提取細胞總RNA，為增加miRNA得率，將異丙醇沉淀步驟改為-20 ℃沉淀2 h以上。定量檢測RNA濃度(A260/A280比值>1.8方可用于檢測)。加poly(A)尾后，應(yīng)用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以(Oligo)dT為引物，反應(yīng)條件如下：16 ℃ 30 min，37 ℃ 30 min，70 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min。以此制備的cDNA為模板，以U6作為內(nèi)參照，在Roche定量PCR儀上進行實時熒光定量PCR檢測，所有樣品均做3個復(fù)孔，總反應(yīng)體系為20 μL。設(shè)定反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s后，95 ℃變性5 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸15 s。按照比較閾值法[7]，讀取Ct值，用公式2-ΔΔCt計算目的基因miRNA-19的表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-19在MM中的表達

MM組miRNA-19表達水平為6.80±0.87，顯著高于對照組，其中復(fù)發(fā)難治組miRNA-19表達水平為8.49±0.74，初治組為4.35±0.91，兩者比較差異有顯著性(t=5.82，P<0.05)。

MM病人化療前miRNA-19表達水平為6.80±0.87，化療后miRNA-19為3.43±1.57，化療后較化療前明顯降低(t=2.61，P<0.05)，其中化療有效組化療前miRNA-19表達水平為4.97±0.49，化療后為1.99±0.61，化療后較化療前明顯降低，差異有顯著意義(t=3.83，P<0.05)；無效進展組化療前mi-RNA-19表達水平為8.06±0.24，與化療后mi-RNA-19表達水平(6.83±0.57)相比無明顯改變。無效進展組化療前miRNA-19表達水平為8.06±0.24，化療有效組為4.97±0.49，兩組比較差異有顯著性(t=5.15，P<0.05)。

2.2 miRNA-19表達水平與β2-MG和D-S分期的相關(guān)性

Ⅲ期MM病人miRNA-19表達水平為7.89±1.07，明顯高于Ⅱ期MM病人miRNA-19表達水平(4.46±0.43)，差異有顯著性(t=3.54，P<0.05)。β2-MG血漿水平≥4.0 mg/L MM的病人miRNA-19的表達水平為7.67±1.29，明顯高于β2-MG<4.0 mg/L組miRNA-19表達水平(4.35±0.95)，差異有顯著性(t=4.09，P<0.05)。

3 討 論

MM是一種源發(fā)于免疫系統(tǒng)淋巴細胞的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年升高，已成為第二常見的惡性血液病，由于異常漿細胞和單克隆免疫球蛋白過度增生，導(dǎo)致嚴重的體液免疫缺陷和骨骼破壞，MM病死率高[8-9]。目前MM發(fā)病機制不清，治療效果個體差異性大，已有的預(yù)后評估指標不能很好地體現(xiàn)病情的復(fù)雜性，對其發(fā)病機制和預(yù)后影響因素的深入研究是有效解決臨床治療難題的關(guān)鍵。

目前普遍認為miRNA與腫瘤細胞的增殖密切相關(guān)，miRNA-19在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的癌基因作用，其過度表達與MM、白血病、淋巴瘤以及乳癌等非血液系統(tǒng)實體腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和疾病預(yù)后密切相關(guān)[5-6,10-11]。PICHIORRI等[6]研究結(jié)果顯示，細胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白1(SOCS-1)是miRNA-19靶基因，過表達的miRNA-19能抑制SOCS-1表達，SOCS-1是IL-6信號傳導(dǎo)通路的抑制因子，miRNA-19高表達間接導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡受抑制，導(dǎo)致腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。OLIVE等[12]研究顯示，在腫瘤細胞中miRNA-19通過活化Akt-mTOR信號途徑，抑制Pten，促進c-myc誘導(dǎo)的腫瘤細胞增殖。LIANG等[13]研究顯示，miRNA-19與腫瘤細胞耐藥密切相關(guān)，而抑制miRNA-19表達能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥，機制可能與miRNA-19靶向作用Pten有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，MM病人miRNA-19過表達，其中復(fù)發(fā)難治組miRNA-19表達明顯高于初治組，化療后miRNA-19表達降低，與文獻報道結(jié)果相符，提示miRNA-19在MM中發(fā)揮著重要的致癌基因作用。本研究還顯示，化療后miRNA-19表達降低以化療有效組最為明顯，無效進展組miRNA-19表達化療前后無明顯改變，而且無效進展組病人化療前miRNA-19表達顯著高于同期化療有效組，提示miRNA-19高水平表達可能為MM病人的不良預(yù)后指標，與MM預(yù)后有密切關(guān)系。本研究還通過比較β2-MG和D-S分期不同組間MM病人miRNA-19表達水平差異，進一步證實了miRNA-19和MM腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和疾病預(yù)后有密切關(guān)系，可作為MM預(yù)后不良指標，但具體機制有待進一步探討。

綜上所述，miRNA-19通過對靶基因的調(diào)控，調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖和凋亡，參與腫瘤細胞的侵襲、浸潤和轉(zhuǎn)移，可作為MM預(yù)后不良指標之一。利用反義寡核苷酸抑制miRNA-19表達將是MM治療的一個新研究方向。相信隨著基因技術(shù)的成功發(fā)展，miRNA-19將會成為MM診斷標志物和治療耐藥的新靶點。

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