小兒支原體肺炎的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

陳華干

（廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院檢驗(yàn)科 545000）

支原體肺炎是肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）引起的急性呼吸道感染伴肺炎，過去稱為“原發(fā)性非典型肺炎”的病原體中，肺炎支原體最為常見，可引起流行，約占各種肺炎的10%，嚴(yán)重的支原體肺炎也可導(dǎo)致死亡。肺炎支原體是引起小兒呼吸道感染的重要病原體，5歲以上兒童中肺炎支原體感染率達(dá)66.7%。由于肺炎支原體無細(xì)胞膜，感染初期臨床表現(xiàn)不明顯，選擇實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法對(duì)早期診斷和治療具有重要的意義。2012年1～4月本院對(duì)收治入院的100例疑似支原體感染患兒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組病例100例，均為本院門診和住院治療的患兒，其中男49例，女51例；年齡6個(gè)月至12歲，平均（5.9±2.3）歲；臨床表現(xiàn)主要為咳嗽、發(fā)熱、咳痰、流涕、頭痛、咽痛等。

1.2 標(biāo)本采集

1.2.1 咽拭子和痰液標(biāo)本的采集 （1）用無菌棉拭子直接擦拭咽后壁、扁桃體、假膜邊緣或口腔潰瘍處；（2）清晨讓患兒清水漱口后，用力咳出痰液；（3）收集患兒24h痰液；（4）?？漆t(yī)生利用支氣管鏡直接從患兒支氣管內(nèi)采集。

1.2.2 血液標(biāo)本的采集 檢驗(yàn)標(biāo)本采集得是否規(guī)范直接關(guān)系到檢驗(yàn)標(biāo)本數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，對(duì)于疾病的診斷和治療有著重要的意義。血液標(biāo)本應(yīng)在患兒晨起空腹時(shí)采集，以避免飲食因素影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；標(biāo)本應(yīng)盡量選擇在未使用各種藥物前，以避免藥物對(duì)血液成分的影響。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法 （1）PCR法：咽拭子標(biāo)本采用中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因診斷中心開發(fā)的MP-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR檢測(cè)；PCR擴(kuò)增及定量?jī)x為美國(guó)Gene Amp5700Sequence Detedtion System基因擴(kuò)增儀；NP-DNA擴(kuò)增及檢測(cè)按照試劑盒說明實(shí)施；（2）熒光PCR法：抽取外周血應(yīng)用羅氏實(shí)時(shí)熒光PCR儀測(cè)定MP-PCR，嚴(yán)格按《中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)全書》操作規(guī)范進(jìn)行操作，以 F 5′-CCA ACC AAA CAA CAA CGT TCA-3′，R 5′-ACC TTG ACT GGA GGC CGT TA-3′為引物，引物位于PI基因區(qū)。IgM在1∶4以上，IgG＞1∶16有診斷意義。

1.3.2 明膠顆粒法 被動(dòng)凝集法，抽取外周血采用日本富士MYCO-Ⅱ試劑盒測(cè)定MP-PCR抗體，用肺炎支原體（Mac株）抗原致敏的明膠顆粒與一定比例稀釋的血清做凝集反應(yīng)，用未致敏的明膠顆粒做對(duì)照反應(yīng)，以觀察被檢血清的凝集效價(jià)，結(jié)果判定1∶40為臨界值，滴度大于或等于1∶80為陽性。

1.3.3 ELISA法 抽取外周血嚴(yán)格按照說明書操作。

1.3.4 培養(yǎng)法 以牛心消化液為基礎(chǔ)另加20%小牛血清及新鮮酵母菌浸液制成的液體和固體培養(yǎng)基，在液體培養(yǎng)基中加入葡萄糖及酚紅、美藍(lán)指示劑，將標(biāo)本接種于液體培養(yǎng)基中增菌，1周后培養(yǎng)基由紫變綠，液體清晰，可轉(zhuǎn)種于固體培養(yǎng)基上，在5%CO2大氣環(huán)境下培養(yǎng)1周后長(zhǎng)出菌落，如出現(xiàn)“荷包蛋”樣菌落即可初步診斷，亦可再進(jìn)行生化鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 肺炎支原體生物學(xué)特征 菌落很小，很少超過0.5mm，肉眼不易觀察，可通過細(xì)菌濾器。在顯微鏡下菌落呈圓形均勻的顆粒狀，外圍有透明帶。MP呈球形、桿狀和絲狀等多種形態(tài)。僅有由三層膜組成的胞質(zhì)膜，革蘭染色呈陰性。胞質(zhì)內(nèi)含核糖體和雙股DNA。在有氧或無氧條件下生長(zhǎng)較其他支原體慢，接種后5～10d才能見到。能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸，能產(chǎn)生過氧化酶類溶血素。

2.2 檢測(cè)結(jié)果 通過檢測(cè)，100例患兒中確診為肺炎支原體感染者43例，其中PCR法檢測(cè)陽性13例，陽性率13%（13／100）；熒光PCR法檢測(cè)陽性14例，陽性率14%（14／100）；明膠顆粒法檢測(cè)陽性7例，陽性率7%（7／100）；ELISA法檢測(cè)陽性9例，陽性率9%（9／100）；43例陽性患兒標(biāo)本進(jìn)行病原體培養(yǎng)，陽性10例，陽性率23.3%（10／43）。

3 討 論

肺炎支原體曾名為類胸膜肺炎微生物（PPLO），是介于病毒與細(xì)菌之間的一種沒有細(xì)胞壁的病原體，是人類原發(fā)性非典型性肺炎的病原體。主要經(jīng)飛沫傳播，其基本病理呈間質(zhì)性肺炎或毛細(xì)支氣管炎樣改變，臨床表現(xiàn)以頑固性咳嗽為特征［1］。MP抗原與人體心、肺、腦、腎和平滑肌等組織存在部分共同抗原，感染后可產(chǎn)生相應(yīng)組織的自身抗體，并形成免疫復(fù)合物。自身抗體與免疫復(fù)合物可引起肺內(nèi)和肺外多系統(tǒng)病變，如肺炎、心肌炎、肝壞死及神經(jīng)損害等［2］。肺外并發(fā)癥可能是因抗原、抗體形成免疫復(fù)合物激活補(bǔ)體產(chǎn)生中性粒細(xì)胞趨化因子，吸引大量白細(xì)胞侵入病變部位，釋放溶酶菌中的水解酶引起增生病變［3］。研究證實(shí)［4］，肺炎支原體（MP）是引起兒童呼吸道感染的重要病原體，5歲以上兒童肺炎中MP感染率達(dá)66.7%。臨床上MP檢測(cè)方法多樣，病原體培養(yǎng)需時(shí)間長(zhǎng)（2～3周），且檢出率低，對(duì)臨床的診斷和治療效率低，本組確診為肺炎支原體感染43例患兒病原體培養(yǎng)，陽性率僅為23.3%（10／43），檢出率明顯低于以往的文獻(xiàn)報(bào)道［5］，這與支原體是體外培養(yǎng)中最小的病原微生物，培養(yǎng)法復(fù)雜，且培養(yǎng)法要考慮MP的存活性及足夠的數(shù)量，以及有否使用過抗生素有關(guān)。

本組病例明膠顆粒法檢測(cè)陽性7例，熒光PCR法陽性14例，其中有10例患兒于發(fā)病第1天即采集標(biāo)本檢測(cè)，2例有輕微臨床表現(xiàn)、胸片較小范圍改變，提示明膠顆粒法的陽性率與病情、病變部位、嚴(yán)重程度有關(guān)；明膠顆粒法運(yùn)用表面吸附支原體抗原的明膠顆粒代替動(dòng)物紅細(xì)胞，消除了非特異性反應(yīng)，且3h即能出報(bào)告，無需特殊儀器設(shè)備即可操作，利于支原體肺炎的早期診斷。ELISA法與明膠顆粒法檢測(cè)陽性率較接近，分別為9%和7%，PCR法陽性率13%，熒光PCR法陽性率14%。這幾種檢測(cè)方法分別有其優(yōu)缺點(diǎn)，臨床上應(yīng)根據(jù)患兒的實(shí)際情況選擇檢測(cè)方法，必要時(shí)聯(lián)合兩種或兩種以上方法檢測(cè)。

［1］ 董宗祈.肺炎支原體患兒的治療［J］.小兒急救醫(yī)學(xué)，2002，9（3）：137.

［2］ 李夢(mèng)東.實(shí)用傳染病學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1994：246.

［3］ 趙淑琴.肺炎支原體肺炎的發(fā)病機(jī)制［J］.小兒急救醫(yī)學(xué)，2002，9（3）：129.

［4］ 游選旺，馬蘭英，陳卉旖.兒童肺炎支原體感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)［J］.山東醫(yī)藥，2009，49（37）：112.

［5］ 陳建偉，陳衛(wèi)宇，胡秀華，等.兒童支原體肺炎的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)研究［J］.浙江臨床醫(yī)學(xué)，2009，11（5）：548-549.