真鯛虹彩病毒遼寧株跨膜蛋白(ORF049L)基因的克隆及表達(dá)

孫志鵬，徐祥，李強，葉仕根，李華

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023)

虹彩病毒科Iridoviridae 包括5 個屬，即虹彩病毒屬Iridovirus、綠虹彩病毒屬Chloriridovirus、蛙病毒屬Ranavirus、淋巴囊腫病毒屬Lymphocystivirus和細(xì)胞腫大病毒屬Megalocytivirus［1］，其中細(xì)胞腫大病毒屬的虹彩病毒Iridoviruses 被認(rèn)為是近年來導(dǎo)致東亞及東南亞地區(qū)等許多國家的重要經(jīng)濟魚類大量死亡的主要病原之一［2-4］。因此，虹彩病毒也成為國際水生動物病毒病研究的熱點之一。2009年，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室科研人員在中國遼寧省某養(yǎng)殖場發(fā)病的條石鯛Oplegnathus fasciatus體內(nèi)分離到一種病毒，經(jīng)過分子生物學(xué)及電鏡觀察等方法確定該病毒為真鯛虹彩病毒，暫時將其命名為真鯛虹彩病毒遼寧株(RSIV-LN09)［5］。

囊膜病毒的膜蛋白具有多種生物學(xué)功能［6］，它是細(xì)胞識別的重要抗原表位，也是設(shè)計和制備抗病毒藥物及疫苗的關(guān)鍵靶標(biāo)［7］。Caipang等［8］和Kim等［9-10］分別利用虹彩病毒的跨膜蛋白制備出了免疫保護率較高的核酸疫苗和對病毒具有較強中和作用的多克隆抗體，王小文等［11］、何利波等［12］、吳成龍等［13］在虹彩病毒功能蛋白研究方面也開展了一些工作，但關(guān)于其膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能方面的研究卻很少［14］。開展膜蛋白方面的研究對于闡明病毒與宿主細(xì)胞的作用機制以及開發(fā)抗病毒疫苗具有重要作用。為此，本研究中作者克隆了真鯛虹彩病毒遼寧株一個跨膜蛋白(ORF049L)的基因序列，利用生物信息學(xué)方法分析了該蛋白的基本結(jié)構(gòu)特征，經(jīng)原核表達(dá)和純化得到了大量高純度的重組蛋白His-049L，為進一步制備病毒跨膜蛋白單克隆抗體及其功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、質(zhì)粒和菌株 虹彩病毒分離自2009年遼寧省某養(yǎng)殖場的發(fā)病條石鯛。克隆載體pMD-18T 購于寶生物工程(大連)有限公司，表達(dá)載體pET-28a(+)購于Novagen 公司，大腸桿菌DH5α 及BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購于天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 工具酶和試劑 T4 DNA 連接酶及限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I、Sal I 購于寶生物工程(大連)有限公司;質(zhì)粒小量抽提試劑盒、氨芐青霉素(Amp)、鹽酸胍購自上海生物工程有限公司;卡那霉素(Kan)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒購自BBI 公司;瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、His-Tag 單克隆抗體購自天根生化科技(北京)有限公司;His-Bind Purification Kit 購自Novagen 公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒總DNA 的提取 取瀕死魚的脾臟100 mg，置于1.5 mL Eppendorf 管中，在10 ℃條件下，采用CTAB 方法［15］提取病毒DNA，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ORF049L 基因的克隆 根據(jù)文獻［9］和質(zhì)粒pET-28a(+)酶切位點設(shè)計引物，上游引物P1: 5' GAATTCATGTACCCTGACTGTCCCAG 3'(EcoR I);下游引物P2:5' GTCGACTTATTTCAT- AAGCCTTGCAC A 3'(Sal I)。

PCR 反應(yīng)總體系25 μL，其中包括:Taq 酶0.2 μL，10×buffer 2.5 μL，模板DNA 1.0 μL，上下游引物P1、P2 各1 μL，ddH2O 19.3 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃下預(yù)變性5 min;94 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸40 s，共進行30 個循環(huán);最后在72 ℃下再延伸8 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定、產(chǎn)物回收試劑盒純化后連接至pMD-18T 載體中，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中。挑選陽性克隆送上海生物工程有限公司測序。

1.2.3 ORF049L 基因及其編碼的蛋白序列分析采用Blastn和Blastx 程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進行序列比對;采用SignalP 4.0 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽預(yù)測;采用 ExPASy(http://www.expasy.org/)和TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_ form.html)在線工具進行ORF049L 蛋白的理化性質(zhì)及跨膜結(jié)構(gòu)域分析;采用DNA Star 軟件的Protean 功能進行蛋白抗原特性分析。

1.2.4 原核表達(dá)條件的優(yōu)化 按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書中的方法提取pMD-18T-049L 重組質(zhì)粒，用EcoR I和Sal I 限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒pMD-18T - 049L和pET - 28a 質(zhì)粒進行雙酶切，用T4 DNA 連接酶將切膠回收的目的片段與pET-28a 質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，并挑選陽性克隆進行測序，將測序結(jié)果正確的pET-28a -049L 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，然后涂布于卡那霉素(Kan，30 μg/mL)LB 篩選平板上。次日挑取轉(zhuǎn)化至LB 平板上長出的陽性菌落，于37 ℃條件下在LB 液體培養(yǎng)基(Kan，30 μg/mL，下同)中活化過夜，即為初始培養(yǎng)液。參照文獻［16-18］中的方法進行原核表達(dá)條件(誘導(dǎo)溫度、IPTG 濃度及誘導(dǎo)時間)的優(yōu)化，具體步驟如下:

誘導(dǎo)溫度:取初始培養(yǎng)液，按照1%接種量分別接種到3 個內(nèi)有1 mL LB 液體培養(yǎng)基的離心管中，于37 ℃條件下培養(yǎng)至OD600nm值為0.5 時加入IPTG，使其終濃度為1.0 mmol/L，分別于16、25、37 ℃下誘導(dǎo)6 h，離心收集菌體并經(jīng)超聲破碎后進行SDS-PAGE 分析。

IPTG 濃度:取初始培養(yǎng)液，按照1%接種量分別接種到6 個內(nèi)有1 mL LB 液體培養(yǎng)基的離心管中，于37 ℃條件下培養(yǎng)至OD600nm值為0.5 時加入IPTG，使 其 終 濃 度 分 別 為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L，37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)6 h，離心收集菌體并經(jīng)超聲破碎后進行SDS-PAGE 分析。

誘導(dǎo)時間:取初始培養(yǎng)液，按照1%接種量分別接種到4 個內(nèi)有1 mL LB 液體培養(yǎng)基的離心管中，于37 ℃條件下培養(yǎng)至OD600nm值為0.5 時加入IPTG，使其終濃度為1.0 mmol/L，37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)，分別于加入IPTG 后的0、1、3、6 h 后取樣，離心收集菌體并經(jīng)超聲破碎后進行SDS-PAGE 分析。

1.2.5 Western blot 分析 將表達(dá)產(chǎn)物進行SDSPAGE 分析后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上。在4 ℃條件下用質(zhì)量濃度為50 g/L 的脫脂乳封閉過夜;用PBST 洗滌3次，每次5 min;置于抗His單抗中(用0.01 mol/L PBS 稀釋至終濃度為0.1 μg/mL)，于37 ℃下緩慢搖動1 h;再用PBST 洗滌3次，每次5 min。將NC 膜加入至堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 抗體中(按1∶2 000稀釋于0.01 mol/L PBS 中)，于37 ℃下緩慢搖動1 h，再用PBST 緩沖液洗滌3次后，加入NBT/BCIP底物顯色液顯色5 min，觀察結(jié)果。

1.2.6 融合蛋白的純化 融合蛋白在宿主菌中主要以不可溶的包涵體狀態(tài)存在。將表達(dá)產(chǎn)物進行超聲波破碎后離心收集包涵體，然后用含變性劑的1×Bind Buffer(500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L 咪唑，6 mol/L 鹽酸胍，pH 7.9)于冰上充分溶解，在4 ℃下以16 000 g 離心30 min，上清用0.45 μm 微孔濾膜過濾，將過濾好的上清加入到已平衡好的層析柱中，按照His-Bind Purification Kit 蛋白變性條件下的純化方式進行洗脫并分段收集結(jié)合的目的蛋白。取10 μL 收集物用水5 倍稀釋后，進行SDS-PAGE 分析。將純化好的蛋白液置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 ORF049L 基因的克隆

以重組質(zhì)粒pMD-18T-049L 為模板，用EcoR I、Sal I 內(nèi)切酶進行酶切驗證以及用P1和P2 引物進行PCR 擴增。經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，可得到429 bp 的預(yù)期DNA 目標(biāo)帶(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒pMD-18T-049L 的酶切及PCR 鑒定Fig.1 Identification of recombination plasmid pMD-18T-049L by enzyme digestion and PCR

2.2 ORF049L 基因及其編碼蛋白的序列分析

對測序結(jié)果分析表明，RSIV-LN09-ORF049L的全長為429 個核苷酸，編碼了一個由142 個氨基酸組成的蛋白，推測其相對分子質(zhì)量為16 127.8。該蛋白上無信號肽區(qū)域，等電點為7.53;不穩(wěn)定指數(shù)為34.04，屬穩(wěn)定蛋白;總平均疏水值為0.149，屬疏水蛋白［19］?？缒ね?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，在第121 ～138 個氨基酸殘基處為一個由內(nèi)向外的跨膜區(qū)(score:1855)，而在第62 ～80 個氨基酸殘基處為由外向內(nèi)的跨膜區(qū)(score:622，score 值大于500可視為顯著)(圖2)。NCBI Blast同源性搜索結(jié)果顯示，RSIV-LN09-ORF049L 核苷酸 序 列 與 RBIV(AY532606.1)、OSGIV(AY894343.1)、LYCIV(AY779031.1)、ISKNV(AF371960.1)、TBIV(GQ27349 2.1)5 個基因序列的相似度分別為99%、99%、99%、94%、92%。編碼的氨基酸序列與 RBIV ORF049L(AAT71864.1)、OSGIV ORF52L(AAX82361.1)、ISKNV ORF050L(NP 612272.1)和TBIV ORF48L(ADE34393.1)4 個蛋白的氨基酸序列的相似度分別高達(dá)100%、100%、90%、87%。

圖2 ORF049L 蛋白跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.2 Predicted membrane topology of ORF049L protein

綜合Kyte-Doolittle 親水性分析、Hopp-Woods最大局部親水性分析、Jameson-Wolf 抗原指數(shù)分析和Emini表面可能性分析，得出結(jié)果如下:ORF049L 蛋白具有許多潛在的抗原決定簇，尤其在氨基酸序列的第1 ～11、33 ～41、53 ～61、76 ～84、91 ～98、106 ～118、139 ～141 區(qū)域及附近存在B 細(xì)胞抗原表位的可能性較高，易于與抗體嵌合［20］(圖3)。

2.3 融合蛋白的表達(dá)、純化及Western blot 分析

2.3.1 表達(dá)條件的優(yōu)化 參照張喆等［16］的方法進行融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化。從圖4(a)可見:在相同的IPTG 濃度(1 mmol/L)和誘導(dǎo)時間(6 h)下，不同的培養(yǎng)溫度(16、25、37 ℃)可顯著影響轉(zhuǎn)化了pET-28a-049L 的大腸桿菌BL21(DE3)全菌蛋白(重組蛋白)的表達(dá);在培養(yǎng)溫度為37 ℃時，重組蛋白的相對表達(dá)量最高，在培養(yǎng)溫度為16 ℃時，重組蛋白的相對表達(dá)量最低。

從圖4(b)可見:在相同的培養(yǎng)溫度(37℃)和誘導(dǎo)時間(6 h)條件下，不同的IPTG 濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)可顯著影響重組蛋白的表達(dá);不添加誘導(dǎo)劑時無目的蛋白表達(dá)，用0.2、0.4 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)時重組蛋白的相對表達(dá)量很低，用0.8 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)時重組蛋白的相對表達(dá)量最高。

從圖4(c)可見:在相同培養(yǎng)溫度(37 ℃)和IPTG 濃度(1 mmol/L)條件下，不同的誘導(dǎo)時間(0、1、3、6 h)對重組蛋白的表達(dá)有較大影響;重組蛋白的相對表達(dá)量隨誘導(dǎo)時間的增加而增加，在誘導(dǎo)時間為4 h 重組蛋白有明顯表達(dá)，誘導(dǎo)時間為6 h 重組蛋白的相對表達(dá)量最大。

2.3.2 純化及Western blot 分析 SDS-PAGE 分析表明:經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后的重組菌全菌蛋白比轉(zhuǎn)化了pET-28a 的大腸桿菌BL21(DE3)全菌蛋白(未誘導(dǎo)和誘導(dǎo))、未經(jīng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化了pET-28a-049L 的大腸桿菌BL21(DE3)全菌蛋白在相對分子質(zhì)量為17 000 處多出一條蛋白條帶(圖5(a))。經(jīng)Western blot 鑒定，該條帶能特異性地與His·Tag 單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)(圖5(b))，證實了17 000 處的條帶為含有目的蛋白的融合表達(dá)產(chǎn)物。

圖3 ORF049L 蛋白的親水性、抗原指數(shù)及表面可能性分析Fig.3 Hydrophilicity plot，surface probability plot and antigenicity index for ORF049L protein

3 討論

目前，虹彩病毒科內(nèi)已經(jīng)有14 株病毒完成了全基因組測序［21］。經(jīng)序列對比后發(fā)現(xiàn)，RSIVLN09 - ORF049L 與數(shù)據(jù)庫中 RBIV ORF049L(AAT71864.1)、OSGIV ORF52L(AAX82361.1)、ISKNV ORF050L(NP 612272.1)和TBIV ORF48L(ADE34393.1)4 個蛋白的氨基酸序列高度相似，其序列相似度分別為100%、100%、90%和87%，未發(fā)現(xiàn)其他具有較高相似度的氨基酸序列。因這4種蛋白所屬病毒都是細(xì)胞腫大病毒屬的病毒，故推測這些相似蛋白可能是細(xì)胞腫大病毒屬的病毒(Megalocytivirus)所特有的結(jié)構(gòu)蛋白，而這一特點為利用該蛋白制備病毒的單克隆抗體提供了重要的參考依據(jù)。

本研究中采用TMpred在線工具對 RSIV-LN09-ORF049L 蛋白結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果表明，該蛋白在第62 ～80和第121 ～138 氨基酸殘基處存在兩個跨膜區(qū)域，這與Kim等［9］基于隱馬爾可夫模型(Hidden Markov model，HMM)的預(yù)測結(jié)果略有不同，可能與兩者采用的計算方法不同有關(guān)，但對于ORF049L 蛋白是跨膜蛋白的結(jié)論是一致的。通過對ORF049L 蛋白的抗原決定簇分析發(fā)現(xiàn)，蛋白的潛在B 細(xì)胞抗原優(yōu)勢表位主要集中在氨基酸序列的可變區(qū)域，說明該蛋白具有良好的抗原性［22］?？乖砦慌c蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，但是目前該蛋白的結(jié)構(gòu)和具體功能尚不清楚，因此，本研究結(jié)果只可作為確定該蛋白潛在優(yōu)勢表位的參考，蛋白實際特性還需要進一步進行試驗驗證。

為進一步研究虹彩病毒跨膜蛋白的功能，在上述生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，進行了RSIV-LN09-ORF049L 重組蛋白的表達(dá)研究。經(jīng)SDS-PAGE 分析表明，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后的重組菌全菌蛋白比轉(zhuǎn)化了pET-28a 的大腸桿菌BL21(DE3)全菌蛋白(未誘導(dǎo)和誘導(dǎo))、未經(jīng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化了pET-28a-049L 的大腸桿菌BL21(DE3)全菌蛋白在相對分子質(zhì)量約為17 000 處多出一條蛋白條帶。這正好與目的基因和pET-28a 載體上的標(biāo)簽序列一起融合表達(dá)的重組蛋白的預(yù)期大小一致。通過Western blot 鑒定發(fā)現(xiàn)，該條帶能特異性地與His·Tag 單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)。這表明所獲得的相對分子質(zhì)量為17 000 的蛋白即為His-049L 重組蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)溫度、IPTG 濃度及誘導(dǎo)時間等因素對His-049L 重組蛋白的表達(dá)都有一定的影響。經(jīng)優(yōu)化后的表達(dá)條件為:在37 ℃培養(yǎng)條件下，用0.8 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)6 h。在此條件下，可以得到大量的包涵體蛋白，經(jīng)變性溶解及鎳瓊脂糖凝膠柱純化后即可獲得純度較高的重組蛋白。目前利用純化蛋白制備單抗的工作正在進行中，這也為虹彩病毒的早期檢測及ORF049L 蛋白功能等研究提供了基礎(chǔ)。

圖4 不同誘導(dǎo)條件下重組蛋白His-049L 的表達(dá)Fig.4 Expression of recombinant protein His-049L under different induction conditions

圖5 重組蛋白His-049L 的表達(dá)、純化及Western blot 檢測Fig.5 Expression，purification and western blotting analysis of recombinant protein His-049L

［1］洪健，周雪平.ICTV 第八次報告的最新病毒分類系統(tǒng)［J］.中國病毒學(xué)，2006，21(1):84-96.

［2］He J G，Wang S P，Zeng K，et al.Systemic disease caused by an iridovirus-like agent in cultured mandarin fish，Siniperca chuatsi(Basilewsky)，in China［J］.J Fish Dis，2000，23:219-222.

［3］Shi C Y，Wang Y G，Shao L Y，et al.The first report of an iridovirus-like agent infection in farmed turbot，Scophthalmus maximus，in China［J］.Aquaculture，2004，236:11-25.

［4］Dong C F，Weng S P，Shi X J，et al.A new marine megalocytivirus from spotted knifejaw，Oplegnathus punctatus，and its pathogenicity to freshwater mandarin fish，Siniperca chuatsi［J］.Virus Res，2010，147:98-106.

［5］李華，孫志鵬，李強，等.條石鯛檢出的虹彩病毒特性研究［J］.病毒學(xué)報，2011，27(2):158-164.

［6］楊金華，葉榮.病毒跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)功能與抗病毒藥物設(shè)計［J］.微生物與感染，2009，4(4):231-240.

［7］He J，Hu H J，Harrison R，et al.Transmembrane segments prediction and understanding using support vector machine and decision tree［J］.Exp Syst Appl，2006，30:64-72.

［8］Caipang C M，Takano T，Hirono I，et al.Genetic vaccines protect red sea bream，Pagrus major，upon challenge with red sea bream iridovirus(RSIV)［J］.Fish ＆ Shellfish Immun，2006，26:130-138.

［9］Kim Y，Ha Y，Ahn S J，et al.Production and characterization of polyclonal antibody against recombinant ORF049L of rock bream(Oplegnathus fasciatus)iridovirus［J］.Process Biochem，2007，42(2):134-140.

［10］Kim Y，Kim S.Production and characterization of polyclonal antibody against recombinant ORFs of rock bream iridovirus(RBIV)［J］.J Nati Fish Univ Kroea，2007，56(1):171-177.

［11］王小文，陳新華.大黃魚虹彩病毒腺苷三磷酸酶(ATPase)基因的克隆與表達(dá)［J］.病毒學(xué)報，2004，20(1):81-85.

［12］何利波，柯飛，張奇亞.蛙虹彩病毒一個序列保守基因(RGV-12L)的克隆表達(dá)及定位分析［J］.水生生物學(xué)報，2010，34(6):1166-1171.

［13］吳成龍，史成銀，黃捷，等.大菱鲆紅體病虹彩病毒主要衣殼蛋白基因在畢赤酵母中的重組分泌表達(dá)［J］.漁業(yè)科學(xué)進展，2009，30(3):55-61.

［14］Xu X P，Lu J，Lu Q X.Characterization of a membrane protein(VP001L)from infectious spleen and kidney necrosis virus(ISKNV)［J］.Virus Genes，2008，36(1):157-167.

［15］劉葒，高隆英，史秀杰，等.用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從凡納對蝦中檢出傳染性皮下組織和造血器官壞死病毒［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2002，26(2):185-188.

［16］張喆，李健，王蕓，等.中國對蝦細(xì)胞色素P450 基因CYP4 原核表達(dá)條件優(yōu)化［J］.海洋科學(xué)，2011，35(9):49-55.

［17］方珍珍，景宏麗，江育林，等.草魚呼腸孤病毒VP5 蛋白的表達(dá)與純化［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報，2012，27(6):508-512.

［18］陶然，劉瑞，王晴，等.哈維氏弧菌硫氧還蛋白還原酶在大腸桿菌中的表達(dá)及對大菱鲆的免疫保護作用［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報，2012，27(2):137-142.

［19］金春梅，張守發(fā)，于龍政.牛瑟氏泰勒蟲P23 基因的克隆與生物信息學(xué)分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(24):10381-10382.

［20］張昱，王永錄，張永光.口蹄疫病毒株AF72 VP1 的結(jié)構(gòu)構(gòu)建與B 細(xì)胞表位預(yù)測［J］.生物技術(shù)通報，2008(6):158-163.

［21］Shi C Y，Jia K T，Yang B，et al.Complete genome sequence of a Megalocytivirus(family Iridoviridae)associated with turbot mortality in China［J］.Virology J，2010，7:159.

［22］王笑英，杜培革，吳春風(fēng).OLFM1 蛋白的生物信息學(xué)分析及其多克隆抗體制備與鑒定［J］.中國免疫學(xué)雜志，2010，26(8):721-723.