MicroRNAs與糖代謝的研究進(jìn)展*

劉 佳 張 宏

MicroRNAs（miRNAs） 是一組長約 19～25個(gè)核苷酸（nucleotides，nt）的小分子非編碼RNA，廣泛存在于動(dòng)植物中，在進(jìn)化過程中高度保守，在階段性發(fā)育、器官發(fā)育、細(xì)胞分化、信號(hào)傳導(dǎo)、代謝和腫瘤的發(fā)生過程中都發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，近年來發(fā)現(xiàn)miRNAs也參與葡萄糖的代謝調(diào)節(jié)。本文將miRNAs對(duì)糖尿病的調(diào)節(jié)作用綜述如下。

1 MiRNA的產(chǎn)生和作用機(jī)制

MiRNAs絕大部分位于基因間隔區(qū)，本身不具有開放閱讀框架。多數(shù)動(dòng)物miRNAs位于前體mRNA的內(nèi)含子中，這種安排利于mRNA和內(nèi)含子中的miRNAs共同轉(zhuǎn)錄。這些miRNA加工成熟機(jī)制基本相同，首先在細(xì)胞核內(nèi)編碼miRNAs的基因通過RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄成初級(jí)miRNAs（primiRNAs），之后在一種 RNaseⅢ（Drosha）酶和它的伴侶分子DGCR8組成的復(fù)合物作用下，剪切為約70 nt、具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的 miRNAs前體（pre-miRNAs）。MiRNAs前體在 Ran-GTP 依賴的Exportin-5的作用下，從核內(nèi)運(yùn)輸?shù)桨麧{，在Dicer酶的作用下被剪切成21～25 bp。最后在RNA解旋酶作用下生成成熟的miRNA，成熟miRNAs結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）中發(fā)揮作用。

當(dāng)被miRNAs激活時(shí)，miRISC作為miRNAs途徑的效應(yīng)復(fù)合物特異性識(shí)別靶基因mRNA 3′非翻譯區(qū)（untranslated regions，UTR）上相應(yīng)靶位點(diǎn)，并通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與之結(jié)合，介導(dǎo)mRNA衰減或抑制翻譯的進(jìn)程[1-2]。在植物中大多數(shù)miRNAs通過和靶mRNA完全互補(bǔ)結(jié)合導(dǎo)致mRNA的降解，而在動(dòng)物中通過不完全互補(bǔ)結(jié)合抑制翻譯下調(diào)基因表達(dá)。動(dòng)物不完全互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)通常在 “種子序列”，它是3′UTR中同miRNAs 5′末端2～8 nt匹配、有較強(qiáng)保守性的一段序列，后來也被很多預(yù)測(cè)靶基因的軟件和算法作為miRNAs作用靶基因應(yīng)當(dāng)滿足的條件。

2 MiRNAs與糖尿病

MiRNAs可直接調(diào)節(jié)胰腺細(xì)胞的發(fā)育、胰島素的釋放及其在外周組織的作用。

2.1 MiRNAs與胰腺細(xì)胞發(fā)育 MiR-375可在斑馬魚胰島的發(fā)育中起作用，敲除miR-375可導(dǎo)致胰島形態(tài)發(fā)育缺陷。Lynn等[3]研究發(fā)現(xiàn)小鼠孕14.5 d胰腺發(fā)育過程中有107種miRNAs發(fā)生改變，其中miR-375在胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞表達(dá)，并且和胰十二指腸同源盒-1（pancreatic duodenal homeobox-1,Pdx-1）共同作用。敲除miR-375的純合子小鼠表現(xiàn)為胰腺β細(xì)胞總量減少，提示miR-375在胰腺β細(xì)胞發(fā)育中起了重要的作用；在小鼠胰腺發(fā)育早期刪除Dicer1的RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域（同時(shí)使用Pdx-1增強(qiáng)子）可使所有胰腺細(xì)胞，特別是分泌胰島素的β細(xì)胞明顯減少；而在胰腺發(fā)育晚期刪除Dicer（使用胰島素增強(qiáng)子），無論在胰腺的形態(tài)學(xué)還是β細(xì)胞數(shù)量都沒有改變，提示miRNAs可能是整個(gè)胰腺發(fā)育中所必需的，并且主要作用于發(fā)育的早期。Poy等[4]進(jìn)一步證實(shí)，敲除miR-375的小鼠胰島α細(xì)胞數(shù)量增加，空腹和餐后胰高糖素水平增加，糖異生和肝糖輸出增加，同時(shí)β細(xì)胞數(shù)量減少，提示miR-375對(duì)維持胰腺α、β細(xì)胞數(shù)量和生理功能都具有重要作用。

MiR-124a也在胰島β細(xì)胞中大量存在，在發(fā)育的胰腺中低表達(dá)，在孕期和生育年齡顯著增高，提示miR-124a可能在調(diào)節(jié)胰腺β細(xì)胞發(fā)育中起作用[5]。叉頭蛋白A2（forkhead box protein A2，F(xiàn)oxA2）是已經(jīng)確立的miR-124a的靶基因，可調(diào)節(jié)β細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子Pdx-1、內(nèi)向整流鉀通道6.2（inwardly-rectifying potassium channel 6.2，Kir6.2） 和磺脲類藥物受體1（sulfonylurea receptor 1，Sur1）的表達(dá)。在小鼠胰島素瘤細(xì)胞系MIN6細(xì)胞過表達(dá)或沉默miR-124a可導(dǎo)致FoxA2水平和其下游基因Pdx-1、Kir6.2和Sur-1的改變，提示其在胰腺β細(xì)胞發(fā)育過程中也發(fā)揮了重要作用。同時(shí)，在胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化中至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子神經(jīng)元素3可被miR-15a/b、miR-16和miR-195調(diào)節(jié)，也提示其在胰腺發(fā)育中的重要作用。

2.2 MiRNAs與β細(xì)胞胰島素的釋放 在正常的胰島β細(xì)胞，胰島素的分泌依賴葡萄糖濃度和細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)的改變。Poy等[6]從胰腺β細(xì)胞系MIN6和α細(xì)胞系TC1克隆出胰島特異性miR-375，推斷其可調(diào)節(jié)胰島素釋放。MiR-375過度表達(dá)可抑制葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌。肌侵蛋白（myotrophin，Mtpn）是miR-375預(yù)測(cè)的靶基因，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，以siRNA沉默Mtpn基因可模擬miR-375過表達(dá)所引起的葡萄糖刺激下胰島素釋放的減少和胞吐作用的抑制，同時(shí)miR-375可直接和Mtpn 3′UTR結(jié)合，證實(shí)Mtpn是miR-375的直接靶基因。此發(fā)現(xiàn)第一次確定了一個(gè)哺乳動(dòng)物miRNAs基因的生物功能。后來研究顯示，miR-375對(duì)Mtpn蛋白的表達(dá)和胰島素釋放的調(diào)節(jié)作用可能是通過轉(zhuǎn)錄核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB） 起作用，NF-κB 的激活和葡萄糖刺激的胰島素釋放增加有關(guān)。

El Ouaamari等[7]應(yīng)用數(shù)據(jù)庫分析顯示，在3′-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶 1 （3′-phosphoinositide-dependent protein kinase 1，PDK1）3′UTR 有 miR-375結(jié)合位點(diǎn)，在 β 細(xì)胞系中過表達(dá)miR-375可使PDK1蛋白表達(dá)減少，下游蛋白激酶B通路、糖原合成酶激酶 3（glycogen synthase kinase-3，GSK3）磷酸化水平下調(diào)、β細(xì)胞數(shù)量減少及壽命縮短。自發(fā)性2型糖尿病Gyoto-Kakizaki（GK）大鼠胰島中miR-375表達(dá)減少，在離體大鼠胰島中，高糖可降低miR-375的表達(dá)。生物信息學(xué)分析顯示，Pdx-1和神經(jīng)元分化因子1基因存在于miR-375基因附近的保守位點(diǎn)內(nèi)，提示miR-375可能在調(diào)控胰腺發(fā)育和功能維持的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用。

除了miR-375，通過PicTar靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)得到許多其他的 miRNAs，包括miR-124a和 let-7b，可和Mtpn的3′末端結(jié)合。MiR-375、miR-124a和let-7b在MIN6細(xì)胞系中大量存在[5]，let-7b在小鼠大多數(shù)組織普遍存在，而miR-375和miR-124a有組織特異性和細(xì)胞特異性表達(dá)。三者可協(xié)調(diào)一致，共同調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，當(dāng)三種miRNAs共同作用時(shí)，Mtpn水平顯著低于其分別作用的結(jié)果。在MIN6細(xì)胞過表達(dá)的miR-124a在基礎(chǔ)血糖水平可促進(jìn)胰島素的釋放，而高糖條件下抑制胰島素的釋放。MiR-124a可與Rab27A上的保守位點(diǎn)結(jié)合，提示其是miR-124a直接的靶基因。MiR-124a對(duì)胰島素釋放的調(diào)節(jié)可能還有SNAP25、Rab3A、Synapsin-1A、Rab27A和Noc2的參與。

Plaisance等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在胰島細(xì)胞過表達(dá)miR-9可嚴(yán)重抑制葡萄糖或鉀離子誘導(dǎo)的細(xì)胞外分泌，其作用可能是通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Onecut2的表達(dá)，增加與β細(xì)胞分泌顆粒有關(guān)的Rab GTPase增強(qiáng)子Granuphilin/Slp4的活性來發(fā)揮負(fù)性調(diào)控胰島素分泌作用的。而下調(diào)Granuphilin可使胰島素分泌增高，提示在胰島細(xì)胞中適度的miR-9表達(dá)對(duì)維持Granuphilin表達(dá)水平和胰島素分泌能力有重要的調(diào)節(jié)作用。Esguerra等[9]發(fā)現(xiàn)與Wistar大鼠相比，GK大鼠胰島細(xì)胞有24種miRNAs表達(dá)升高，6種降低，其中miR-335可與突觸融合蛋白結(jié)合蛋白1的3′UTR結(jié)合，提示miR-335亦可能參與胰島素釋放。

2.3 MiRNAs與胰島素在外周組織的作用 胰島素信號(hào)在外周組織傳導(dǎo)障礙，認(rèn)為是胰島素抵抗形成的關(guān)鍵。Herrera等[10]發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比GK大鼠肝臟和脂肪組織中分別有12種和5種miRNAs改變。Kl觟ting等[11]對(duì)腹部手術(shù)患者大網(wǎng)膜脂肪研究顯示，miR-17-5p和miR-132在糖尿病患者中顯著下降，并且和胰島素敏感性指數(shù)有關(guān)。

2.3.1 脂肪組織 Esau等[12]研究顯示miR-143在脂肪細(xì)胞的分化中上調(diào)，以反義寡核苷酸抑制miR-143的活性，可使胰島素敏感葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4、激素敏感脂肪酶、脂肪酸結(jié)合蛋白和過氧化物酶體增殖物激活受體α的表達(dá)下調(diào)，增加三酰甘油聚集，抑制脂肪細(xì)胞分化。敲除miR-143可引起脂肪細(xì)胞中ERK5蛋白表達(dá)明顯升高，提示miR-143可能通過靶基因ERK5參與脂肪細(xì)胞分化。腹型肥胖胰島素抵抗小鼠腸系膜脂肪組織miR-143顯著升高，且miR-143表達(dá)水平與體質(zhì)量和腸系膜脂肪含量顯著正相關(guān)。脂肪細(xì)胞的分化過程中miR-17-92也顯著上調(diào)，可通過抑制腫瘤抑制因子Rb2/p130的表達(dá)加速脂肪細(xì)胞的分化。

He等[13]在GK大鼠骨骼肌的研究發(fā)現(xiàn)，2種miR-29家族成員miR-29a和miR-29b在糖尿病組升高，進(jìn)一步研究顯示，miR-29家族在所有的3個(gè)胰島素靶器官——肌肉、脂肪和肝臟都上調(diào)。在小鼠的脂肪細(xì)胞3T3-L1中過表達(dá)miR-29a/b/c可抑制胰島素刺激下葡萄糖的攝取。高水平的miR-29可在高糖高胰島素培養(yǎng)的細(xì)胞中模擬胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。以高糖高胰島素干預(yù)3T3-L1脂肪細(xì)胞可引起miR-29a/b升高，miR-29c不變。熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證實(shí)胰島素誘導(dǎo)基因 1（insulin induced gene 1，Insig1）和 Caveolin 2（Cav2）是miR-29a/b/c的靶基因。過表達(dá)miR-29可導(dǎo)致Insig1和Cav2水平的下降，顯著抑制胰島素刺激的葡萄糖攝取，促發(fā)胰島素抵抗，導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。

2.3.2 肝臟 非酒精性脂肪肝以肝臟脂肪聚積為特征，是胰島素抵抗重要的肝臟表現(xiàn)。與無代謝綜合征的患者相比，非酒精性脂肪肝患者血miR-122可下調(diào)63%。將針對(duì)miR-122的反義寡核苷酸注入小鼠體內(nèi)可導(dǎo)致血漿膽固醇和三酰甘油水平降低，進(jìn)一步將小鼠的肝細(xì)胞取出培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)肝臟脂肪酸和膽固醇合成減少，脂肪酸氧化增加，表明miR-122可調(diào)節(jié)小鼠的脂代謝[14]。同時(shí)，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）的活性也增加。在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)miR-122可導(dǎo)致包括類固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element-binding protein，SREBP）-1c/2、脂肪合成酶和3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶等幾乎所有脂肪形成的關(guān)鍵基因表達(dá)顯著下降。

Li等[15]亦以miRNA芯片的方法研究顯示，與正常對(duì)照組相比，ob/ob 小鼠肝臟中 8 種 miR（miR-34a、-31、-103、-107、-194、-335-5p、-221 和-200a）上調(diào)，3 種 miR（miR-29c、-451和-21）下調(diào)，提示這些miRNAs可能參與了肝臟中葡萄糖的代謝。進(jìn)一步研究顯示在肥胖小鼠肝臟或脂肪中過表達(dá)miR-103/107均可導(dǎo)致胰島素敏感性下降，miR-103/107的失活可增加其靶基因Caveolin 1的表達(dá)，伴有胰島素受體穩(wěn)定性的增加和脂肪體積的下降[16]。Godlewski等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中miR-451降低，其可通過靶向結(jié)合腫瘤抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶復(fù)合物的伴侶鈣結(jié)合蛋白39，抑制包括AMPK在內(nèi)的下游一系列蛋白激酶的活性。MiR-451的水平可隨血糖水平變化而變化，能量充裕時(shí)miR-451表達(dá)升高，可通過抑制AMPK信號(hào)途徑增加細(xì)胞增殖的速率。葡萄糖缺乏時(shí)，miR-451水平下調(diào)，激活A(yù)MPK，抑制細(xì)胞增殖速率，增加細(xì)胞存活和遷移。MiR-21通過激活PTEN依賴的P13K信號(hào)通路調(diào)節(jié)吉西他濱誘導(dǎo)的膽管癌細(xì)胞的凋亡；P13K是胰島素信號(hào)通路中的重要分子，推測(cè)miR-21可能通過作用于胰島素信號(hào)通路中的某些分子，參與對(duì)胰島素的釋放和調(diào)節(jié)作用。

胰島素受體底物 1（insulin receptor substate 1，IRS-1）是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要的成分。IRS-1基因敲除小鼠表現(xiàn)為體型小和胰島素抵抗。Ryu等[19]通過熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證實(shí)IRS-1是miR-126的直接靶基因，在轉(zhuǎn)染miR-126前體質(zhì)粒的SK-Hep1肝細(xì)胞中，miR-126過表達(dá)可使IRS-1表達(dá)降低75%并減少IRS-1磷酸化水平，但不影響其下游基因Akt2和GSK3b的表達(dá)。在胰島素刺激下，在減少IRS-1表達(dá)的同時(shí)，也可降低Akt2和GSK3b的表達(dá)，并且其降低是通過IRS-1直接作用的。

2.3.3 骨骼肌 Huang等[20]發(fā)現(xiàn)GK大鼠和對(duì)照組相比，骨骼肌miR-24顯著下調(diào)。熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證實(shí)miR-24可與代謝調(diào)節(jié)中的重要因子p38-MAPK 3′UTR特異位點(diǎn)結(jié)合，提示p38-MAPK是miR-24的直接靶基因，并且此結(jié)合位點(diǎn)在人、大鼠和小鼠中高度保守。

Granjon等[21]在志愿者中行高胰島素正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)前及3 h后骨骼肌活檢比較，有37種miRNAs下調(diào)，對(duì)應(yīng)基因編碼的蛋白主要參與胰島素信號(hào)傳導(dǎo)和泛素介導(dǎo)的蛋白水解，其中miR-1和miR-133a有明顯的改變，在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中得到同樣的結(jié)果；而正胰島素高葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)對(duì)志愿者骨骼肌的miR-1和miR-133a無明顯影響，提示胰島素水平而非葡萄糖濃度對(duì)miR-1和miR-133a發(fā)揮作用。胰島素可通過激活SREBP-1c下調(diào)肌細(xì)胞增強(qiáng)因子 （myocyte enhancer factor，MEF）-2C， 影響 miR-1 和miR-133a的表達(dá)；過表達(dá)SREBP-1c可下調(diào)miR-1和miR-133a的表達(dá)，而敲除SREBP-1c基因可增加胰島素刺激下miR-1和miR-133a的表達(dá)。以MEF-2C特異抗體與primiR-1-2和pri-miR-133a-1之間的增強(qiáng)子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，可顯著減少miR-1和miR-133a的表達(dá)，證實(shí)胰島素下調(diào)miR-1和miR-133a的表達(dá)是通過激活SREBP-1c下調(diào)MEF-2C實(shí)現(xiàn)的。

3 結(jié)論與展望

與轉(zhuǎn)錄因子相比，miRNAs的調(diào)控機(jī)制可能更能夠滿足生物體精密而協(xié)調(diào)的基因表達(dá)調(diào)控需要。更重要的是miRNAs的作用本身就是生物體內(nèi)天然存在的調(diào)控方式，因此如果能找到對(duì)胰島素抵抗和糖尿病調(diào)控的miRNAs，模擬天然miRNAs，人工構(gòu)建靶向miRNAs的前體或合成miRNAs反義寡核苷酸，必將對(duì)胰島素抵抗和糖尿病等代謝相關(guān)性疾病的治療提供一個(gè)新的藥物靶點(diǎn)。

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